将蛋白质分类为多泡体：泛素依赖性和非依赖性靶向

内囊泡蛋白质的鉴定

放大纯化程序，用SDS-PAGE分离不同组分中的蛋白质（图2B） 。P500组分中富集的条带通过胰蛋白酶肽的质谱鉴定。除了用作标记物的Pep12嵌合体外，还鉴定出可能存在于内囊泡中的其他五种蛋白质：Cps1p、Phm5p、Lap4p、Ylr205p和Yjl151p（图三). Phm5p仅在一种制剂中发现，可能是因为其合成取决于生长条件（见下文），但其他制剂至少各发现两次。还鉴定了P500组分中的许多其他蛋白质，发现它们是丰富的细胞溶质或质膜蛋白质（见图图例2详细信息）。目前尚不清楚这些是否只是污染物，或者其中一些是否部分存在于液泡中，但我们没有进一步研究它们。

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图3。蛋白质通过内体传递到液泡内部。在内部囊泡中鉴定的四种蛋白质的GFP标记版本在指示的缺失突变菌株中表达。这个第4版和第12页用FM4-64染料对细胞进行双重标记，以显示液泡和内体室。底部的图表显示了GFP标签（G）的位置和膜中蛋白质的拓扑结构，正如TMHMM程序所预测的那样(http://www.cbs.dtu.dk/services网站).

其中两个富集蛋白是内囊泡的预期成分。Cps1p是一种单跨膜蛋白，具有短的细胞质N末端和大的管腔C末端，以前已知它能到达内切体输送的囊泡中的液泡(Odorizzi等人，1998年). 氨肽酶I（Lap4p）是一种可溶性蛋白酶，通过Cvt途径从细胞质运输到液泡，如上所述，在细胞内的液泡泡中积累Δpep4应变，应变(Baba等人，1997年).

其他三种蛋白质都被预测为完整的膜蛋白。Phm5p是一种多磷酸盐内磷酸酶。酵母细胞在液泡中积累了大量的多聚磷酸链，液泡被用作磷酸盐的贮存器(Urech公司等., 1978). Phm5p需要从这些链中动员磷酸盐，当细胞外磷酸盐水平下降时，其转录被诱导(小川等., 2000). Phm5p有一个TMD，预计其拓扑结构与Cps1p类似。

Ylr205p是一种与血红素加氧酶家族成员高度相似的C-尾锚定蛋白；基于这种相似性，我们提出了这个名称HMX1型对应的基因。这些加氧酶裂解血红素环形成胆绿素和一氧化碳，在真核生物和光合细菌中都有发现。尽管在动物细胞中对这些蛋白质进行了广泛研究，但尚未确定精确的亚细胞定位。然而，人类单核细胞吞噬疟疾色素血红素，一种血红素环的聚合物，这种化合物似乎被溶酶体中的血红素加氧酶降解(Schwarzer等人，1999年). Hmx1p的催化结构域预计最初会暴露于胞浆中，但最终会出现在液泡腔中；它在哪里发挥作用尚不清楚。

Yjl151p是一种含有两个TMD的非常小的蛋白质。它在酵母中有三个同源物，在真菌中有几个同源物，秀丽隐杆线虫和植物。其中一种酵母同源物Pmp3p/Sna1p已被证明定位于质膜，并参与盐和电荷稳态。人们假设它会形成一个质子通道，限制质膜的极化，从而减少钠离子的吸收(纳瓦雷和戈菲，2000年). 因为它与国民账户体系1，我们推荐这个名字SNA3型对于YJL151C型和其他两个同源物国民账户体系2(YDR525W-A型)和国民账户体系4(YDL123W型)，反映基因产物胞内位置的数字顺序（见下文）。

