美国国家科学院院刊。2005年10月18日；102(42): 15122–15127.
肌钙蛋白相关转录因子-B对鳃弓动脉重塑和平滑肌分化的需求
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Jiyeon噢
部门*分子生物学和†德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心病理学75390-9148
詹姆斯·理查德森
部门*分子生物学和†德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心病理学75390-9148
埃里克·N·奥尔森
部门*分子生物学和†德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心病理学75390-9148
部门*分子生物学和†德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心病理学75390-9148
Eric N.Olson撰稿，2005年8月31日
摘要
肌钙蛋白和肌钙蛋白相关转录因子（MRTFs）A和B作为血清反应因子的辅激活剂，在心血管发育中起关键作用。确定MRTF-B的功能体内，我们生成了MRTF-B型靶向灭活突变小鼠MRTF-B型基因。我们证明小鼠纯合子为MRTF-B型功能丧失突变在妊娠中期死于一系列心血管缺陷，包括鳃弓动脉、右心室双出口、室间隔缺损和薄壁心肌的异常模式。这些异常伴随着来自神经嵴的鳃弓动脉内平滑肌细胞分化失败。的表型MRTF-B型突变小鼠与缺乏心肌蛋白的小鼠不同，揭示了这些血清反应因子辅活化因子在不同亚群平滑肌细胞发育中的独特作用体内.
关键词：心血管发育、先天性心脏病、心脏、神经嵴
肌钙蛋白和肌钙蛋白相关转录因子（MRTFs）A和B组成一个协同激活子家族，为血清反应因子（SRF）提供转录活性（参考文献。1和2; 参考文献中进行了审查。三和4). SRF结合一个称为CArG盒的DNA序列，作为心肌蛋白和MRTF的对接位点(1,2). CArG盒是许多平滑肌、心肌和骨骼肌基因表达所必需的(5,6). 组织特异性缺失Srf公司这些肌细胞类型中的基因导致肌细胞分化严重异常(7–10).
心肌蛋白家族成员在与SRF相互作用的碱性和富含谷氨酰胺的区域具有同源性(1,2). 邻近的（支架附着因子，Acinus，PIAS）结构域与靶基因特异性有关，因此其缺失阻止了SRF靶基因子集的激活(1). 一个类似亮氨酸拉链的螺旋结构域介导心肌蛋白和MRTF的二聚化(11–13)并被提议允许CArG盒之间的协作(11). 肌球蛋白和MRTF的C末端区域起转录激活结构域的作用(1,2).
肌纤维蛋白和MRTF通过在DNA上与SRF形成三元复合物并提供其强大的转录激活域来增强SRF的转录活性(1,2). MRTF-A和-B还通过Rho GTPase和肌动蛋白细胞骨架调节的易位向SRF传递刺激信号(12,14–16).
心肌素的表达仅限于心脏和平滑肌细胞(1)而MRTF-A和MRTF-B在多种细胞类型中表达(2,17). 与肌钙蛋白作为平滑肌基因表达调节器的假设作用一致，肌钙蛋白敲除小鼠在胚胎第（E）10.5天死亡，但没有分化的平滑肌细胞（SMC）(18). 虽然显性负性心肌病突变体足以阻止心脏基因在爪蟾胚胎(1)，肌钙蛋白缺失小鼠胚胎不显示心脏缺陷(18). 小鼠纯合子lacZ公司增强子陷阱等位基因MRTF-B型显示围产儿死亡率(19)这被归因于血管发育异常(20). 然而，这lacZ公司插入有可能产生MRTF-B的显性阴性突变，预计会干扰其他心肌蛋白家族成员的功能。此外，由该等位基因产生的部分转录物编码野生型蛋白质，从而阻止确定真正的功能丧失表型(19).
