Hrs向早期内体招募网格蛋白

氯菊酯定位于内体上的含Hrs区域

EEA1和Hrs之间缺乏精确的共定位，这表明这两种蛋白质参与不同的生化途径。由于EEA1调节膜融合，我们推断Hrs可能调节其他一些内体转运事件，如受体分选或囊泡出芽。因此，我们研究了Hrs和与后一事件有关的分子之间可能的共定位。以前的研究已经在早期内体上发现了氯氰菊酯(斯托沃格尔等., 1996;索基纳等., 1999;拉波索等., 2001). 为了通过共焦免疫荧光显微镜检测内体网格蛋白，我们用Rab5转染BHK细胞^Q79升并用抗网格蛋白抗体对细胞进行染色。正如预期的那样，抗甲氰菊酯抗体染色了许多点状物，这些点状物可能对应于质膜上的包衣凹坑和细胞细胞质中的包衣囊泡（图1D） ●●●●。此外，在放大的Rab5上发现了氯菊酯的一个子集^Q79升-阳性内体（图1D、 箭头所示），证实存在一个网格蛋白内体池。我们没有在放大的内体上检测到网格蛋白适配器AP1和AP2，也没有发现内体AP3与网格蛋白共存（未显示）。与EEA1和Hrs一样，在扩大的内体区域检测到了氯氰菊酯（图1D、 插图）。值得注意的是，而氯氰菊酯定位于不同于EEA1的区域（图1C和D，插图），发现它与内胚层膜上的含Hrs区域强烈共存（图1E和F，插图）。

已确定Hrs在Rab5上与氯菊酯共定位^Q79升-扩大早期内体，我们开始确定非转染细胞的情况是否相同。Hrs最初在黑色素瘤细胞中发现(Komada和Kitamura，1995年)最近，电子显微镜显示，黑色素瘤细胞中含有与黑色素小体形成有关的、涂有网格蛋白的内体(拉波索等., 2001). 为了进一步研究Hrs和网格蛋白的共同定位，我们用抗EEA1、抗Hrs和抗网格蛋白抗体对未转染的黑色素瘤细胞进行三色染色（图2). 与Rab5获得的数据一致^Q79升-转染BHK细胞后，我们在黑色素瘤细胞EEA1阳性内体上观察到Hrs和网格蛋白之间的广泛共定位（图2A–D）。此外，当放大这些早期内体时（图2E–I），我们可以观察到EEA1和Hrs具有差异定位，并且氯氰菊酯与Hrs相关区域共定位。在未转染的HEp-2细胞中也进行了同样的观察（未显示），尽管这些细胞内体上的网格蛋白较少。Hrs和网格蛋白之间惊人的共同定位表明，这些蛋白质可能在早期内体的相同分子复合体中发现。

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图2。黑素瘤细胞中Hrs、EEA1和网格蛋白的定位。固定前用0.05%皂苷渗透的黑色素瘤细胞用抗EEA1染色(A类)，反小时(B类)和抗甲氰菊酯(C类). 箭头表示EEA1、Hrs和甲氰菊酯之间的共定位。黄色表示Hrs和甲氰菊酯之间的共同定位(D类). 箭头指向放大后的内体（G–I）。棒材，5µm。(E类和F类)（A–D）中箭头所示的内体放大图。箭头指向在（G–I）中放大显示的内体。(G公司–我)三染色放大内体的合并图像。注意EEA1在蓝色和红色中的差异定位，以及氯氰菊酯在绿色和Hrs中的共定位（黄色）。

Hrs直接与氯氰菊酯重链的末端结构域结合

当我们将Hrs的氨基酸序列与不同的氯氰菊酯结合蛋白的氨基酸序列进行比较时，我们在Hrs的C末端检测到了五个保守残基簇，它由一个极性氨基酸组成，两侧是疏水性和酸性氨基酸[LLpL（–）]，被描述为“网格蛋白盒”，并与网格蛋白重链（HC）的末端结构域（TD）特异性相互作用(古德曼等., 1997;德尔安吉丽卡等., 1998;特哈尔等., 2000). 图中显示了不同网格蛋白结合蛋白的网格蛋白盒基序和Hrs基序的比对三答：。