新鉴定的蛋白质通过晚期内胚体传递到液泡腔

我们用GFP标记Phm5p、Hmx1p、Sna3p和Cps1p，并在野生型菌株中表达它们（图三，重量）。所有结构均显示出空泡腔的清晰染色。由于每一种都标记在蛋白质的预测细胞溶质部分上，因此管腔荧光表明它们进入了内部囊泡，正如从它们的分馏行为中所预期的那样。如核膜荧光所示，部分GFP–Hmx1p留在内质网中。这可能反映了一个正常的双位置，但我们不能排除GFP标签的存在减缓Hmx1p从ER退出的可能性。

多泡体的形成是一种内体功能，似乎主要发生在酵母的晚期内体中。该过程在E类空泡蛋白分选突变体中被阻断，例如第4版(Odorizzi等人，1998年;Reggiori等人，2000年). 在第4版细胞，异常扩大的周围隔室积聚(Babst等人，1997年)，可以使用内吞示踪染料FM4-64进行可视化(Vida和Emr，1995年). 如图所示三，我们所有的嵌合体都被困在这些结构中第4版细胞，表明它们通常通过晚期内体。

因为一个第4版已知等位基因影响自噬(Shirahama等人，1997年)因此，可以想象其他过程，如Cvt途径，我们也在Δpep12突变体。清除Pep12p不会影响Cvt途径(Abeliovich等人，1999年)，但阻止囊泡与晚期内体融合(Becherer等人，1996年). 在Δpep12菌株、Cps1p和三种新鉴定的蛋白质积累在非常小的结构中，可能是小泡，但没有到达液泡腔（图三); 这对于Hmx1p来说不太清楚，因为它有在内质网中积聚的倾向。一些GFP–Cps1p确实在Δpep12细胞，但它仍留在外膜上。这可能反映了由AP-3外壳蛋白介导的从高尔基体到液泡的直接运输过程，该蛋白绕过晚期内体，从而形成内囊泡的内陷过程(Cowles等人，1997年;Stepp等人，1997年). 此路线在Δapm3突变体，缺少AP-3亚单位之一，但正如预期的那样apm3（立方米）当内胚体通路完好无损时，突变并没有阻止任何GFP嵌合体到达空泡腔（图三).

这些结果证实，Cps1p、Phm5p、Hmx1p和Sna3p通常都是从晚期内体到达液泡的，通过内体对它们输送到液泡内部至关重要。在胞内吞不足突变中，它们的定位也基本上没有受到影响结束4表明它们直接从高尔基体传递到内体，而不是通过质膜（图三).

为了确认预测的蛋白质膜方向，我们通过野生型和第4版具有抗GFP抗体的细胞。在野生型细胞中，进入液泡最终会使GFP标签暴露于液泡蛋白酶，而在第4版不能形成多泡体的细胞，应保持与胞浆接触。图4显示在野生型细胞中发生所有蛋白质的部分切割以产生游离的GFP（条带1）。在第4版细胞中未观察到任何嵌合物，证实GFP未暴露于蛋白酶。然而，Cps1p和Phm5p都显示GFP产物大4 kDa（带2），对应于跨膜结构域以外的分裂。这种由普遍隔室或液泡内的蛋白酶介导的分裂是Cps1p生物发生的一个已知特征(Spormann等人，1992年). Hmx1p和Sna3p在第4版细胞，与它们的最小管腔域一致。因此，该分析完全支持蛋白质的预测结构。

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图4。GFP嵌合体分析。用抗GFP抗体探测来自表达所示蛋白质的GFP标记版本的细胞的总提取物的蛋白质印迹。三角形表示全长嵌合体；星号标记了一种与抗GFP抗体交叉反应的酵母蛋白。位置1的条带对应于游离GFP，位置2的条带包含与Cps1p或Phm5p的细胞质尾部和TMD相连的GFP。分子量标记（kDa）显示在右侧。比GFP–Sna3p迁移更慢的带的性质尚不清楚；它们可能代表构象异构体或蛋白质复合物。