明确确定MRTF-B的功能体内，我们创建了一个MRTF-B型胚胎干细胞中同源重组的突变等位基因MRTF-B型使鼠标无效。这些小鼠在E13.5和E14.5之间死亡，鳃弓动脉和心脏流出道的解剖结构出现严重缺陷，伴有平滑肌分化缺陷。我们得出结论，MRTF-B在血管平滑肌细胞特定亚群的发育中起着重要的早期作用。
方法
转染试验。如参考文献所述进行转染分析。11简单地说，用100 ng pcDNA表达质粒瞬时转染COS细胞，这些质粒编码野生型或突变型心肌蛋白、MRTF-A和MRTF-B以及SM22-荧光素酶报告子。48小时后，制备细胞提取物，并测定荧光素酶活性。
MRTF-B突变小鼠的产生。我们创建了一个MRTF-B型靶向载体，以删除该基因的第8外显子并引入lacZ公司和新霉素耐药性基因。将靶向载体电穿孔到129个SvEv衍生ES细胞中，并用G-418和1-（2′-脱氧-2′-氟-β-d日-阿拉伯呋喃糖基）-5-碘尿嘧啶。通过5′和3′探针的Southern杂交，分离出400个ES细胞克隆并进行同源重组分析。三个克隆有一个目标MRTF-B型将该基因用于胚泡注射，将产生的嵌合体雄性小鼠培育成C57BL/6雌性小鼠，以获得突变等位基因的生殖系传递。利用从尾部活检或胚胎卵黄囊中制备的基因组DNA通过PCR进行基因分型。
逆转录聚合酶链反应。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从E10.5胚胎的心脏中纯化总RNA。对于RT-PCR，总RNA被用作逆转录酶和随机六聚体引物的模板。可根据要求提供引物序列。
印度喷墨。在E11.5收集胚胎，并使用精细绘制的玻璃吸管将印度墨水注入心内。然后立即将胚胎在4%多聚甲醛中固定过夜，脱水，并在苯甲醇（苯甲酸苄酯）中清除。
组织学和免疫组织化学。按照参考文献所述进行组织学和LacZ染色。21对于免疫组化，石蜡切片脱蜡、复水，并用单克隆α-平滑肌（SM）肌动蛋白抗体（克隆1A4，Sigma）染色。
结果
MRTF-B lacZ插入等位基因的潜在显性负功能。我们的目标是分析体内MRTF-B通过创建MRTF-B型使鼠标无效。我们注意到随机插入aβ引起的突变-地理基因外显子10和11之间的盒MRTF-B型基因(20). 这个lacZ公司插入等位基因将产生一个在730氨基酸处截短的MRTF-B蛋白(). 基于先前的研究，我们预计该截短蛋白将作为显性阴性突变体(1,2,13,16). 在开始创建新的MRTF-B型突变后，我们检测了该突变蛋白在转染COS细胞中的功能。截断的MRTF-B蛋白（1-730）不能单独激活SRF-依赖性报告子（数据未显示）；然而，正如预期的那样，当转染相当数量的每个质粒时，它干扰了野生型心肌蛋白和MRTF-A蛋白的转录活性(). MRTF-B 1–730突变的显性负活性弱于先前描述的心肌蛋白突变蛋白（129–715）(1)可能是因为MRTF-B的N末端结构域导致细胞质中的部分隔离(12,16). 与野生型MRTF-B一样，1-730突变蛋白在约15%的转染COS细胞中显示出核定位。SV40核定位序列与该截短蛋白的氨基末端融合，以更紧密地反映SMCs中内源性MRTF-B蛋白的核定位，从而增强其显性负活性().
