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EMBO J。2001年11月15日；20(22): 6359–6370.
数字对象标识：10.1093/emboj/20.22.6359
PMCID公司：项目经理125717
PMID：11707407

Bfa1p–Bub2p检查点蛋白复合物的纺锤极体遗传和分离模式

吉斯琳·佩雷拉,田中富代,1中，2 金·纳斯迈思,1和埃尔玛·希贝尔三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

酵母纺锤极体（SPB）通过保守机制在每个细胞周期复制一次，从而产生一个预先存在的“旧”和一个新形成的SPB。酵母细胞的两个SPB功能不同。只有SPB迁移到子细胞芽中，该芽携带Bfa1p–Bub2p GTPase激活蛋白（GAP）复合物，是纺锤定位检查点的组成部分。我们研究了两个SPB的功能差异是否与其组装时间相关。我们描述说，在未受干扰的细胞中，“老”SPB总是迁移到芽中。然而，Bfa1p的定位并不是由SPB遗传决定的。正是细胞质微管与母皮层和芽皮层的差异性相互作用将Bfa1p–Bub2p GAP引导至芽大小的SPB。为了应对细胞质微管与细胞皮层相互作用的缺陷，Bfa1p–Bub2p复合物与两种SPB结合。这可能提供了一种机制，当细胞质微管无法定向纺锤时，可以延迟细胞周期的进展。因此，SPB能够感应细胞质微管特性并相应调节Bfa1p–Bub2p GAP。

关键词：Bfa1p–Bub2p/有丝分裂出口网络/纺锤体位置检查点/SPB遗传/Tem1p

介绍

中心体由一对中心粒组成，由参与微管形成的中心粒周围物质包围。以G为单位1在细胞周期的S期，细胞的单个中心体包含在前一个S期组装的子中心粒和在前一个细胞周期中形成的母中心粒。中心体的母子中心粒在生化、结构和功能上是不同的(潘特朗等., 1992;皮埃尔等., 2000,2001). 例如，动物细胞中胞质分裂的完成与母亲而不是女儿中心粒向胞质分裂位点的迁移相一致(皮埃尔等., 2001).

在芽殖酵母中，微管组织功能由纺锤极体（SPB）提供。SPB是一种多层结构，嵌入整个细胞周期的核膜中。与中心粒一样，SPB在每个细胞周期重复一次，而“新”SPB与先前存在的“旧”SPB相邻。SPB复制起始于半桥的远端，半桥是SPB中央层的单侧延伸，形成了一个名为卫星的前驱体。卫星在S阶段开始时成熟为一个新的SPB。“新”SPB通过扩展的半桥（现在称为桥）与“旧”SPB保持连接，该半桥在S相裂解。然后两个SPB分离，形成主轴的相反极(拜尔和戈奇，1975年).

直接进入芽的细胞质微管通过与芽皮层相关的Kar9p、Bim1p和Myo2p沿母体-芽轴定向纺锤体(海滩等., 2000;科里内克等., 2000;李等., 2000;普鲁恩等., 2000). 短纺锤体随后位于母细胞体内，其中一个SPB靠近芽颈，另一个则与母细胞的极相反。在后期开始时，细胞质动力蛋白为细胞核进入芽提供动力。Kar9p和dynein依赖性途径在某种程度上是多余的。一条通路的缺失会导致核迁移缺陷，而两者的缺失都是致命的(Miller和Rose，1998年;海尔·查普德林等., 2000;Farkasovsky和Künzel，2001年).

Bfa1p和Bub2p形成双组分GTP酶激活蛋白（GAP）复合物，该复合物是纺锤体位置检查点（SPC）的组成部分。SPC可能通过抑制GTPase Tem1p来阻止核迁移到芽中的延迟，从而防止过早的胞质分裂(巴丁等., 2000;佩雷拉等., 2000). 只有在后期迁移到芽中的SPB携带Bfa1p和Bub2p(佩雷拉等., 2000). 因此，这两种SPB在功能和生物化学上是不同的，这一特性在这里称为SPB极性。SPB极性对SPC调节很重要。当由芽向定向SPB组织的细胞质微管未能与芽颈相互作用时，SPC似乎变得不活跃(亚当斯等., 2001). 纺锤体极性的维持对染色体的准确分离也很重要(Miller和Rose，1998年).

