染色质组装因子1最大亚单位的二聚体：重要性在体外和期间爪蟾早期开发

p150 CAF-1蛋白进化保守的自结合特性及其对核小体组装活性的要求

hp150保守的C末端三分之一（Cter）与其相互作用爪蟾双杂交筛选中的对应物提出了两个问题：（i）相互作用是否是直接的，以及（ii）p150 Cter的同源二聚或多重聚是否可以在同一物种中发生。

我们首先通过组氨酸标记的hp150衍生物与谷胱甘肽在细菌中的共表达来测试种间相互作用S公司-转移酶（GST）标记的xp150对应于我们的双杂交筛选中最初检索到的部分（氨基酸540–896）（图2A、 左）。GST–xp150衍生物可以与hp150（620–938）肽特异结合，但不能与hp150，hp150是一种短58个氨基酸的肽（图2A、 左侧，第2、3和5、6车道）。这种相互作用在高达1 M盐萃取时是稳定的。在同一物种中，His的组合在细菌中的表达₆和GST hp150衍生物（图2A、 中间）再次证明了需要这段58个氨基酸的自相互作用特性（图2A、 中间，车道2、3和5、6）。酵母双杂交试验证实了这些相互作用（数据未显示）。我们还在爪蟾.全长His₆-标记的xp150可以与GST–xp150（540–986）衍生产品交互，但不能仅与GST交互。这种相互作用在高达1 M的盐萃取中也很稳定（图2A、 右侧，第2、3和5、6车道）。此外，由于GST下拉分析中可能发生蛋白质聚集，因此使用在体外翻译³⁵S-标记（未显示）和细菌表达的人类和爪蟾全长p150蛋白。当在梯度中使用生理盐条件时，大多数细菌表达的人和爪蟾全长p150蛋白沉积在与258kDa分子量标准相似的位置（图2B、 WT hp150和WT xp150，以分数17为中心）。值得注意的是，当在相同条件下平行运行时，hp150的关键区域（ED结构域外的残基642-678）中限制为36个氨基酸的内部缺失导致蛋白质沉淀为单体150kDa形式[图2BΔ（642-678），分数13]。当在2 M NaCl存在下进行梯度以中断p150–p150相互作用时，大多数野生型hp150、hp150Δ（642-678）突变体和xp150表现为单体150kDa蛋白质（图2B） ●●●●。

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图2。种间和种内p150二聚体：染色质组装中关键结构域和作用的鉴定。(A类)通过GST下拉分析进行p150自结合。左图：GST–xp150（540–896）在细菌中共同表达(Studier等人，1990年)包含标记有His的hp150（620-938）或hp150（678-938）₆.中间：他的₆-标记的hp150（620–938）与GST–hp150（620–938）或GST–hp150（678–938）在细菌中共表达。右图：等量的单独细菌提取物，含有全长His₆-xp150和GST–xp150（540–986）在2 M NaCl下混合；通过连续稀释将盐浓度降低至350 mM NaCl，然后添加谷胱甘肽–Sepharose树脂。谷胱甘肽-Sepharose树脂的蛋白质生产和纯化基本上如所述(Moggs等人，2000年). 用抗-His探针的western blot检测His标记的hp150蛋白的共纯化₆使用特异性抗xp150血清566检测xp150蛋白。一、 输入；B、 结合分数；B*，1 M耐氯化钠结合分数。他的位置₆-hp150（620–938）和他的₆-指示hp150（678–938）。星号标记降解产物。(B类)p150蛋白的甘油梯度沉淀。细菌产生的重组蛋白野生型hp150、hp150Δ（642-678）和野生型xp150沉淀在10-40%的线性甘油梯度上。梯度的每一秒都在SDS–PAGE上进行。蛋白由特异性抗hp150和抗xp150血清在蛋白印迹上检测。凝胶上方显示了每个梯度的分子量标准物的沉降位置：BSA（66 kDa）和过氧化氢酶（258 kDa”）。箭头表示蛋白质的平均位置。梯度中使用的盐浓度如图所示。(C)在hp150Δ（642-678）存在下通过超螺旋进行染色质组装分析。pBscript控制（–）和紫外线照射（500焦耳/米²)如图1D所示，用S100提取物（-）或S100提取物辅以HeLa核提取物（NE）或在体外翻译的hp150野生型（泳道5-6）、hp150Δ（642–678）和xp150野生型。显示了松弛/刻痕（Ir，II）和超螺旋DNA（I）的位置。