MRTF-B突变蛋白的转录活性。(A类)显示了野生型和突变型MRTF-B和心肌蛋白的结构。这个lacZ公司基因陷阱系(20)预计会生成一个截短的MRTF-B蛋白，其中包含残基1-730。我们引入到MRTF-B型据预测，该基因会产生一个含有1-270残基的截短的MRTF-B蛋白。心肌蛋白的显性阴性突变也显示出来。NTD，N端域；++，基本域；SAP，脚手架附着系数。Q、 富含谷氨酰胺结构域；LZ，亮氨酸拉链；TAD，转录激活结构域。(B类)将野生型和突变蛋白转染到COS细胞中，并分析其激活SM22-荧光素酶报告子的能力。还检测了氨基末端含有SV40核定位序列（NLS）的截断MRTF-B蛋白。MRTF-B 1–730突变体具有显性阴性功能，而1–270突变体缺乏抑制活性。
基于这些发现，我们担心lacZ公司插入等位基因可能会模糊MRTF-B潜在作用的解释体内此外，据报道，一小部分野生型转录物是由该等位基因通过剪接在lacZ公司插入(20). 因此，等位基因并不是真正的零位基因。
MRTF-B基因敲除小鼠的产生。创建小鼠功能丧失等位基因MRTF-B型基因，我们引入了lacZ公司ES细胞中同源重组基因第7外显子和第8外显子后的盒(). 这种突变导致截短的蛋白质仅包含MRTF-B的前270个氨基酸，并且缺少SRF-结合、二聚化和转录激活域。与lacZ公司插入等位基因，270-aa突变蛋白功能惰性().
生成和分析MRTF-B型击倒老鼠。(A类)基因靶向策略。小鼠MRTF-B蛋白如图所示。该靶向载体包含一个3.2kb的5′臂和一个4.7kb的3′臂，并用lacZ-neo盒替换了该基因的0.5kb区域。编码区内的内含子连接由图示蛋白质下方的箭头显示。外显子1-10显示在方框中，内含子的大小也显示出来。用于Southern分析的5′和3′探针的位置B类显示。用于基因分型的PCR引物的位置用水平箭头表示。(B类)南方分析。分别用XbaI和EcoRI消化ES细胞克隆的基因组DNA，并用5′和3′探针进行Southern blot分析。(C类)PCR分析。通过PCR分析E11.5胚胎的基因组DNA，引物如A类.(D类)用于RT-PCR的引物位置。外显子示意图MRTF-B型显示了用于RT-PCR的引物的基因和位置。预期突变将在外显子7和9之间包含lacZ-neo盒，并删除外显子8。(E类)使用从E10.5胚胎心脏分离的RNA进行RT-PCR，引物如D类胚胎的基因型显示在顶部。突变等位基因（2F-5R）产生的截短转录物的表达水平远低于WT MRTF-B转录物。(F类)RT-PCR是通过使用从E10.5胚胎的心脏中分离的RNA进行的，所述RNA具有针对肌球蛋白、MRTF-A和MRTF-B的特异性引物。检测GAPDH的转录物作为RNA负载和完整性的对照。(G公司)野生型和MRTF-B型E13.5和E14.5的突变胚。
突变体的种系传播MRTF-B型等位基因来自三个独立的ES细胞克隆。交叉路口MRTF-B型+/–同基因C57BL/6背景或混合背景的小鼠未能产生任何MRTF-B型在分析的100多个后代中，无后代。与观察到的结果相反MRTF-B型随机插入aβ产生突变小鼠-地理盒式磁带(20)，我们认为我们的纯合子MRTF-B型突变导致胚胎完全外显致死。