SPB遗传描述了“旧”和“新”SPB在母细胞体和芽之间的分配模式旧的和新的SPB可能会在两个细胞体之间随机或优先分离。目前尚不清楚在芽殖酵母中SPB的遗传和极性是否相关，因为哺乳动物的中心粒就是这样(皮埃尔等., 2000,2001). 我们在这里描述SPB是以定义的方式继承的。“老”SPB会分裂成芽。细胞质微管的完整性确保了SPB的遗传。然而，尽管在未受干扰的细胞周期中，Bfa1p与“老”SPB定位，我们发现SPB遗传并不决定Bfa1p定位。当SPB遗传受到干扰时，Bfa1p仍然定位于进入芽的SPB，而不管它是“旧的”还是“新的”。我们的数据表明，Bfa1p相关的SPB由细胞质微管-皮层相互作用决定。当这些相互作用受到干扰时，Bfa1p–Bub2p GAP复合体与两个SPB关联。这种机制可能会延迟细胞周期的进展，以响应未对齐的纺锤。

结果

Spc42p–RFP作为“旧”SPB的标记

我们研究了“旧”和“新”SPB是优先还是随机分离到母细胞体或芽中。在本研究中，我们使用的细胞中，SPB核心成分Spc42p和Spc110p分别与红色（Spc42p-RFP）和绿色荧光蛋白（Spc110p-GFP）融合。SPC42–招标书SPC110–GFP表现为野生型细胞，Spc42p–RFP稳定表达（未显示），表明SPC42–招标书实现以下所有基本功能SPC42型令人惊讶的是，只有14%SPC42–招标书SPC110–GFP与绿色Spc110p–GFP相比，对数生长培养物中的细胞显示出一个点状的红色荧光SPB信号（图1A、，吨= 1). 我们假设酵母细胞的快速分裂和RFP分子的缓慢折叠特性(Baird等人，2000年)防止荧光活性Spc42p–RFP在SPB处积聚。如果是这样的话，G中的阻滞细胞0可能会给Spc42p的RFP足够的时间发展成为荧光物种。事实上SPC42–招标书SPC110–GFP在细胞停留4天后，SPB信号为红色的细胞从14%增加到90%（图1A） 以及SPB的相对荧光强度（图1B） ●●●●。静止时SPC42–招标书SPC110–GFP将细胞稀释到新鲜培养基中，复制SPB，但两个SPB中只有一个显示红色Spc42p–RFP信号（图1C、，吨=30）尽管两种SPB均含有Spc42p–RFP，但根据抗RFP抗体的间接免疫荧光判断（未显示）。对这一结果的一个可能解释是，新形成的“新”SPB主要包含新合成的无荧光活性的Spc42p–RFP分子，而“旧”SPB则携带有荧光活性的Spc42p-RFP分子。

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图1。由RFP信号标记的SPB分离到芽中。(A类和B类)Spc42p–RFP染色SPB的数量和相对荧光强度随着时间的推移而增加。的单元格SPC42–招标书SPC110–GFP用新鲜培养基稀释(吨= 0). （A） 1、2、3和4天后，细胞百分比(n个=50–100），SPB信号为红色，（B）SPB的相对荧光强度通过荧光显微镜测定。(C类)固定的SPC42–招标书SPC110–GFP将细胞稀释到新鲜培养基中。SPB分离后用延时显微镜观察。棒材，5µm。

我们使用Spc42p–RFP的这个属性来研究SPB继承，以标记“旧”SPB。SPB分离SPC42–招标书SPC110–GFP随后用延时显微镜观察细胞（图1C） ●●●●。在所有单元格中(n个=20）红色标记的SPB迁移到较小的细胞体，即芽（图1C、 60和90分钟），表明旧SPB由子细胞遗传。要获得更具代表性的图片，请使用静止SPC42–招标书SPC110–GFP将细胞稀释到新鲜培养基中，用荧光显微镜检查对数生长培养物。后期细胞的红色荧光SPB(n个>200）中97.8%位于芽中，仅2.2%位于母细胞中。这些结果表明SPC42–招标书SPC110–GFP细胞，RFP标记的SPB分离进入芽。

“老”SPB分裂成芽

光漂白后荧光恢复（FRAP）和瞬时表达SPC42型与青色荧光蛋白融合(SPC42–CFP). 对于FRAP实验，使用激光束对选定G中单个SPB的Spc42p–GFP进行光漂白1单元格（图2A、，吨=0分钟，中间两个单元格）。然后用延时显微镜观察细胞。当芽萌发时SPB复制，GFP信号恢复（图2A、，吨＝30分钟，箭头）。当SPB分离时，一个弱（图2A、，吨=50分钟，箭头），检测到一个强（星号）GFP信号。我们推断新的SPB是由强GFP信号标记的，因为从头开始合成和未漂白的细胞质Spc42p–GFP在复制期间并入该SPB。“老”SPB的GFP信号弱可以解释为Spc42p亚基的缓慢转换。后期，弱标记的SPB进入芽，而强标记的“新”SPB留在母细胞体内(吨=90分钟）。总共11 G1光漂白后观察时相细胞。在所有病例中，GFP信号较强的SPB在后期都停留在母细胞中。