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图3。Hrs的C末端结合网格蛋白TD(A类)结合氯氰菊酯的蛋白质中的序列比对(特哈尔等., 2000;特奥等., 2001;杨等., 2001). 这说明在Hrs的770-775残基中存在潜在的网格蛋白结合基序。Hrs是唯一在C末端具有网格蛋白盒基序的蛋白质。（B–E）Hrs与甲氰菊酯的相互作用(B类和C类)用pLexA中的诱饵构建物和pGAD中的猎物构建物转化L40报告酵母细胞。报告者β-半乳糖苷酶活性（以任意单位表示）表示结合，并表示为两个重复进行的独立实验的平均值。误差条表示±SEM。在（B）中，展示了一个三重链的网格蛋白，并指出了末端结构域（TD）、远端结构域（DD）和中心结构域（HD）。(D类)重组GST（车道1），GST–小时_707–775（车道2）或GST–小时_707–770（通道3）固定在谷胱甘肽-Sepharose珠上，并与猪脑细胞液孵育。通过离心回收珠子并清洗。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。在用抗网格蛋白重链抗体检测网格蛋白（上图）之前，用胭脂红S（下图）对印迹进行染色。(E类)重组GST（车道1），GST–小时_707–775（车道2）或GST–小时_707–770（通道3），固定在谷胱甘肽-Sepharose微球上，并与纯化的重组网格蛋白末端结构域（TD）孵育_1–579). 通过离心分离回收珠粒并洗涤。球团部分通过SDS-PAGE分解并转移至硝化纤维素。检测氯氰菊酯TD之前，用Ponceau S（下面板）对印迹进行染色_1–579带有抗氯氰菊酯重链（上面板）。通道4表示重组氯氰菊酯TD的总量_1–579添加到珠子中。

基于这些发现，我们想研究Hrs是否能与氯氰菊酯相互作用。使用酵母双杂交系统，我们首先测试Hrs和氯氰菊酯HC的三个不同结构域之间是否存在相互作用（图三B） ●●●●。虽然我们发现全长Hrs与氯氰菊酯HC的远端结构域（残基493–1072）或中心结构域（残留物1066–1675）之间没有显著的相互作用，但我们观察到Hrs和氯氰菊酯HC末端结构域（TD）（残基1–579）之间存在强相互作用（图三B） ●●●●。还发现与一个较短的甲氰菊酯HC片段（残基1-330）（未显示）发生相互作用，该片段构成甲氰菊酯TD的β-螺旋桨结构域(特哈尔等., 2000). 这些结果表明，Hrs与网格蛋白TD特异性结合_1–673)未结合（未显示），这是一个由69个C末端氨基酸（Hrs）组成的小结构_707–775)显示出与网格蛋白TD的强烈相互作用（图三C） ，表明Hrs的C末端部分是一个自主的氯氰菊酯结合域。此外，删除全长Hrs（Hrs）的网格蛋白盒基序_1–770)或网格蛋白结合域（Hrs_707–770)基本上消除了与网格蛋白TD的相互作用（图三C） 证明了这五种氨基酸对氯氰菊酯结合的重要性。

为了从生物化学角度确认双杂交数据，我们在GST下拉分析中研究了Hrs和氯氰菊酯-TD之间的相互作用。当GST–小时秒_707–775与谷胱甘肽偶联–将Sepharose与猪脑细胞液孵育，将网格蛋白HC与融合蛋白结合，并用珠粒制成颗粒（图三D、 车道2）。没有可检测到的氯氰菊酯与GST单独或GST–Hr一起被降低秒_707–770确认了网格蛋白盒基序的重要性（图三D） ●●●●。为了研究Hrs是否直接与网格蛋白TD结合，我们使用纯化的重组网格蛋白TD（网格蛋白TD-）检测了这些蛋白质之间的相互作用_1–579). 与GST孵育时–小时_707–775固定在谷胱甘肽–Sepharose，clathrin-TD上_1–579保留在珠子部分中（图三E、 车道2），而仅GST未发现约束。值得注意的是，少量的氯氰菊酯TD_1–579受GST约束–小时_707–770（图三E、 通道3），表明删除氯氰菊酯盒会降低但不会完全消除Hrs对氯氰菊酯的亲和力。