通过使用代表基因缺失区域内和周围外显子序列的引物对E10.5胚胎心脏的mRNA进行RT-PCR分析，证实了基因靶向事件(). 这些分析表明，外显子7剪接到lacZ公司预测的等位基因（引物7F和lacZR). 该PCR产物的测序证实，突变等位基因产生了一种蛋白质，其中MRTF-B的270氨基酸在lacZ下融合（数据未显示）。部分MRTF-B型转录本3′lacZ公司纯合突变胚胎中未检测到插入位点。There was no change in expression of心肌素或MRTF-A型在变异心脏中()表明这些基因没有上调以弥补MRTF-B的缺乏。
MRTF-B的早期胚胎致死率–/–老鼠。定时妊娠胎仔的基因分型显示E14.5后无纯合子突变(). 在E14.5，我们在分析的35个胚胎中仅观察到2个纯合子突变体，这一数字大大低于孟德尔遗传的预期。E13.5和E14.5的纯合突变胚胎显示心包水肿和广泛出血，表明血管异常导致胚胎死亡(以及未示出的数据）。在E12.5及更早的时候，纯合子突变体外观正常，大约以孟德尔比率出现。我们得出结论MRTF-B型该基因在E13.5和14.5之间导致完全致死。
表1。
子代的基因型MRTF-B型+/-交叉
| 基因型 | +/+ | +/- | -/- | 总计 |
|---|
| 第10页 | 33 | 61 | 0 | 94 |
| 图15.5-16.5 | 17 | 36 | 0 | 53 |
| 第14.5页 | 14 | 19 | 2 (6) | 35 |
| 图13.5 | 17 | 30 | 12 (20) | 59 |
| 图12.5 | 14 | 41 | 14 (20) | 69 |
| E9.5≈11.5 | 24 | 50 | 25 (25) | 99 |
靶向MRTF-B等位基因lacZ的表达。这个lacZ公司记者融入目标MRTF-B型等位基因以与野生型基因对应的模式表达。在E8.5，lacZ在腹侧神经管和发育中后脑的两个区域都有强烈的表达，之前的报道称这两个区域对应于菱形体3和5() (20). 在E9.5，在耳泡、心脏、背主动脉和鳃弓动脉1、2和3中也检测到lacZ表达(). 在E10.5，lacZ继续在上述结构以及纯合子突变胚胎的第一鳃弓和第三和第四鳃弓动脉中表达().
LacZ染色MRTF-B型突变胚胎。对胚胎进行lacZ表达染色。在E8.5，腹侧神经管和发育中的后脑中的两条不同的条纹（箭头）染色明显(A类). 在E9.5耳囊、心脏、背主动脉和鳃弓动脉1、2和3中观察到LacZ染色(B类和C类). 在E10.5，lacZ的表达变得更广泛，在第一鳃弓中高表达(D类). 如右侧和左侧视图所示，在MRTF-B突变胚胎的第三和第四弓动脉中也检测到LacZ的表达(E类和F类). 对弓支动脉进行编号。ba1，第一鳃弓；nt，神经管；ov，耳囊泡，h，心脏；da，背主动脉。
MRTF-B突变胚胎的心血管异常。因为MRTF-B型在发育中的心血管系统和有明显心血管死亡的妊娠中期死亡率中，我们通过将印度墨水注入E11.5胚胎跳动的心脏来检测突变胚胎的心血管系统。野生型胚胎的第三、第四和第六鳃弓动脉双侧明显完整，与之相反，突变胚胎的第六鳃盖弓动脉发育不良且狭窄，而第三和第四鳃弓血管正常().
印度墨水注射血管可视化。印度墨水注入野生型跳动的心脏(A类和C类)和MRTF-B型–/–胚胎(B类和D类)E11.5处。右边(A类和B类)和左边(C类和D类)每个胚胎的鳃弓动脉在侧视图中显示并编号。请注意，突变胚胎的右和左第六弓动脉均发育不良且过早退化(*).
通过E10.5和E11.5处鳃弓动脉的组织切片一致证实，与野生型相比，突变胚胎的第六鳃弓血管异常狭窄，过早退化。此外，在连续组织切片中，在E10.5突变胚胎中检测到第四和第六动脉之间的融合().