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图2。“旧”SPB迁移到芽中。(A类)SPB遗传由FRAP确定。Spc42p–未叠置细胞中的GFP信号（用黑色箭头表示）被光漂白(吨=0）使用共焦显微镜。在指定时间拍摄荧光和微分干涉对比显微镜（DIC）图像。白色箭头标记Spc42p–GFP信号在30分钟后重新出现。强标记的“新”和弱标记的“旧”SPB（50–110分钟）分别用星号和箭头表示。(B类)选择性表达SPC42–CFP公司.Ga1S–SPC42–CFP SPC42-YFP公司在葡萄糖培养基中生长的细胞在G1带α因子。用棉籽糖培养基洗涤细胞，去除α-因子。添加半乳糖（2%）（GalS诱导）20分钟，然后添加4%葡萄糖（GalS抑制）。样品在1.5小时内每隔10分钟通过荧光显微镜进行分析。注意，YFP信号显示为红色，CFP信号显示为绿色。(C类)（B）的量化(n个= 120; 两个实验）。核酸是以说明性的形式加入的，因为它们在样品中没有染色。

在第二个实验中，SPC42–YFP公司细胞（染色体SPC42型融合到黄色荧光蛋白）携带SPC42–CFP在调节性GalS启动子（GalS–SPC42–CFP)在葡萄糖培养基中用α-因子抑制GalS表达。α因子相关的单个SPBSPC42–YFP公司高尔夫球–SPC42–CFP公司细胞仅显示Spc42p–YFP荧光（图2B、 顶部）。细胞周期块释放后，SPB复制时，GalS–SPC42–CFP公司表达很快被诱导。这确保了在大多数细胞中，仅将Spc42p–CFP选择性并入新形成的SPB（图2B、 底部和C）。自SPC42–YFP公司两种SPB均含有Spc42p–YFP。在61%的细胞中，只有新的SPB被CFP标记。该SPB留在母细胞体内（图2B和C）。在～15%的细胞中，两个SPB均显示Spc42p–CFP标记（图2C） ●●●●。将Spc42p–CFP并入“旧”SPB可能是由Spc42p层的延伸引起的(Bullitt等人，1997年). 缺乏CFP信号的细胞（24%）可能无法诱导GalS启动子（图2C） ●●●●。总之，这些实验表明，在野生型细胞中，“旧”SPB会分离到子细胞中。

细胞质微管的完整性确保了“老”SPB遗传到芽中

使用SPC42–招标书细胞，我们研究了是否需要微管来确保SPB的遗传。固定的SPC42–招标书SPC110–GFP将细胞稀释到含有α-因子的培养基中，用交配投影标记母细胞体。细胞从细胞周期阻滞释放到含有微管解聚药物诺卡唑的培养基中，导致纺锤体塌陷和有丝分裂阻滞(Jacobs等人，1988年; 图三A、 顶部）。当诺卡唑被移除时，微管重组，从而重建双极纺锤体。在这些细胞中，以RFP信号标记的“老”SPB与母细胞体分离的可能性几乎相同（图三A、 底部；箭头标记“旧”SPB）。总之，瞬时微管解聚破坏了“老”SPB对芽的遗传。

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图3。细胞质微管的持续存在确保了“旧的”SPB迁移到芽中。(A类)瞬时微管解聚破坏SPB遗传。α-因子同步SPC42–招标书SPC110–GFP细胞与诺卡唑孵育以解聚微管，导致纺锤体塌陷，两个SPB紧密相连。然后通过清洗去除诺卡唑。1小时后，对样品进行Spc42p–RFP和Spc110p–GFP荧光分析。所示百分比基于三个独立实验(n个>80). 箭头指向标有“旧”RFP的SPB。插图是顶部信号的放大。缩写：D，子细胞；M、 母细胞体。棒材，5µm。(B类)细胞质微管与细胞皮层的相互作用确保了“老”SPB分离到芽中。SPB遗传是在中确定的KAR9 SPC42–招标书 SPC110–绿色荧光粉和Δkar9 SPC42–招标书SPC110–GFP在30和37°C下释放α因子后的细胞(n个= 100; 两个实验）。