Hrs向早期内体招募网格蛋白

为了研究Hrs是否能够将网格蛋白补充到早期内体中体内，我们在BHK细胞中表达myc表位标记的Hrs结构，并检测其与网格蛋白的共定位。如前所述(Urbé等人，2000年;Raiborg等人，2001年)，Hrs过表达与EEA1在簇状早期内体上共定位（图4A） ●●●●。值得注意的是，两种氯氰菊酯HC的大量补充（图4B） 与未转染细胞相比，在这些结构上观察到了氯氰菊酯轻链（LC）（未显示）（图4B） ●●●●。还观察到与网格蛋白的共定位，Hrs的缺失突变体缺乏N-末端VHS结构域（未显示）。在删除构成网格蛋白盒的五个氨基酸（未显示）后，Hrs仍显示出与网格蛋白的一些共定位，这表明该基序并非网格蛋白募集的绝对必要基序，Hrs C末端的额外残基可能参与相互作用。这与β-arrestin的结果一致(ter Haar等人，2000年)和epsin 1(Drake等人，2000年)并与我们通过GST下拉分析获得的结果一致（图三E） ●●●●。然而，缺失69个C末端氨基酸的缺失突变体（Hrs_1–706)没有显示出对Hrs-阳性内体的网格蛋白补充（图4C） ●●●●。这些发现表明，Hrs的C末端部分向早期内体招募网格蛋白。

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图4。(A类–C类)过度表达的Hrs将网格蛋白募集到早期内体中。用myc标记的Hrs（A和B）或Hrs转染BHK细胞_1–706（C）并在固定前用0.05%的皂苷进行渗透。用抗myc（左面板）、抗EEA1（A，中面板）或抗氯氰菊酯（B和C，中面板。(D类–F类)过度表达的小时数不会招募AP1、AP2或AP3。在固定之前，用myc标记的Hrs转染BHK细胞或HEp-2细胞（对于AP3），并用0.05%的皂苷进行渗透。用抗-myc（左图）、抗-AP1（D，中图）、抗-AP2（E，中图）或抗-AP3（F，中图）对细胞进行染色，并通过共聚焦免疫荧光显微镜进行研究。右侧面板显示合并的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。

网格蛋白适配器蛋白AP1和AP2位于反式-高尔基网络（TGN）和质膜中分别存在，而AP3存在于TGN和内体中(Dell'Angelica等人，1997年;赫斯特和罗宾逊，1998年;Kirchhausen，1999年). 因为这些适配器复合物通过甲氰菊酯盒序列与甲氰菊酯直接相互作用(Shih等人，1995年;Dell'Angelica等人，1998年)，我们研究了它们可能向Hrs-过表达的内体募集。正如所料，AP1出现在反式-高尔基地区（图4D） 而AP2在质膜和包膜囊泡中检测到（图4E） AP3主要分布在核周（图4F） ●●●●。与氯氰菊酯相比，未观察到AP1、AP2或AP3在Hrs过度表达的内体上的募集（图4D–F）。先前已经报道AP1和AP2与EGF受体和网格蛋白在EGF刺激的A431细胞内体上共同定位(Sorkina等人，1999年)而在Cos-1细胞的内胚体上发现的AP2很少(Sorkina等人，1999年). 由于我们也没有在内体上检测到AP1或AP2的存在，这些网格蛋白适配器的内体定位可能依赖于细胞类型。与衔接蛋白不同，被包裹的囊泡相关GTPase（dynamin）被Hrs招募到早期内体中（图5A） 以及Eps15（图5B） ，它最近被证明直接与Hrs的N末端一半结合(Bean等人，2000年). 与氯氰菊酯类似，dynamin与缺乏C末端的Hrs（Hrs_1–706)，表明它可能是通过氯菊酯招募的（未显示）。相反，Eps15被Hrs招募到内体_1–706（图5C） 与Eps15结合到不同于氯氰菊酯的Hrs区域一致。