由于Sna3p是酵母中蛋白质家族的成员，我们调查了该家族中是否有其他成员共享其位置。四个序列的比对表明，它们在跨膜结构域中高度相似，但在C末端出现分歧（图5A） 。GFP标记证实了Sna1p的质膜位置，并揭示了Sna2p的点状模式（未显示）。然而，Sna4p位于外液泡膜上（图5B） 提出了一个问题，即它是如何逃脱其亲属Sna3p的命运的。一种可能是它通过AP-3途径直接到达液泡绕过晚期内体(Odorizzi等人，1998年;Reggiori等人，2000年)，实际上它含有酸性二亮氨酸基序（图5A） ，可能是AP-3分拣信号(Darsow等人，1998年). 我们通过在Δapm3突变体。在这些细胞中，Sna4p被迫通过晚期内胚体到达液泡，并且像Sna3p一样存在于内腔中（图5B） 。因此，进入多泡体的能力并不是Sna3p独有的，但可能是这些蛋白质的一个共同特性，可能由它们相似的跨膜片段介导。

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图5。酵母中的Sna蛋白家族。(A类)Sna3p序列与其他三个序列的比对，黑色和灰色背景表明其相同性和相似性。序列上方的粗条表示TMD。点表示Sna3p中的细胞质赖氨酸；强调了Sna4p中的酸性二亮氨酸基序。(B类)GFP标记的Sna4p位于野生型细胞的液泡膜上，但位于Δapm3细胞。(C类)GFP–Phm5p在Δsna3突变体。

我们还研究了Sna3p本身是否是形成多泡体所必需的，但发现Phm5p向液泡内部的传递在Δsna3应变（图5C） ●●●●。我们的结论是，我们已经鉴定的三种新蛋白质是被分类到多泡体内部的货运分子。尽管我们不能排除一个多余的角色，但我们没有证据表明它们是形成这些结构的机制的一部分。尽管如此，它们还是为研究这一内体分选步骤的基础提供了工具。

泛素化影响多泡体的内化

泛素在内胚体分选中的作用最近被提出(Amerik等人，2000年;Losko等人，2001年). 这些研究使用了一种缺失Doa4p的缺失菌株，这是一种泛素特异性蛋白酶，可以从蛋白质结合物中去除泛素(《爸爸和霍克斯特拉瑟》，1993年). Doa4p在泛素的循环中很重要，其功能的丧失会导致游离泛素的耗竭，从而干扰所有泛素依赖的过程(Swaminathan等人，1999年). 当GFP标记的Cps1p、Phm5p和Hmx1p版本在Δdoa4菌株中，所有三种蛋白质都主要存在于液泡膜上，而不是液泡内，这表明它们的有效内化依赖于泛素（图6).

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图6。向液泡内部的输送在Δdoa4细胞。GFP标记的Cps1p、Phm5p和Hmx1p在Δdoa4细胞，也用FM4-64标记。与野生型细胞相比，GFP荧光在液泡膜上比液泡内更显著（见图三). GFP–Hmx1p可见的最亮光环对应于核膜。

泛素可以直接作用，标记蛋白质内部化，也可以间接作用于多泡体的形成。作为区分这些可能性的第一步，我们调查了蛋白质本身是否泛素化。我们关注的是Cps1p和Phm5p，因为它们被传递到液泡的效率比Hmx1p高。这些蛋白各自用蛋白A标记，在连接处具有烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点，以允许随后去除蛋白A。这些构造被引入到Δdoa4表达myc标记泛素的菌株CUP1大学启动子，从而通过获取myc表位检测泛素化蛋白(Ellison和Hochstrasser，1991年). 通过向培养基中添加铜诱导标记泛素的表达，细胞裂解，并使用IgG–Sepharose柱分离蛋白A嵌合体。它们通过TEV蛋白酶裂解从Sepharose珠中释放，并通过免疫印迹测试myc-ubiquitin的存在。如图所示7，Cps1p和Phm5p都产生了几个含myc的条带，它们的活动性表明在每个病例中可以添加多种泛素。这些修饰带在总细胞提取物中很难看到，因为在样品制备过程中很难抑制大量的去泛素化酶。