为了解决细胞质微管在SPB遗传中是否起作用，我们使用了Δkar9细胞。细胞核微管不受Δkar9而细胞质微管无法与芽细胞皮层相互作用，导致后期约10–20%的细胞同时具有位于母细胞体内的4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色区域。最终，细胞质微管通过一种替代的强啡肽依赖机制与芽皮层相互作用，该机制使纺锤体沿着母芽轴定向(Miller和Rose，1998年;Heil-Chapdelaine等人，2000年;Korinek等人，2000年;Lee等人，2000年;Farkasovsky和Künzel，2001年). 的单元格Δkar9 SPC42–招标书SPC110–GFP公司用α-因子阻遏，然后在30°C下释放。61%的细胞中后期细胞的“老”SPB分离到芽中（图三B） 约30%的细胞停留在母细胞体内，表明SPB遗传缺陷。在剩余的9%中，在母细胞中发现了两种SPB。37°C时，“老”SPB向母细胞的错配率增加到39%（野生型为2%）。总之，功能性细胞质微管是确保“老”SPB遗传到芽中所必需的。

Bfa1p SPB极性不由SPB遗传决定

Bfa1p总是与迁移到芽中的SPB相关联(Pereira等人，2000年)，表明它与“旧”SPB相关联。由于“旧”而非“新”SPB经历了至少一个细胞周期，在前一个细胞循环中对“旧”SPB的修改可能决定其与Bfa1p的优先关联。如果是这种情况，Bfa1p应始终与“旧”SPB关联，即使SPB继承受到干扰。为了验证这个假设，我们进行了如图所示的实验三A但现在正在使用BFA1–GFP SPC42–招标书细胞。BFA1–GFP SPC42–招标书首先用α-因子处理细胞，用交配投影标记母细胞体。然后将这些细胞用诺卡唑稀释到培养基中，解聚微管并将细胞阻滞在中期。如前所述(Pereira等人，2000年)nocodazole处理细胞的两个SPB都携带Bfa1p–GFP信号（图4，顶部）。当诺卡唑被移除时，纺锤体沿着母芽轴发生重组，最终在后期伸长为芽。此外，Bfa1p SPB极性被重新建立，因此在后期细胞中，Bfa1 p–GFP始终是(n个>100; 100%）与处于萌芽状态的SPB独立相关，无论是“旧”SPB还是“新”SPB（图4，底部；“旧”SPB由RFP信号标记）。对GAP的另一种成分Bub2p和受Bfa1p–Bub2p GAP调节的GTPase Tem1p（未显示）获得了相同的结果。我们的结论是，即使“老”SPB留在母细胞体内，Bfa1p也与预算定向SPB相关。

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图4。Bfa1p SPB极性不是由SPB遗传决定的。BFA1–GFP SPC42–招标书细胞与α-因子同步，释放到诺卡唑培养基中，然后洗去诺卡唑。通过荧光显微镜测定GFP和RFP信号(n个>100，两个独立实验）。DNA用DAPI染色。插图是信号的放大。缩写：D，子细胞；M、 母细胞。棒材，5µm。

微管而不是与芽或芽颈相关的因素决定了Bfa1p SPB的定位

与芽颈或芽相关的因素可能促进Bfa1p与芽导向SPB的结合。另一方面，从细胞皮层沿细胞质微管传递到SPB的信号可能决定Bfa1p与两个SPB之一的优先结合。为了区分这两种可能性，我们研究了SPB的细胞位置和细胞质微管功能是否影响Bfa1p SPB定位。

在esp1-1型细胞，整个细胞核迁移到芽中(McGrew等人，1992年). 为了测试芽或芽颈中的因素是否决定Bfa1p与SPB的结合，在esp1-1 BFA1–YFP SPC42–CFP公司细胞。我们发现98%的esp1-1型细胞，其中一个SPB位于芽颈部，另一个位于芽中（图5A、 顶部）或两个SPB都处于萌芽状态（图5A、 底部），只有最靠近芽尖的SPB携带Bfa1p–YFP信号。其中2%esp1-1型两种SPB均与Bfa1p–YFP相关（未显示）。事实上，布氏导向SPB在特别用途1-1两种SPB都在芽中的细胞反对与芽颈或芽相关的蛋白质稳定Bfa1p SPB定位的模型。