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图5。过度表达的Hrs将dynamin和Eps15引入内体。用myc标记的Hrs转染BHK细胞(A类和B类)或小时_1–706 (C类)固定前用0.05%的皂苷进行渗透。用抗myc（左面板）、抗dynamin（A，中面板）或抗Eps15（B和C，中面板。右侧面板显示合并的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。

BHK细胞的早期内体已通过电子显微镜进行了很好的表征(格里菲斯等., 1989)通常由孤立的水池组成，如图所示6A.当分析过表达Hrs的细胞时，观察到牛血清白蛋白（BSA）-含金Hrs阳性内体的聚集（图6B） 与共焦显微镜观察到的效果一致。Hrs阳性囊泡含有一层电子致密的扁平涂层，这使这些结构具有特征性的形态（图6B） ●●●●。与免疫荧光数据一致，外套中含有氯氰菊酯（图6C） ，Eps15（图6D） 和dynamin（图6E） ●●●●。Hrs诱导的涂层比在涂有网格蛋白的凹坑上观察到的典型网格蛋白涂层稍厚（图6C、 插图）。此外，在转染网格蛋白结合缺陷突变体Hrs的细胞中也可以观察到外壳_1–706（未显示），表明它由其他蛋白质组成。

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图6。Hrs过表达内体的电子显微镜。(A类)来自未转染BHK细胞的早期内体在固定前已内吞5 nm BSA–金（箭头）10分钟。(B类)Hrs在myc-Hrs转染的BHK细胞中的定位，该细胞在固定前已内吞5nm BSA-gold（箭头）1h。解冻后的冰冻切片用抗myc抗体标记，然后用兔抗鼠抗体和15nm蛋白A-金标记。注意Hrs-阳性隔间的涂层外观和聚集。(C类)甲氰菊酯在myc-Hrs转染细胞中的免疫电镜定位。解冻后的冰冻切片用兔抗甲氰菊酯LC（10 nm金）进行双重标记，然后用小鼠抗myc抗体和兔抗鼠抗体（15 nm金）标记。标记显示，氯氰菊酯定位于特征性myc-Hrs诱导的内胚层。（C，插图）一个涂有甲氰菊酯的凹坑，标记有山羊抗甲氰菊酯，然后是兔抗羊蛋白和15纳米蛋白A–金。(D类)Eps15在myc-Hrs转染细胞中的免疫电镜定位。解冻的冷冻切片用抗Eps15（10 nm蛋白A–金）双重标记，然后标记myc表位（15 nm蛋白A–金）。特征性Hrs-阳性的内胚层上有一个强的Eps15标记。(E类)myc-Hrs转染细胞中动态蛋白的免疫电镜定位。将内吞5 nm BSA–金1 h的细胞（箭头）解冻冷冻切片，用小鼠抗动力蛋白1抗体（Hudy 1）标记，然后用兔抗鼠抗体和15 nm蛋白A–金（箭头）标记。在因Hrs过度表达而表现出包衣内体特征性聚集的细胞中，dynamin的标记定位于内胚层以及质膜上典型的网格蛋白包衣凹坑（CP，插图）。条形，200 nm。

过度表达的Hrs不会干扰转铁蛋白的内吞和再循环

由于网格蛋白在Hrs阳性的早期内体中的强烈募集，我们想评估Hrs在网格蛋白介导的内吞作用中的作用。在我们的转染条件下，BHK细胞与转铁蛋白（Tf）受体和Hrs或各种Hrs片段共同转染_707–775，小时_707–770和小时_1–706与单独转染Tf受体的细胞相比，Tf的内吞作用没有降低（图7A） ●●●●。此外，Hrs（Hrs_707–775)没有表现为内体上氯氰菊酯补充的显性-阴性突变（未显示）。Hrs的过度表达也不会影响Tf的回收（图7B） ●●●●。这些结果表明，Hrs在内吞内化或再循环途径中不起作用。

