谷氨酸能突触高频刺激后BDNF的突触分泌

K突触释放BDNF–GFP⁺-诱导去极化

用高K研究BDNF–GFP突触释放的基本特性⁺（50 mM）-和我-谷氨酸（300µM）在生理盐水（2 mM Ca）中诱导去极化²⁺，1 mM镁²⁺)激发有效钙²⁺谷氨酸受体的激活。细胞用细胞外溶液的层流射流连续超离心(莱斯曼和迪策尔，1995年)和平均荧光强度（相对于溶液变化时间，t吨=0）的突触BDNF–GFP囊泡簇（图三A） 绘制了与时间的关系图。K的应用⁺/谷氨酸（K⁺/Glu）溶液（图三B） 诱导荧光强度逐渐降低，在溶液交换后的前2min内变得明显。使用300±24 s的时间常数，通过单指数函数获得荧光减弱时间过程的最佳拟合（图三C、 90簇17个细胞），K后10分钟⁺/施用谷氨酸后，荧光强度已降至59±2%，与用药前的数值相比(t吨= 0). 该值有显著差异(第页<0.0001），从未刺激的对照细胞（7个细胞组成的33簇）的83±2%剩余荧光强度计算。

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图3。监测去极化诱导的BDNF-GFP突触分泌，作为荧光强度的降低。(A类)BDNF–GFP（绿色）与FM 4-64（红色）的突触共定位（黄色）。单色图像显示所示时间点的原始BDNF–GFP荧光。比例尺：5µm。(B类)相对变化（标准化为t吨=0，刺激开始），在应用50 mM K时，（A）中标记的彩色编码感兴趣区域的平均BDNF–GFP荧光强度⁺和300µM我-生理盐水中的谷氨酸（2 mM Ca²⁺，1 mM镁²⁺). 虚线是根据在5分钟对照溶液中观察到的光漂白推断出来的（参见材料和方法）。(C类)如图所示，使用不同刺激溶液的BDNF-GFP簇平均荧光降低的时间进程。所有溶液均含有2 mM Ca²⁺和1mM镁²⁺.数字图书馆-将APV（200μM）、DNQX（20μM）和LY 341495（100μM）添加到一组细胞中，以抑制离子型和代谢型谷氨酸受体。破伤风毒素：在记录之前，将表达BDNF–GFP的神经元与破伤风毒预先孵育（1 nM，20 h）。星号表示“控制”和“K”之间显著差异的起点⁺/glu'在第页-指示的液位。(D类)在缺乏细胞外钙的情况下，BDNF-GFP的释放被阻断²⁺并用镍抑制VGCC²⁺（100µM）和镉²⁺（100µM）。如图所示，不同细胞组BDNF-GFP簇荧光强度的平均变化。镁²⁺除‘K’外，浓度为1mM⁺/Glu/0钙²⁺'（3 mM镁²⁺). 星号代表K之间显著差异的起点⁺/葡萄糖±2 mM钙²⁺在第页-指示的液位。通过减去阴性对照组（0 mM Ca）的荧光减少量，对所有微量进行光漂白校正²⁺，3 mM镁²⁺，5 mM EGTA）。

为了将荧光降低与分泌囊泡释放BDNF–GFP直接联系起来，我们用破伤风毒素预先培养细胞，该毒素专门阻断了传质囊泡和分泌颗粒与质膜的融合（参见示例Ahnert-Hilger和Bigalke，1995年). 破伤风毒素（1 nM）预处理完全消除了K⁺/谷氨酸诱导的荧光减少（图三C类；剩余荧光强度87±2%，n个=8个细胞），强烈表明在没有破伤风毒素的情况下观察到的荧光降低反映了BDNF–GFP从分泌囊泡释放到细胞外介质中。我们刺激培养物上清液（50 mM KCl，40 min）中BDNF-GFP免疫反应性的检测证实了这一解释：在钙存在的情况下，BDNF-GPP的水平为5.8±0.8 pg/ml²⁺与无钙时3.3±1.3 pg/ml相比²⁺（显著不同，第页<0.05,n个=5个独立实验）。综上所述，这些结果表明，观察到的刺激诱导的荧光减少确实反映了分泌囊泡释放BDNF-GFP。

为了提供更多证据证明BDNF-GFP荧光的丧失并非由于质膜的兴奋毒性损伤所致，使用碘化丙啶排除试验测定细胞活力（见材料和方法）。在K的10分钟后⁺/谷氨酸刺激，99±6%的神经元排除了染料，而缓冲处理对照组为93±4%（与第页>0.15). 同样，即使去极化10分钟后24小时，神经元存活率也不受影响（未显示）。这些结果排除了BDNF-GFP荧光下降是由于膜完整性丧失的可能性。