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图5。微管而非与芽颈或芽相关的因素是Bfa1p SPB极性的决定因素。(A类)Bfa1p SPB本地化esp1-1型细胞。的单元格esp1-1 BFA1–YFP SPC42–CFP公司通过α-因子阻断同步化，并在37°C下释放。图中所示为细胞的Bfa1p–YFP SPB定位，其中两个SPB都位于芽中。(B类)Bfa1p与被捕的预算导向SPB绑定Δcdc26细胞。α因子同步Δcdc26 BFA1–玻璃钢和Δcdc26 SPC42–绿色荧光粉将细胞移到37°C下3小时。然后添加诺卡唑1小时。荧光显微镜检测Spc42p-GFP和Bfa1p-GFP SPB定位。DNA用DAPI染色。(C类)诺卡唑洗脱后的Bfa1p SPB定位。α-因子同步BFA1–YFP SPC42–CFP（消防给水泵） CFP–管1细胞在30°C下与诺卡唑孵育2小时（第1行和第2行）。通过清洗细胞去除诺卡唑。随着时间的推移，跟踪SPB处的纺锤形成和Bfa1p–YFP（标记为Spc42p–CFP）（第3-9行）。(D类)（C）的量化。只统计纺锤体组装在母细胞体内的细胞。缩写：D，子细胞；M、 母细胞。棒材，5µm。

当细胞用诺卡唑处理时，Bfa1p针对两种SPB（图4). 诺卡唑治疗后，微管解聚，细胞在中期停滞，有丝分裂检查点被激活。因此，任何这些事件都可能将Bfa1p指向两个SPB。没有的单元格川东北26(Δcdc26)用于研究是什么调节Bfa1p SPB结合。Cdc26p是后发复合体的一个成分，在37°C时对后期的开始至关重要(Zachariae等人，1996年). 因此，Δcdc26细胞，像诺卡唑处理的细胞，在中期停滞。然而，与诺卡唑处理的细胞相比，Δcdc26细胞包含位于母芽颈部的短纺锤体。我们在被捕时发现Δcdc26只有预算导向的SPB细胞与Bfa1p–GFP相关（图5B、 比较Bfa1p–GFP信号与SPB标记物Spc42p–GFP）。然而，当Δcdc26（图5B） 或Δcdc26 Δ马达2用诺卡唑处理细胞（未显示），两种SPB均显示Bfa1p–GFP染色。这表明微管解聚而不是细胞周期阻滞或激活摩洛哥迪拉姆2-依赖性有丝分裂检查点将Bfa1p导向两个SPB。

在诺卡唑被洗脱后，Bfa1p-SPB极性重新建立后，分析了微管在调节Bfa1p SPB定位中的作用。在这个实验中，我们使用了BFA1–YFP SPC42–CFP（消防给水泵） CFP–管1细胞，其中核质微管用CFP–Tub1p标记，SPB用Spc42p–CFP标记。用诺卡唑处理α-因子同步化细胞。两种SPB均携带Bfa1p–YFP和Spc42p–CFP信号，未检测到核质微管（图5C、 第1行和第2行）。在～71%的细胞中，两个SPB位于母细胞体内（图5C、 而在29%的细胞中，两种SPB都位于芽中（图5C、 第2行），可能取决于哪一组细胞质微管首先解聚。去除诺卡唑后，SPB随着核纺锤体的重组而分离。此时，未观察到细胞质微管，Bfa1p定位于两种SPB（图5C、 第3行和第4行）。Bfa1p–YFP SPB极性随着细胞质微管的重组而变得明显，微管将纺锤体定位于母芽轴（图5C、 第5行和第6行）。在母细胞体内含有两个SPB的细胞中，最靠近芽颈的SPB与Bfa1p–YFP相关（图5C、 第5行）。然而，在含有SPB的细胞中，与芽颈相对的SPB携带Bfa1p–YFP信号（图5C、 第6行）。最终，纺锤体伸长，Bfa1p与芽中的SPB相关（图5C、 第7行）。总之，一旦细胞质微管将纺锤体定位于母芽轴，SPB极性就会重新建立。最靠近芽尖的SPB保留Bfa1p，与SPB在细胞内的位置无关。

更仔细地检查BFA1–YFP SPC42–CFP（消防给水泵） CFP–管1诺科达唑冲洗后的细胞显示，当细胞质微管先于细胞核微管组织时，Bfa1p仍然与两种SPB相关（图5C、 第8行和D行）。我们还观察到细胞核纺锤体错位的细胞与携带两个Bfa1p SPB信号的细胞质微管相关（图5C、 第9行和第D行）。在这两种类型的细胞中，两个细胞质微管束被导向同一个细胞体，这表明没有向SPB施加任何力。这表明不仅细胞质微管的存在，而且它们与细胞皮层的相互作用方式调节着Bfa1p的SPB关联。总之，细胞质-微管-皮层相互作用而非SPB的位置可能决定Bfa1p的SPB定位。