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图7。过度表达的Hrs不干扰转铁蛋白的内吞或再循环，但抑制EGF降解。(A类)心率对转铁蛋白内吞的影响。将转铁蛋白受体单独转染BHK细胞（对照组）或转铁蛋白接收器与Hrs联合转染6 h。将细胞与Ru-tag标记的转铁蛋白在37°C下孵育15分钟，并通过蛋白酶去除表面结合的转铁蛋白。使用ORIGEN分析仪测量细胞相关转铁蛋白的量，内吞转铁蛋白表示为总细胞相关转铁蛋白的百分比。误差条表示重复进行的三个独立实验的SEM。(B类)Hrs对转铁蛋白回收的影响。将转铁蛋白受体单独转染BHK细胞（对照组）或转铁蛋白接收器与Hrs联合转染6 h。将细胞与Ru标记的转铁蛋白在37°C下孵育30分钟，并通过MESNA去除部分微孔中的表面结合转铁蛋白。将MESNA处理的细胞进一步培养至指定的时间。使用ORIGEN分析仪测量细胞相关转铁蛋白的量，细胞内转铁蛋白以总细胞相关转铁蛋白的百分比表示。误差条表示两个独立实验的扫描电镜，两个实验重复进行。(C类)Hrs对EGF降解的影响。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下内化罗丹明-EGF 1小时。对细胞进行清洗，并进一步孵育不同时间，直至3小时。固定前用0.05%的皂苷使细胞渗透。用抗myc染色并用共焦免疫荧光显微镜进行研究。对每个时间点10个转染细胞和10个非转染细胞的罗丹明-EGF信号的平均强度进行量化，并以未分级EGF与追踪前罗丹明_EGF信号相比的百分比表示。误差线表示±SEM。

过度表达的Hrs抑制从早期到晚期内体的运输

最近，过度表达的Hrs被证明可以抑制EGF受体的降解(下巴等., 2001)有人认为，Hrs可能调节该受体的分选，以将其转运到晚期内吞室。我们研究了这种抑制是否是EGF特有的，或者Hrs的过度表达是否也会影响流相内吞所吸收的分子的转运。通过将罗丹明标记的EGF内化1小时，然后在不同的时间段内追踪EGF，我们确实观察到，与未转染细胞相比，转染Hrs的细胞中EGF降解显著降低（图7C） ●●●●。罗丹明标记的EGF在两个0后与Hrs共同强烈定位（图8A、 B和D）和3小时的追逐（图8G、 H和J）。然而，内化生物素-右旋糖酐也获得了类似的结果（图9)，证明Hrs的过度表达会导致转运的普遍抑制。在表达高水平和低水平Hrs的细胞中观察到抑制作用_1–706)也造成了运输的普遍抑制（未显示）。然而，在追踪0和3小时后，过度表达的Hrs和右旋糖酐之间有很强的共定位（图9A和B），非转染细胞中的内源性Hrs仅在0小时后与内化右旋糖酐共同定位，而不是在追逐期后（图9C和D）。这与Hrs在早期内体中的定位一致。

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图8。过度表达的Hrs抑制EGF从早期到晚期内体的转运。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下与罗丹明-EGF孵育1小时(A类–F类). 清洗部分细胞并进一步培养3小时(G公司–L（左）). 固定前用0.05%的皂苷使细胞渗透。用抗myc（A和G）或抗EEA1抗体（C和I）染色，并用共焦免疫荧光显微镜进行研究。绿松石表示Hrs和EEA1（E和K）之间的共同定位。紫色表示EGF和EEA1（F和L）之间的共同定位。黄色表示Hrs和EGF（D和J）之间的共同定位。棒材，5µm。

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图9。在Hrs过度表达的细胞中，内吞右旋糖酐从早期内体到晚期的转运受到抑制。用myc标记的Hrs转染HEp-2细胞6小时，并在37°C下与生物素-右旋糖酐孵育1小时(A类). 清洗细胞并进一步培养3小时(B类). (C类)37°C下用生物素-右旋糖酐孵育1小时的未转染细胞。(D类)追踪3小时后为未转染细胞。用抗myc（左面板A和B）、抗Hrs（左面板C和D）或链霉亲和素–Cy3（中面板）对细胞进行染色，并用共焦荧光显微镜进行研究。右侧面板显示合并的图像，黄色表示共同定位。棒材，5µm。