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图7。Cps1p和Phm5p的泛素化。(A类) Δdoa4表达myc标记泛素和蛋白A标记的Cps1p或仅内源性Cps1p的细胞并行处理。用抗蛋白A（PA）或抗myc免疫印迹法对总提取物和通过结合IgG–Sepharose纯化的蛋白质进行免疫印迹，然后用TEV蛋白酶裂解以从蛋白A标签中释放Cps1p。请注意，纯化材料中不存在蛋白质A。由于可变糖基化，Cps1p以双链形式迁移(Spormann等人，1992年). 蛋白A嵌合体上方的微弱带可能是泛素化形式，但由于样品制备过程中的去泛素化作用，这些在总细胞提取物中未得到充分表达。(B类)As（A），但细胞表达蛋白A标记的Phm5p。含有较低蛋白A的条带是由跨膜结构域附近的加工产生的（见图4). 此外，可以检测到一些更随机的降解，这说明纯化部分中myc标记的蛋白质较小。在这两个面板中，星号表示单-双基化蛋白质的近似可动性。

泛素链被添加到赖氨酸残基中，因此，如果泛素化是后期内体中蛋白质内化所必需的，则相关赖氨酸的突变应阻止传递到液泡内部。Phm5p的细胞质域包含四种赖氨酸（图8). Lys6突变为甘氨酸（未显示）或精氨酸导致蛋白质在液泡膜上积累，就像在Δdoa4应变（图8). 这表明Lys6是泛素化的重要位点。然而，这种赖氨酸突变的效果仅在约70%的细胞中明显，而将所有四种赖氨酸全部改为精氨酸会在所有细胞中产生液泡膜荧光（数据未显示）。因此，另一种或多种膜近端赖氨酸也可能是泛素化的底物。GFP中的赖氨酸显然不能替代Phm5p尾部的赖氨酸类。

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图8。Phm5p的排序被Lys6突变阻断，但通过添加泛素恢复。GFP–Phm5p、K6R突变体和在GFP N末端添加泛素的突变体在野生型细胞（WT）和Δdoa4突变体。底部显示了Phm5p细胞质尾部的序列。

为了确认赖氨酸需求仅用于泛素化，我们通过在GFP标签的N末端整合其序列，将泛素添加到Lys6突变体中。泛素序列在与GFP结合处被修改，以防止其去除（Gly76到Val；参见魏斯曼，2001). 此外，赖氨酸29、48和63是酵母中添加泛素的已知位点(阿纳森和埃里森，1994年)，被精氨酸取代。这些修饰确保结构上存在单一泛素。如图所示8，添加泛素足以恢复所有细胞中Phm5p K6R突变体向液泡内部的传递。此外，即使在Δdoa4细胞，表明这些细胞中的分选缺陷是由于Phm5p缺乏泛素化，而不是由于分选机械的任何一般影响。

从这些结果中，我们得出结论，Phm5p通过一种需要泛素化的机制被分类为晚期内体中的内囊泡。Cps1p和Hmx1p可能也是如此，因为它们都受到行动方向4我们已经证明了Cps1p也是泛素化的。虽然Cps1p和Phm5p都能接受多种泛素，但至少在行动方向4应变，一个单一的泛素是这个分选过程的充分信号。

泛素化作为晚期内体的分选信号

我们的实验表明，Phm5p进入多泡体是因为它是泛素化的。我们表明，其细胞质尾部的赖氨酸残基对有效内化至关重要，蛋白质是泛素化的，细胞质赖氨酸的缺失可以通过在构建物的N末端添加一个单一的、不可去除的泛素来补偿。在一个行动方向4游离泛素水平受限的突变体(Swaminathan等人，1999年)，内部化也受阻。我们还表明，Cps1p和Hmx1p的内化在行动方向4Cps1p是泛素化的。Emr及其同事的平行研究也证明了Cps1p的泛素依赖性排序(Katzmann等人，2001年).