细胞质微管与细胞皮层的相互作用决定Bfa1p SPB的定位

使用Δkar9我们研究了细胞质微管与芽细胞皮层相互作用中的缺陷是否影响Bfa1p SPB定位。细胞质微管缺陷在Δkar9通过母体细胞中两个分离的DAPI染色区域的错位(Miller等人，1999年;Korinek等人，2000年;Lee等人，2000年). 我们确认了Δkar9 BFA1–YFP SPC42–CFP（消防给水泵）Bfa1p位于SPB的细胞，即使纺锤体在母细胞体内错位（图6A、 第1行）。然后对Bfa1p进行分析Δkar9 BFA1–玻璃钢DNA被DAPI染色的细胞。在具有两个DAPI染色区域的细胞中，Bfa1p–GFP与最靠近芽尖的SPB相关（图6A、 第2–4行和B行）。这与染色体是否已经分离到芽中无关（图6A、 第4行）或隔离过程中（图6A、 第2行和第3行）。只有在几个具有正确定位的DAPI区域的细胞中，两个SPB都携带Bfa1p（图6B） ●●●●。相反，在Δkar9当两个DAPI区域在母细胞体内错位时，两个SPB总是与Bfa1p–GFP信号相关（图6A、 行5和B）。这一结果表明，Bfa1p可能是针对细胞质微管与芽皮层相互作用失败的两种SPB。

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图6。细胞质微管与细胞皮层的相互作用决定了Bfa1p SPB的定位。(A类)细胞质微管-皮层相互作用影响Bfa1p SPB定位。Δkar9 BFA1–YFP SPC42–CFP（消防给水泵）和Δkar9 BFA1–玻璃钢用荧光显微镜分析细胞。DNA用DAPI染色。注意，CFP信号显示为绿色，YFP信号显示为红色(B类)（A）的量化(n个= 200). 仅对具有两个分离的DAPI染色区的细胞进行计数。(C类)Bfa1p的SPB定位依赖于功能性细胞质微管。α-因子同步SPC72 BFA1–GFP和spc72-7 BFA1–GFP公司细胞在37°C下培养1.5小时。通过间接免疫荧光观察微管。箭头标记细胞质微管。请注意，Bfa1p–GFP信号显示为红色，微管显示为绿色。棒材，5µm。

Spc72p将γ-微管蛋白复合物栓接到SPB的细胞质侧。温度敏感SPBspc72（ts）细胞经常不能组织细胞质微管，导致有或无细胞质微管细胞的混合群(Knop和Schiebel，1998年). 的单元格spc72-7 BFA1–GFP公司用于将细胞质微管缺陷与Bfa1p SPB关联关联。在spc72-7 BFA1–GFP公司母细胞体内纺锤体错位的细胞，细胞质微管未被检测到，Bfa1p与两种SPB相关（图6C、 第2行）。同样，在细胞中(n个=21）具有正确定位的后期纺锤体，但至少有一个细胞质微管束缺失，Bfa1p–GFP与两个SPB相关（图6C、 第3行），表明有缺陷的细胞质微管和Bfa1p与两种SPB的结合之间存在联系。为了支持这个概念，细胞(n个=23）具有正确定位的后期纺锤体和两个细胞质微管束，Bfa1p–GFP仅位于芽向SPB（图6C、 第4行），如在野生型细胞中观察到的（图6C、 第1行）。总之，这些数据表明了一种通过细胞质微管-皮层相互作用控制Bfa1p定位的机制。

讨论

基于Kar1p–LacZ融合蛋白与野生型细胞中迁移到芽中的SPB以及野生型细胞中“新的”但有缺陷的SPB的结合ndc1-1型有人认为新的SPB会分裂成芽(Vallen等人，1992年). 然而，由于Kar1p–LacZ蛋白无功能且过多产生，SPB复制在ndc1-1型细胞，这些实验很难评估。

在这里，我们通过三种不同的方法表明，SPB有一个定义的继承模式（图1和​和2）。2). 在98%的酵母细胞中，发现“老”SPB依赖功能性细胞质微管迁移到芽中（图1–三). 以G为单位1–细胞周期的S期，细胞质微管起源于复制SPB之间的桥梁，并直接进入生长芽(拜尔和戈奇，1975年). 可能只有通过与“旧”SPB相关联的桥相关细胞质微管才能确保“老”SPB分离到芽中。对该模型的支持来自Tub1p–RFP信号的优先分离，标记已经组装好的微管，SPB迁移到芽中，而母细胞中的SPB与新组装的非荧光微管相关（G.Pereira，未发表的数据）。我们认为桥的细胞质微管在S期移向“老”SPB的细胞质侧。这种运动可能是由γ-微管蛋白复合结合蛋白Spc72p从桥到SPB细胞质侧的定向重新定域所驱动的(Pereira等人，1999年). “新”SPB处的细胞质微管可能形成从头开始SPB分离后(Segal等人，2000年).