值得注意的是，在Hrs过度表达的细胞中，含有EGF的内体（图8)或含有葡聚糖的内体（未显示）在追逐3小时后仍对EEA1呈阳性，而对晚期内体/溶酶体标记LAMP-1（未显示）呈阴性，表明内化的EGF和葡聚糖保留在用Hrs转染的细胞的早期内体中。因此，在Tf摄取和再循环不受影响的条件下，Hrs过度表达可抑制受体结合标记和液相标记从早期到晚期内体的运输。接下来，我们在超微结构水平上研究了这种效应。与非转染细胞相比，在内化1小时后，大多数内化的BSA-金在多泡体内被发现，BSA-黄金积聚在myc-Hrs-阳性结构中（未显示），而从未观察到多泡体和溶酶体的标记。综上所述，我们的数据表明，Hrs是早期到晚期内体膜转运的一个特异性调节器。

Hrs和EEA1在早期内体上的差异定位

定义早期内体不同膜域的机制尚不清楚，但有人认为内体Rab GTPases的差异定位可能有助于定义膜特性(索尼奇森等., 2000). 尽管迄今为止研究的大多数FYVE结构域蛋白都定位于早期内体，但它们在这些细胞器上的相对分布尚未被研究。我们发现EEA1和Hrs定位于早期内体的不同区域，这表明FYVE结构域蛋白的精确定位不仅由FYVE PtdIns（3）P相互作用决定。这与EEA1的Rab5结合域和Hrs的线圈域也参与这些蛋白质的亚细胞靶向性这一事实一致(西蒙森等.，1998年b;莱博格等., 2001). 虽然含EEA1的区域明显参与了膜系留和融合，但我们目前的结果表明，含Hrs的区域可能在蛋白质分选中发挥作用。

内体网格蛋白

到目前为止，在早期分选内体中负责主动分选完整膜蛋白的分子机制尚未确定。这种分类可以使用类似于高尔基体池、内质网、TGN和质膜的不同类型外壳的细胞质外壳(Rothman和Wieland，1996年;赫斯特和罗宾逊，1998年;Gu和Gruenberg，1999年;规模等., 2000). 确实有证据表明内体上有涂层(安尼托等., 1996;斯托沃格尔等., 1996;福特等., 1998;索基纳等., 1999)以及我们在放大的Rab5上检测到的氯氰菊酯^第79季度-阳性内体，以及非转染黑色素瘤和HEp-2细胞内体上的阳性内体证实了内体限制区存在网格蛋白(斯托沃格尔等., 1996;拉波索等., 2001). 在黑色素瘤细胞中，内体网格蛋白涂层由平面或内陷晶格组成，无出芽轮廓(拉波索等., 2001)而在A431细胞中，检测到了氯氰菊酯包被的芽，表明形成了内体衍生的氯氰菊酯包被囊泡(斯托沃格尔等., 1996). 因此，内体上可能至少有两种不同的网格蛋白涂层，我们目前的结果与Hrs在形成黑色素瘤细胞内体上先前确定的扁平网格蛋白涂层中的作用最为一致。我们的发现是，在HEp-2细胞中，沃特曼诱导的Hrs从早期内体膜分离，伴随着内体网格蛋白的消失，这进一步表明Hrs在这些细胞中网格蛋白向内体募集中起着重要作用。网格蛋白从内体中的解离是否可以解释沃特曼宁对内体形态和功能的一些影响(施佩特纳等., 1996)尚待调查。