Phm5p数据排除了对行动方向4效果。因此，不可能是这样行动方向4细胞不能对内化机制的某些组成部分而不是货物蛋白本身进行必要的泛素化，因为通过向Phm5p特异性添加泛素，可以在这些细胞中恢复Phm5p的分选。内体功能仍有可能需要其他泛素化事件，但如果是这样，它们仍可能发生在行动方向4细胞。这并不令人难以置信，因为行动方向4细胞保持低水平的泛素化，这对生存能力至关重要。其次，Doa4p泛素特异性蛋白酶从底物中完全去除泛素对其内化不是必需的。这种移除通常会发生(杜普雷和哈格努埃尔·沙帕斯，2001年)但不可移除的泛素部分不能阻止Phm5p的内陷。

令人惊讶的是，在Phm5p中添加一个泛素就足够了。在这方面，内胚体的分选类似于细胞表面受体和通透酶的泛素依赖性内吞作用(Terrell等人，1998年;Nakatsu等人，2000年;希克，2001年)而不是依赖蛋白酶体的蛋白水解，这需要至少四个泛素链(魏斯曼，2001). 然而，液泡蛋白可以清楚地接受多种泛素，至少当它们的清除受到行动方向4突变。这可能是泛素链的延伸提高了分选效率，正如尿嘧啶通透酶的内吞作用所显示的那样(Galan和Haguenauer-Tsapis，1997年).

液泡蛋白不能到达细胞表面结束4突变体，因此它们的修饰必须完全发生在细胞内，要么发生在晚期内体，要么发生于早期，如高尔基体。泛素似乎被用作多个点的信号，以诱导从质膜或高尔基体向内胚体的转运，并诱导内胚体内陷，从而传递到液泡。事实上，标记内吞作用的质膜蛋白的泛素如果被保留，也会确保其进入多泡体并最终在液泡中死亡。改变这种命运需要特异性地清除泛素，这可能是蛋白质循环中的一个重要调控步骤。

泛素是如何在内胚体中被识别的，以及被标记的蛋白质如何直接作用于内囊泡，仍有待观察。有趣的是，多泡体形成所需的Vps23p具有与泛素化酶同源的结构域，但缺乏泛素在这些酶中结合的Cys残基(巴斯特等., 2000;Bishop和Woodman，2001年). 因此，这个结构域可能具有识别功能，而不是酶功能(卡兹曼等., 2001).

还有一个问题是，蛋白质最初是如何被识别为泛素化的。尽管进入内囊泡的各种蛋白质没有明显的共同基序，但它们细胞质尾部的序列特征可能提供了一个信号。或者，其他一些功能（如TMD）可能很重要(雷焦里等., 2000)和赖氨酸残基相比，它们的位置更容易识别。当负责修饰的酶已知时，这种区别将更容易作出，目前正在研究中。

内泡囊泡的纯化及蛋白质分析

按照说明纯化液泡(哈斯，1995年)来自Δpep4表达GFP标记的菌株政治公众人物3D在TMD的第三个位置用天冬氨酸构建[Pep12p(Reggiori等人，2000年)]. 在微型离心管中收集每个梯度（600–800µl）的真空，用700µl冰镇等渗缓冲液（10 mM PIPES–KOH pH 6.8，200 mM山梨醇）稀释，并在15000下离心克持续15分钟（4°C）。丢弃上清液，将颗粒重新悬浮在含有15%Ficoll的20–40µl等渗缓冲液中。通过Bradford测定法（Bio-Rad，Munich，Gemany）测定蛋白质浓度，并通过用相同的缓冲液稀释样品将其调节至1µg/µl。然后在液氮中冷冻小份。