Spc42p–RFP分子标记“旧”SPB的特性现在允许更详细地研究“新”和“旧”SPSB的特征。例如，有证据表明，姐妹染色单体在缺乏凝集素Scc1p或类极光激酶突变体的情况下附着IPL1级优先于一个主轴极(Biggins等人，1999年;Tanaka等人，2000年)提出了对“旧”或“新”SPB是否具有优先约束的问题。

有丝分裂出口网络（MEN）是一个GTPase驱动的信号转导级联，控制细胞周期素依赖性激酶的失活，从而控制后期细胞分裂的时间。Bfa1p–Bub2p GAP复合物是SPC的一部分，它抑制MEN，直到细胞核迁移到芽中，使胞质分裂依赖于成功的染色体分离(巴丁等., 2000;佩雷拉等., 2000). SPC和MEN成分与酵母SPB相关的事实表明，SPB参与调节晚期有丝分裂事件，包括胞质分裂。此外，在动物细胞中，中心粒具有调节胞质分裂的功能。胞质分裂的完成与母亲中心粒向胞质分裂位点的迁移相一致，可能是通过其稳定结合微管的能力(馅饼等., 2000,2001). 因此，似乎子中心粒必须经历一个完整的细胞周期，才能成熟为能够调节胞质分裂的形式。相反，酵母中Bfa1p–Bub2p复合物的极性SPB定位不取决于SPB的年龄（图4). 相反，Bfa1p–Bub2p GAP的SPB定位依赖于细胞质微管-皮层相互作用，使纺锤体沿着母芽轴定位（图5和​和6）。6). 我们认为，细胞质微管与母细胞和芽皮层的差异性相互作用决定了Bfa1p–Bub2p GAP与SPB的关联。事实上，芽定向SPB在后期通过细胞质微管传递的力迁移到芽中，而其他SPB留在母细胞中(Miller和Rose，1998年;海尔·查普德林等., 2000;Farkasovsky和Künzel，2001年)表明两种细胞质微管组不同。它们不同的属性可能会以不同的方式调节SPB，在一个SPB上保留Bfa1p–Bub2p GAP复合体，但阻止其与另一个SPP结合（图5和​和6）。6). 在这方面，有趣的是，Bfa1p–Bub2p GAP复合物与核心SPB蛋白Nud1p结合，Nud1p也具有细胞质微管组织功能(格鲁内贝格等., 2000). 细胞质微管可能调节Nud1p，从而使Bfa1p–Bub2p结合。

如果细胞质微管与细胞皮层的结合受到干扰，Bfa1p与两种SPB相关，如Δkar9和spc72-7型单元格（图5和​和6），6)，或当微管通过诺卡唑处理细胞而完全解聚时（图5C和D）。很可能只有SPB-相关的Bfa1p–Bub2p GAP复合物能够抑制MEN(Bardin等人，2000年;Pereira等人，2000年;Adames等人，2001年). 因此，针对微管缺陷，将Bfa1p和Bub2p从细胞质池导向两个SPB将增加活性Bfa1p-Bub2p GAP复合物的数量，从而更有效地阻止细胞周期进展。这与诺卡唑处理的细胞中，被Bfa1p–Bub2p GAP复合物抑制的GTPase Tem1p与依赖Bub2p的两种SPB相关的观察结果一致(Pereira等人，2000年). 此外，有证据表明，用诺卡唑处理中期阻滞的细胞时，Bfa1p–Bub2p活性增加(Fesquet等人，1999年). 最后，当细胞质微管恢复其功能并开始将纺锤体对准母芽轴时，Bfa1p从留在母细胞体内的SPB中释放出来（图6). Bfa1p SPB极性的重组对后期MEN的正常功能可能很重要，因为该通路的许多成分以极性方式定位在细胞内(Bardin等人，2000年;Pereira等人，2000年;Menssen等人，2001年).

错位的纺锤体也会延迟哺乳动物和葡萄裂殖酵母单元格(O'Connell和Wang，2000年;Gachet等人，2001年)，指出这些生物体中心体或SPB的细胞周期调节器的类似控制。延迟胞质分裂以应对错位的纺锤体，将确保准确的染色体分离，并防止染色体不稳定的有害后果，染色体不稳定与许多类型的癌细胞有关。基于中心体的检查点也可以解释中心体异常与癌症之间的联系(马克思，2001).