Hrs作为内吞贩运的调节器

我们的发现是，Hrs的过度表达并不影响Tf内吞作用，这与之前的一份报告相矛盾，在该报告中，Hrs被发现在高水平表达时抑制Tf内食作用(豆子等., 2000). 这种差异的原因尚不清楚，但有一种可能性是，报道的抑制是由更高水平的过表达引起的，这可能导致网格蛋白从质膜重新分布到内体。重要的是，在我们不影响Tf摄取和再循环的条件下，发现Hrs过度表达可抑制受体结合标记和液相标记从早期到晚期内体的运输。这表明Hrs在从早到晚的内胚体运输中起作用，而不是在质膜和早期内胚体之间。

令人惊讶的是，Hrs过度表达的抑制作用似乎并不是由于早期内体大量补充氯氰菊酯，这是一种Hrs（Hrs）的非氯氰结合缺失突变_1–706)也造成了运输的普遍抑制。内切体靶向Hrs结构的过度表达导致早期内切体的聚集（见图6B） ，无论是否存在氯氰菊酯结合的C末端(莱博格等., 2001). 因此，我们推测，这些结构的过度表达可能导致调节内体对接或运动的特定蛋白质的超重组或隔离。

质体构筑

所示的Hrs结构体是用小鼠Hrs进行PCR生成的(Komada和Kitamura，1995年)作为模板。合成寡核苷酸来自MedProbe（挪威奥斯陆）。为了用T7 RNA聚合酶痘苗病毒系统在哺乳动物细胞中表达，在pGEM-myc4的myc表位后面克隆了构建物(Simonsen等人，1998年a). 为了在双杂交系统中使用，构造被克隆到pLexA/pBTM116中(Vojtek等人，1993年)作为诱饵，pGAD GH（Clontech）作为猎物。用于表达GST融合蛋白大肠杆菌通过将相应的cDNA亚克隆到pGEX-6P（Amersham Pharmacia）的多聚体位点，获得pGEX-Hrs或所示的缺失结构。pGEX-2T-柠檬苦素_1–579是吉姆·基恩医生送的礼物(古德曼等人，1997年). 为了表达MBP和Hrs（MBP–Hrs）之间的融合蛋白，Hrs被克隆到pMAL-c2（新英格兰生物实验室）的多聚体中。

BHK或HEp-2细胞中的瞬时表达

使用改良的安卡拉T7 RNA聚合酶重组痘苗病毒和脂质体感染在细胞中表达pGEM和pcDNA3构建物(斯滕马克等., 1995). 转染6小时后对细胞进行分析。

共焦荧光显微镜

BHK、HEp-2或FEMX-III黑色素瘤细胞(福克斯塔德等., 1988)用3%（w/v）多聚甲醛（PFA）固定生长在盖玻片上，并按所述进行荧光显微镜染色(西蒙森等.，1998年a). 在一些实验中，细胞在固定之前用0.05%的皂苷进行渗透。当需要时，用生物素化葡聚糖、罗丹明标记的EGF、Alexa培养细胞⁴⁸⁸–固定前的Tf（25µg/ml）或沃特曼（100 nM）。使用配备Kr/Ar激光器和PL Fluotar 100×/1.30油浸物镜的徕卡TCS NT共焦显微镜检查盖玻片。包括适当的排放过滤器设置和控制，以排除漏气效应。

酵母双杂交方法

酵母报告菌株L40(沃伊特克等., 1993)是共同转变的(Schiestl和Gietz，1989年)使用所示的pLexA和pGAD质粒，如前所述测定转化子的β-半乳糖苷酶活性(Guarente，1983年).

蛋白质表达和纯化

GST和各种GST融合蛋白在大肠杆菌如上所述的BL21（DE3）细胞(Callaghan等人，1999年). 在B-PER™试剂（Pierce）中分解细菌后，在谷胱甘肽–Sepharose 4B（Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweeden）上纯化重组蛋白。GST从氯氰菊酯TD中分离_1–579使用制造商推荐的条件，用凝血酶蛋白酶（Amersham Pharmacia Biotech）消化。MBP–小时以大肠杆菌如上所述的BL21（DE3）细胞(Callaghan等人，1999年)并根据制造商的说明在直链淀粉树脂（新英格兰生物实验室）上纯化。猪脑细胞液的制备如前所述(Garred等人，2001年).