为了确定引发释放的最低要求，我们通过高K值去极化神经元⁺单独使用（50mM，不添加谷氨酸）。这种模式与K模式一样有效⁺/谷氨酸刺激释放BDNF–GFP（图三C、 荧光降低到61±3%，n个=四个单元中的15个簇）。排除额外谷氨酸受体激活的可能性（高钾时内源性释放谷氨酸仍可能发生⁺应用）有助于诱导BDNF–GFP的释放，我们用K刺激释放⁺/NMDA受体拮抗剂存在下的谷氨酸[200µMd日,我-2-氨基磷新戊酸（APV）]、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸（AMPA）受体[20µM 6,7-二硝基喹啉-2,3-二酮（DNQX）]和代谢型谷氨酸受体I–III型（100µM LY 341495；Bortolotto等人，1999年). 该治疗既没有改变BDNF–GFP分泌的动力学也没有改变其范围（荧光降低到64±2%，6个细胞，30个簇；图三C） ，表明在一般K⁺-诱导的去极化，谷氨酸受体的额外激活（例如作为辅助因子）对于释放BDNF–GFP是不必要的。

通常认为去极化诱导的小泡释放取决于钙的进入²⁺从细胞外空间(Lim等人，1990年;托马斯等人，1990年)而细胞外钙的作用²⁺神经营养素的释放尚不清楚（参见示例Blöchl和Thoenen，1995年;Goodmann等人，1996年). 因此，我们研究了在缺乏细胞外钙的情况下BDNF-GFP的释放是否受到抑制²⁺（0 mM钙²⁺，3 mM镁²⁺，5 mM EGTA；n个=10个细胞）或存在电压门控钙抑制剂²⁺通道（VGCC；100µM Cd²⁺，100µM镍²⁺单位：2 mM Ca²⁺，1 mM镁²⁺;n个=8个单元格）。两种治疗都完全阻断了BDNF-GFP的释放，刺激10分钟后剩余的荧光水平与未刺激的对照组没有区别（图​（图3D）。三D） ●●●●。这种对细胞外钙的依赖²⁺在一系列实验中得到了进一步的支持(n个=3个细胞），在没有或存在细胞外钙的情况下连续刺激单个细胞²⁺仅当Ca²⁺可用（数据未显示）。这个Ca²⁺依赖性不是一种简单反映对Ca需求的间接效应²⁺-依赖性谷氨酸释放（随后启动BDNF分泌），因为K⁺/谷氨酸诱导的BDNF-GFP释放并不依赖谷氨酸受体刺激（见上文）。因此，Ca²⁺流入直接涉及BDNF释放过程本身（参见图6). 因为这种对细胞外钙的严格依赖²⁺，我们没有进一步调查钙的可能额外贡献²⁺从细胞内储存释放。

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图6。通过不同的突触后去极化途径分泌BDNF-GFP。破伤风突触前刺激通过中间重复的谷氨酸释放导致突触后去极化和钙²⁺流入（红色路线）。这种去极化可以被离子型谷氨酸受体拮抗剂阻断（见图5). 相反，高K⁺溶液直接使突触后膜（蓝色路径）去极化，激活VGCC，从而绕过中间谷氨酸释放和突触后谷氨酸受体的激活（见图三). 阻断Ca对BDNF释放的抑制作用²⁺流入（0 Ca²⁺; 镍²⁺/镉²⁺)以及BDNF从谷氨酸受体释放的独立性（在高钾刺激期间⁺)证明BDNF分泌直接依赖于突触后的钙²⁺大量涌入。同样，由于K⁺-诱导的突触后去极化不依赖于谷氨酸释放，抑制高钾⁺-破伤风毒素诱导的BDNF分泌表明，BDNF的分泌依赖于分泌囊泡的融合。

为了检查BDNF-GFP的释放是否局限于突触部位，我们进行了一系列实验，分别比较了同一细胞中突触和突触外簇（与FM 4-64缺乏共同定位）BDNF-GPP的释放。如图所示4，用K去极化⁺/Glu也能从所有被研究细胞的突触外部位有效释放BDNF-GFP(n个= 6). 由于囊泡轴突的释放仅限于活动的突触前终末（因此FM 4-64标记），突触前末梢明显缺乏这些突触外BDNF–GFP簇（参见图中黄色标记的区域4A） ，这种突触外释放提供了额外的证据，证明我们观察到的BDNF–GFP分泌是从树突进行的。

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图4。同时从突触后和突触外树突位置释放BDNF-GFP。(A类)BDNF–GFP荧光（左）、突触前终末的FM 4-64标记（中）和从转染神经元的树突分支获得的合并图像（右）。突触（蓝色）和突触外（黄色）BDNF–GFP囊泡簇有标记。比例尺：5µm。(B类)K刺激后荧光减弱的时间进程⁺/（A）中显示的彩色编码区的Glu显示了突触和突触外簇释放BDNF–GFP的程度相当。由于囊泡轴突的释放仅限于突触前终末，而突触前终末在突触外BDNF–GFP簇（以黄色标记）中不存在，因此释放一定发生在树突中。

转染

在7–9 DIV处用Ca²⁺磷酸盐沉淀法豪本萨克等. (1998)细胞在转染后3-5天（11-14 DIV）用于实验，此时成熟的谷氨酸能突触已经形成(莱斯曼和休曼，1998年). 为了检查BDNF-GFP的囊泡释放，在记录之前，将转染细胞与1 nM破伤风毒素（G.Ahnert-Hilger的礼物）在培养基中培养20小时。通过突触前终末缺乏FM4-64染色来判断囊泡释放的成功阻断。