材料和方法

质粒、酵母菌株和生长条件

表中描述了本研究中使用的菌株和质粒我通过PCR扩增质粒DSRed1（Clontech）的RFP，构建了用于标记基因的RFP–KanMX6盒。然后将RFP子克隆到pYM12中(Knop等人，1999年). CFP（来自T.Davis）、GFP(Knop等人，1999年)PCR扩增RFP和YFP盒（来自T.Davis），并按照所述构建和评估菌株(Knop等人，1999年). 这个URA3公司-基于CFP–管1描述了整合质粒(Jensen等人，2001年). 女孩们——SPC42–CFP通过克隆构建质粒SPC42–CFP公司转化为p416–GalS(Mumberg等人，1995年). 为了将酵母细胞固定在固定相，细胞在23°C的YPAD培养基中培养3-5天。实验开始前，让细胞在新鲜培养基中恢复2小时。使用合成α因子（10µg/ml）将g1微管用15µg/ml诺卡唑解聚。

表一。

酵母菌株和质粒
姓名基因型，结构来源或参考
酵母菌株  
 ESM356-1系列MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200本研究
 ESM616系列MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–GFP-KanMX6本研究
 ESM1431MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 BFA1–GFP-His3MX6本研究
 艾司1505MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 Δcdc26:：klTRP BFA1–GFP-His3MX6本研究
 艾司1508MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1个spc72-7 BFA1–GFP-His3MX6本研究
 欧洲标准1509MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1:：pSM784Δcdc26:：klTRP本研究
 欧洲标准1596MATa ura3-52 leu2Δ1:：pSM976 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–RFP-KanMX6本研究
 欧洲标准1597MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–RFP-KanMX6 SPC110–GFP-klTRPΔ卡尔9：：His3MX6本研究
 欧洲标准1598MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–YFP-His3MX6 pSM1024本研究
 ESM1611型MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1:：pSM976Δkar9:：klTRP本研究
 GPY499MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–RFP-KanMX6 SPC110–GFP-klTRP本研究
 GPY572型MATa ura3-52:：pCFP-TUB1 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 SPC42–CFP-KanMX6 BFA1–YFP-His3MX6本研究
 通用币598MATa esp1-1 ura3 leu2 lys2 trp1 ade2 BFA1–YFP-His3MX6 SPC42：：pXHO144本研究
 GPY599MATa ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 BFA1–YFP-His3MX6 SPC42–CFP-KanMX6Δkar9:：klTRP本研究
 YPH499型MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1Sikorski和Hieter（1989）
质粒  
 第416页-加仑pRS416包含加仑发起人芒伯格等. (1995)
 pCFP-管1pRS306携带CFP–管1延森等. (2001)
 第304页TRP1号机组-基于酵母整合载体Sikorski和Hieter（1989）
 第305页LEU2级-基于酵母整合载体Sikorski和Hieter（1989）
 第SM784页pRS305携带SPC42–GFP本研究
 第SM976页pRS305包含BFA1–玻璃钢本研究
 pSM1024型p416-GalS携带SPC42–CFP本研究
 pXHO144页pRS304携带第42页（密码子194–363）融合到CFP公司他等. (2000)

时间推移观察、FRAP、间接免疫荧光和荧光显微镜

对于延时显微镜，静止SPC42–招标书SPC110–GFP将细胞安装在具有25%明胶垫的载玻片上，所述明胶垫含有完全合成培养基和2%葡萄糖。对于FRAP实验，G的Spc42p–GFP信号1用激光（488nm）和共聚焦显微镜（蔡司LSM510）对细胞进行光漂白。在每个时间点，从12个Z截面（每个间隔0.3µm）收集GFP图像，通过获取每个像素处的最大信号将其转换为单个二维图像(Tanaka等人，2000年). 使用标准方案进行间接免疫荧光(Pereira等人，2000年). 用多聚甲醛固定细胞后，用荧光显微镜分析CFP-、GFP-、RFP-和YFP-标记的细胞(Pereira等人，2000年). DNA用DAPI染色。使用NIH图像程序测量RFP标记SPB的相对荧光强度，作为SPB处最大荧光与SPB附近背景荧光之间的差异。

鸣谢

我们特别感谢K.Paiha和P.Steinlein在延时显微镜方面的帮助。我们还感谢T.Davis和S.Jensen提供的质粒。我们感谢C.Manson阅读了这份手稿。E.S.的工作得到癌症研究运动和人类前沿科学计划组织的支持，T.U.T.和K.N.的工作得到威康信托和人类前沿科技计划组织的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团