实验

在与0.4或0.1 nmol GST、GST–Hrs孵育之前，用分析缓冲液（25 mM HEPES–KOH pH 7.2、125 mM醋酸钾、2.5 mM醋酸镁、5 mM EGTA和1 mM二硫苏糖醇）将等分（50或25µl）的谷胱甘肽–Sepharose 4B珠（Amersham Pharmacia Biotech）洗涤三次_707–775或GST–小时_707–770在室温下，在200µl分析缓冲液中放置30分钟。然后，在用200µl猪脑细胞液或25 pmol重组网格蛋白-TD孵育之前，在分析缓冲液中清洗珠子两次_1–579[在含有10%胎牛血清（FCS）的分析缓冲液中]在4°C下放置1小时。最后，用分析缓冲液清洗珠子四次，并将其重新悬浮在SDS–PAGE样品缓冲液中。通过SDS–PAGE检测与珠子相关的细胞溶性氯氰菊酯HC，然后使用Santa Cruz Biotechnology，Inc.的山羊抗氯氰菊酯HC多克隆抗体和Pierce的SuperSignal化学发光试剂盒进行免疫印迹。重组网格蛋白-TD_1–579研究诊断公司（Research Diagnostics，Inc.）的小鼠抗氯氰菊酯HC单克隆抗体检测到与珠子相关的抗体。

电子显微镜

细胞要么立即固定，要么用5 nm BSA涂层的胶体金培养(Slot和Geuze，1985年)在37°C的培养基中培养1小时或10分钟，以鉴定内体区室。用BSA–金培养结束后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，并立即用0.1%戊二醛/4%PFA固定在Soerensen磷酸盐缓冲液中。固定后，从培养皿中刮取细胞，造粒，注入2.3M蔗糖，贴装，冷冻并储存在液氮中。如前所述，在解冻的冰冻切片上进行免疫细胞化学标记(格里菲斯等., 1984)使用不同的一级抗体，然后是10或15纳米蛋白A–金（从荷兰乌得勒支G.Posthuma和J.Slot购买），可以直接使用，也可以在与二级抗体孵育后使用。在飞利浦CM120电子显微镜上观察标记的冷冻切片。

转铁蛋白内吞和再循环

为了研究过度表达的Hrs对Tf内吞和再循环的影响，将内源性Tf受体水平较低的BHK细胞与人Tf受体共转染，并显示Hrs结构。在痘苗接种系统中，共转染水平大于95%，未转染细胞仅在较小程度上影响了测定的内吞作用。使用基于电化学发光检测的ORIGEN分析仪（IGEN Inc.，Rockville，MD）测量Tf的内吞和再循环。人类holo-Tf（西格玛，密苏里州圣路易斯）被标记为N个-羟基琥珀酰亚胺酯化三（联吡啶）螯合钌（II）（Ru-tag）（IGEN Inc.）符合制造商说明，并同时标记可还原NHS-SS-生物素（Pierce）用于再循环测量，或标记生物素-LC-硫NHS酯（IGEN Inc）用于内吞研究。为了测量Tf循环，用HEPES培养基洗涤转染的BHK细胞两次，并在37°C下与Ru-tag标记的Tf（50 ng/ml）在BSA（2 mg/ml）存在下孵育30分钟。然后用0.1 M 2-巯基乙磺酸（MESNA）处理部分细胞1 h，以减少细胞表面结合的Tf中的SS-键生物素。使用链霉亲和素珠（挪威奥斯陆戴纳尔）和ORIGEN分析仪在细胞裂解液中仅检测到Ru-标记且仍生物素化的Tf。用MESNA处理的细胞对应于内吞的Tf量，而未处理的细胞则对应于与细胞相关的总Tf量。将一部分MESNA处理的细胞在37°C下再培养2–15分钟以进行循环测量，并用MESNA重新处理以去除任何表面结合Tf的信号。对于内吞实验，将细胞与Ru-tag标记的Tf培养15分钟以测量总细胞相关Tf。用2 mg/ml蛋白酶（Sigma）去除表面结合的Tf后，测量细胞内Tf。