荧光成像

将带有转染细胞的盖玻片转移到带对开底的Petriperm培养皿（Heraeus）中。通过倒置荧光显微镜（Olympus IX 70）的高孔径油浸物镜（40×，n.a.1.0；100×，n.a.1.35）检查细胞。GFP荧光通过窄激发（450–490 nm）和发射（二色镜：495 nm；500–550 nm）带通滤波器检测。红色Cy3、FM 4-64和碘化丙啶荧光分别用定制的滤光片组检测（激发：530-550 nm；二色镜：570 nm；发射：590-650 nm）。探头的照明仅限于图像采集，并由电子快门设备（Uni-Blitz）控制。照片由数字CCD相机拍摄（Sensys 1401E；光度学）。以10s的间隔采集时间推移图像。使用MetaView软件（Universal Imaging）进行数据分析。在延时记录中，对人工调整的感兴趣区域中的荧光强度（负背景）进行分析，并将相应的平均荧光强度标准化到刺激开始时(t吨在图形中=0）。由于单个细胞之间BDNF-GFP表达水平的差异，光照强度和曝光时间因细胞而异，导致控制期内出现不同程度的光漂白。曲线图中插入了一条趋势线，该趋势线外推了每次记录开始时对照液滴注5分钟期间的荧光变化，并给出了因光漂白导致的荧光降低的估计值。在这5分钟的对照灌注期间，来自光漂白>20%的细胞的时间推移数据被丢弃。所有实验均在室温（22°C）下进行。错误表示SEM（来自不同单元格的汇总数据）或SD（来自同一单元格的数据）。使用未配对学生的t吨-测试。

超融合系统和FM染色

在释放实验中，细胞被重力驱动的层流局部超流系统持续超流(莱斯曼和迪策尔，1995年)，允许在10秒内完全交换连续应用的解决方案。标准细胞外液（ECS）含有100 mM NaCl、4 mM KCl、20 mM HEPES、2 mM CaCl₂，1 mM氯化镁₂，10 mM葡萄糖，0.01 mM甘氨酸，pH值7.3。对于高K⁺-诱导去极化，46 mM KCl被等量的NaCl取代。在一些实验中，二价阳离子的浓度更改为0 mM Ca²⁺，3 mM镁²⁺（包括5 mM EGTA）以最小化Ca²⁺大量涌入。如有指示，向ECS中添加20µM DNQX、200µM APV或100µM LY 341495，以分别抑制AMPA、NMDA和代谢型谷氨酸受体（I–III类）。抑制电压门控钙²⁺通道，100µM Ni²⁺和100µM Cd²⁺在一些实验中添加到ECS中。用高钾条件下10µM FM 4-64对40 s激发的细胞标记活突触前终末⁺（50 mM）ECS，然后在0 Ca中进行广泛清洗²⁺云服务器。

电刺激

为了释放BDNF–GFP和FM 4-64，使用一个大直径（10µm）的玻璃移液管进行电突触刺激，移液管内充满ECS并连接到细胞外刺激器(莱斯曼和休曼，1998年). 以50 Hz的频率施加一秒钟的方形脉冲（-40至-80 V，持续2 ms）。这种范式可靠地诱导了附近细胞的动作电位，正如FM 4-64标记的突触前终末的去训练所证明的那样，该终末在1µM河豚毒素（TTX）的存在下被阻断。使用这种方法，在所有破伤风诱导的BDNF-GFP释放实验之前，立即检查突触前刺激是否成功。

细胞活力

用K刺激转染神经元10分钟⁺/Glu溶液，并与2.5µg/ml碘化丙啶（分子探针）在ECS中孵育（30分钟，37°C）。活细胞排除了DNA染料，而坏死和凋亡细胞则显示出红色荧光细胞核(Ankarcrona等人，1995年). 确定存活神经元的数量n个=三个独立实验中的30个微培养岛（5–20个神经元/岛），并与缓冲处理对照组（10分钟ECS，不含K⁺/Glu）和未经处理的对照组（留在培养基中直到染色）。细胞存活率是相对于未经治疗的对照组的存活率。

免疫细胞化学

使用标准程序固定BDNF-GFP转染海马神经元的盖玻片（磷酸盐缓冲盐水中4%甲醛）并渗透（0.1%Triton X-100）。将单克隆突触蛋白I抗体（1:400；由L.DeGennaro善意提供）、PSD95抗体（1:200；Calbiochem）、MAP2抗体（1:2000；Sigma）和GAD65抗体（1:20000；BioTrend）在室温下培养1 h，然后用Cy3-偶联抗鼠二级抗体（1:1000；Sigram）培养（RT，1 h）。为了重新定位细胞进行连续的FM 4-64和MAP2染色，将神经元培养在Cellocate盖玻片（Eppendorf）上。树突中BDNF–GFP荧光的百分比是通过BDNF-GFP荧光叠加（不包括胞体）和细胞各自的MAP2染色计算的。树突丝状伪足是通过它们从初级树突中规则出现和在<50µm后突然终止来判断的（见图1A） ●●●●。