支弓动脉缺损MRTF-B型突变胚胎。(A类–C类)E10.5野生型和MRTF-B突变胚胎(A类)和E11.5(B类和C类). 苏木精/伊红切片显示突变胚胎中发育不良的第六弓动脉。E10.5处第四和第六动脉之间的通讯异常(*). SMα-actin染色的组织切片显示野生型胚胎鳃弓动脉和背主动脉壁内的平滑肌分化。相反，SMα-actin在突变胚胎的鳃弓动脉中未检测到表达，但在背主动脉和心脏中有表达。支弓动脉编号为3、4和6。da，背主动脉。(D类)鳃弓动脉示意图。胚胎的剖面如所示A类–C类用虚线表示。as，主动脉囊；lda，左背主动脉；右背主动脉。(E类)心脏横切面显示E13.5突变胚胎的室间隔不完整（箭头）和心肌壁薄。左心室；右心室。
连续组织学切片显示E13.5突变胚胎中存在大量鳃弓动脉缺陷。在几个突变胚胎中，通常来源于左侧第六弓动脉的动脉导管异常退化，无法连接到主动脉弓(). 肺干发育不全，可能是由于缺乏导管所致，但确实产生了投射到原始肺芽的肺动脉。在其他E13.5突变的胚胎中，动脉导管在右侧发育，并在气管后方进入降主动脉，反映出左第六弓动脉的异常退行伴随着右第六弓血管的异常持续存在(). 我们还观察到左第四弓动脉异常退行导致主动脉弓中断。在这些胚胎中，动脉导管与缺损远端的降主动脉相连(). 有趣的是，这种异常与双侧颈动脉的缺失有关，这是由于第三拱形动脉的异常模式。
鳃弓动脉缺损MRTF-B型突变胚胎。(A类–D类)E13.5突变胚胎大血管的缺陷。在野生型胚胎的横切面上，肺干通过动脉导管与降主动脉相通(A类). 突变胚胎显示发育不良的肺干（箭头），没有动脉导管(B类)，持续右侧动脉导管(C类)主动脉弓中断(D类). 注意动脉导管连接处降主动脉的异常形状和位置(*). a、 主动脉；at，中庭；d、 动脉导管；房车，右租金。(E类–H（H）)主动脉弓缺损示意图A类–D类。虚线表示正常回归。黑色区域表示异常回归，而蓝色区域表示异常持续。(E类)野生型胚胎鳃弓动脉的模式化，右第六动脉（-R6）正常退化。(F类)左第六动脉异常回退导致动脉导管缺失（-L6）。(G公司)左第六动脉（-L6）异常退行和右第六动脉异常持续（+R6）导致的持续右侧导管。(H（H）)由于左第四（-L4）动脉和右、左第三动脉（-R3、-L3）的异常回归，主动脉弓中断和两条颈动脉丢失。R3、R4和R6分别为右弓动脉3、4和6。左主动脉弓动脉分别为L3、L4和L6。
除了鳃弓动脉发育异常外，MRTF-B型突变胚胎在E12.5和E13.5处显示出大血管起源异常。在所有突变胚胎中观察到右心室双出口（数据未显示）。此外，还观察到高位室间隔缺损和薄壁心肌().
MRTF-B阴性胚胎中支弓动脉平滑肌细胞缺乏分化。考虑到心肌蛋白和MRTFs激活SMC基因表达的能力在体外(11,17,22–24)，我们预计MRTF-B型突变胚胎可能伴随SMC分化缺陷。事实上，SM-α-肌动蛋白表达的组织学切片的免疫染色显示，在E11.5突变胚胎的第三、第四和第六鳃弓动脉壁内的平滑肌分化明显减少(). 相反，SM-α-肌动蛋白在突变胚胎的背主动脉或心脏中的表达不受影响。因此MRTF-B型似乎特别破坏了鳃弓动脉内SMC的分化，在那里也观察到形态异常。
讨论
的表型MRTF-B型空白小鼠表明MRTF-B是早期心血管发育的专性调节因子。MRTF-B的缺失会导致鳃弓动脉和心脏流出道的致命畸形，以及心脏异常，并伴有SMCs特定亚群的分化失败。
MRTF-B突变胚胎的心血管异常。血管结构受MRTF-B型零突变源于神经嵴，神经嵴迁移到鳃弓，产生血管平滑肌细胞(25,26). 基于受影响的血管结构中缺乏α-SM肌动蛋白染色MRTF-B型突变胚胎，我们得出结论，MRTF-B是激活这些细胞中SMC分化程序所必需的，类似于心肌蛋白在其他SMC中的功能(18). 这些细胞分化受阻是否与鳃弓动脉的深层重塑缺陷有关或无关尚不清楚。