在冰上解冻真空（600–800µg），并在微型离心管中分配40µl等分样品。通过用移液管吸取460µl冰镇低渗缓冲液[20 mM PIPES pH 6.8，20 mM EDTA含有2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），2µg/ml胃蛋白酶抑制素A和Cömplete™EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒]稀释每等分样品，然后在15000下离心克持续15分钟（4°C）。将上清液汇集在一起，并在15000下再次离心克持续15分钟（4°C）。将最终的上清液转移到一个3 ml聚碳酸酯管中（加利福尼亚州帕洛阿尔托市贝克曼），并在500 000下离心克在TLA 100.3 Beckman转子中保持30分钟（4°C）。去除上清液（S500），轻轻添加3ml低渗缓冲液，并在500 000重新离心之前倒置试管3-4次克持续30分钟（4°C）。通过在50µl含有2 mM PMSF和Cöcomplete™EDTA无蛋白酶抑制剂混合物的样品缓冲液中进行超声处理，将最终颗粒（P500）重新悬浮；在制备凝胶上加载30µl用于质谱分析。如前所述，进行蛋白质条带的胰蛋白酶消化和质谱分析(Siniossoglou等人，2000年). 用80µl样品缓冲液稀释剩余的20µl，并使用10µl等分样品进行western blot分析。用抗ALP、Dpm1p和Pgk1的单克隆抗体（分子探针，尤金，OR）和抗GFP的兔多克隆抗体（来自剑桥MRC的Derek McCusker博士的礼物）、CPY和Sso2p进行孵化(Holthuis等人，1998年).

质粒

CPS1系列PCR是否生成并克隆为生态RI–巴姆HI片段导入pRS416载体(西科尔斯基和希特，1989年)表达mut2-GFP变异体的后序列(Cormack等人，1996年)和TPI1型促进剂，如所述伍丁和佩勒姆（1998）5′引物在起始蛋氨酸之前引入了五种甘氨酸。Ylr205c公司(HMX1型)也由PCR产生并克隆为斯图I–巴姆HI片段插入上述表达质粒中，用生态RI，被Klenow打断了，最后被消化了巴姆HI消除中央处理器1.PHM5型和PHM5型点突变由PCR产生并克隆为抗坏血酸I–巴姆同一表达质粒中的HI片段，其中抗坏血酸在GFP的3′端引入了I站点，以代替生态RI站点。通过将GFP编码序列替换为PCR生成的序列，生成了相同矢量的YFP版本Hin公司第II部分——抗坏血酸I片段编码YFP。

Yjl151c公司(国民账户体系3),Yjl151c公司点突变，国民账户体系1/PMP3型,Ydr525w-A型(国民账户体系2)和Ydl123瓦(国民账户体系4)均由PCR产生并克隆为欣dIII–年龄我在pTL321载体（T.Levine和S.Munro赠送的礼物）中进行片段分割，在一个TPI1型发起人。E.Hettema善意地提供了一个编码泛素（Ub）的质粒，其点突变K29R、K48R、K63R和G76V融合到GFP的N末端。此Ub–GFP融合被替换为GFP–PHM5KR构造Hin公司dIII–理学硕士我的碎片。要构造一氧化氮合酶1启动子驱动的蛋白A与蛋白A后的TEV裂解位点融合，CPS1系列被PCR克隆为恩德I–巴姆HI片段进入pNOPATA/NPL3载体(Senger等人，1998年).PHM5型被克隆为抗坏血酸I–巴姆同一表达质粒中的HI片段，其中抗坏血酸I位点位于蛋白A编码序列的3′端。在所有病例中，通过测序证实了这些变化。所有用于DNA操作的酶均来自新英格兰生物实验室（马萨诸塞州贝弗利）。

活细胞的电子显微镜和成像

对于电子显微镜而言，重量和Δpep4细胞生长在YEPD培养基至对数早期。高锰酸盐固定、脱水和埋入Spurr树脂（Agar Scientific，Stansted，UK）的方法如下所述Kaiser和Schekman（1990）切片在60°C下用5%醋酸铀酰染色10分钟，然后在室温下用雷诺柠檬酸铅染色5分钟。使用Philips CM10透射电子显微镜观察切片。

如前所述，制备活细胞进行GFP荧光并用FM4-64（分子探针）染色(雷焦里等., 2000). 如前所述进行双标签GFP/YFP分析(Siniossoglou公司等., 2000). 在荧光成像之前，将纯化的液泡重新悬浮在含有15%Ficoll的等渗缓冲液中，并用盖玻片将其截留在载玻片上。