原则上，神经嵴衍生SMC分化失败可能反映出神经嵴细胞迁移异常、平滑肌前体细胞到达目的地后分化受阻或这些细胞凋亡增加。神经嵴细胞标记物Plexin A的表达在野生型和MRTF-B型突变胚胎，突变胚胎鳃弓内的凋亡也没有增加（数据未显示）。因此，我们得出结论，MRTF-B对鳃弓动脉中SMC的分化具有特异性控制作用。
许多小鼠突变体显示鳃弓动脉的模式缺陷(26)但这些缺陷直到出生才导致死亡。我们不确定为什么纯合子MRTF-B型突变导致胚胎死亡。这种早期死亡可能是由于缺乏动脉导管所致，动脉导管是心室和流出道间隔后胎儿生命所必需的。心肌薄也可能导致胚胎死亡。或者，MRTF-B可能在胚胎的其他部位（如肝脏）具有胚胎生存所需的功能。组织特异性缺失MRTF-B型将需要解决这些问题。
不同MRTF-B突变等位基因产生的表型。随着这项工作的完成，另一份报告(20)描述了由lacZ公司插入等位基因MRTF-B型与我们的结果相反，这表明截断的MRTF-B蛋白预计会由此产生lacZ公司插入等位基因表现为显性阴性突变体，该研究得出结论，突变体蛋白未能表现为显性负突变体。我们无法解释这两项研究结果之间的差异。然而，应该指出的是lacZ公司根据我们先前对心肌蛋白和MRTF功能的分析，插入等位基因包含二聚化和SRF相互作用域，因此有望具有显性负活性(1,2). 由该等位基因产生的野生型蛋白质水平低，也使对其表型的解释更加复杂(20). 尽管这两项研究都得出结论，MRTF-B是鳃弓动脉SMC分化所必需的，但这两种突变的致死时间以及心血管缺陷的严重程度和程度明显不同。很难知道这两个突变等位基因产生的不同表型是否反映了显性负蛋白的表达或野生型蛋白的漏表达lacZ公司插入等位基因或其他变量。
肌球蛋白家族成员可能参与人类先天性心脏病。心肌蛋白和MRTF-B在血管发育中的必要作用增加了这些基因突变或多态性可能导致人类流出道异常的可能性，而流出道异常是最常见的先天性心脏病之一(25–27). 尽管这些基因功能丧失突变杂合的小鼠没有表现出明显的表型，但心血管发育控制基因的杂合突变导致人类先天性心脏病并不罕见(28). 因此，心肌炎和MRTF是以血管异常为特征的先天性心脏病的罪魁祸首，值得认真考虑。
致谢
我们感谢王大志在本项目初始阶段提供的建议和帮助；Shelby Hacker和Hiromi Yanagisawa为印度油墨注射；Alisha Tizenor，用于图形；Jennifer Page提供编辑协助；以及维杜·加格（Vidu Garg）和朗达·巴赛尔·杜比（Rhonda Bassel-Duby）对这项工作的深刻评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）、唐纳德·雷诺兹临床心血管研究中心（Donald W.Reynolds Center for Clinical Cardiovascular Research）、肌营养不良协会（Muscular Dystrophy Association）。
笔记
作者贡献：J.O.、J.A.R.和E.N.O.设计的研究；J.O.和J.A.R.进行了研究；J.O.、J.A.R.和E.N.O.分析数据；J.O.、J.A.R.和E.N.O.撰写了这篇论文。
缩写：MRTF，心肌相关转录因子；SRF，血清反应因子；E类n个，胚胎期n个; 平滑肌细胞。
工具书类
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