因此，p150 CAF-1亚单位的自结合主要涉及人类和人类的二聚体形式爪蟾，并需要在蛋白质的C末端三分之一的ED结构域外保留36个氨基酸。值得注意的是，通过数据库搜索该基序并没有检索到任何其他蛋白质，这表明它是p150特有的。基于这些数据，我们使用在体外染色质组装的测定与上述紫外线损伤DNA的修复相结合。体外翻译的野生型人类和xp150以及hp150Δ（642-678）突变体用于补充S100提取物。全长人和爪蟾p150促进核小体组装到受损DNA上的效率与提供功能性CAF-1复合物的核提取物一样高（图2C、 车道4、6和10）。相反，hp150Δ（642-678）突变体不具有同二聚体（图2B） 未能补充S100提取物（图2C、 泳道8）。因此，被发现对p150自结合至关重要的36个氨基酸基序的缺失也会削弱p150的染色质组装能力在体外.

早期爪蟾胚胎中表达的人类CAF-1的最大亚单位与爪蟾p150相互作用并阻止发育

发现p150中一个独特的、保守的36个氨基酸片段是蛋白质同二聚体化及其染色质组装活性所必需的，这促使我们考虑使用显性负性策略(赫斯科维茨，1987)研究CAF-1的要求体内. The爪蟾胚胎及其早期快速分裂(Kirschner等人，1985年)是一个理想体内该系统用于测试一个对协调染色质组装与DNA复制和修复可能至关重要的因素的重要性。将编码hp150亚单位的RNA注射到双细胞期的一个卵裂球中爪蟾研究了与xp150的相互作用及其对发育的影响。使用抗xp150或抗hp150抗体对注射了hp150 RNA的胚胎提取物进行免疫沉淀（图三A） ●●●●。如图所示三B、 当在免疫沉淀中使用抗xp150抗体时，发现胚胎中所有可检测到的hp150蛋白都与xp150相关（图三B、 比较车道2和3，hp150）。相反，只有胚胎中的一部分xp150与hp150结合（图三B、 车道4和5，xp150）。这很好地表明外源性表达蛋白的数量在内源性对应物的范围内，并且在我们的实验中hp150没有过度表达。我们还在这些免疫沉淀物中搜索已知与hp150相关的蛋白质，如PCNA(Shibahara和Stillman，1999年;Moggs等人，2000年)和乙酰化组蛋白H4(Verreault等人，1996年). 未发现与人类或爪蟾p150蛋白（图三B、 车道3和5、PCNA、AcK5-H4）。我们还验证了其他组蛋白伴侣如核浆蛋白或N1/N2是否参与了核小体的形成爪蟾卵母细胞或卵子提取物(Dilworth等人，1987年;Kleinschmidt等人，1990年)，与人类或爪蟾p150。在我们的实验条件下，我们没有发现这些蛋白与p150蛋白中的任何一种蛋白有任何显著的共沉淀（图三B、 3、5道，核浆蛋白；和数据未显示）。虽然我们不能正式排除与其他因素的微小或短暂相互作用，但早期胚胎中表达的大多数hp150与内源性xp150结合。

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图3。人类p150表达于爪蟾胚胎与爪蟾第150页(A类)实验方案：爪蟾双细胞阶段的胚胎按照Vize等人（1991年）用纳米注射器（Drummond）将1 ng编码hp150 CAF-1的RNA注入一个卵裂球。对原肠期采集的胚胎进行免疫沉淀分析。(B类)使用顶部所示的抗xp150抗体、抗hp150抗体或对照抗体对注射有hp150 RNA的胚胎提取物进行免疫沉淀。不同组分的蛋白质印迹：I，输入；S、 上清液；P、 颗粒。多克隆573和566抗体分别检测hp150和xp150；PC10单克隆抗体检测PCNA；单克隆PAC35抗体核浆蛋白；组蛋白H4通过多克隆抗H4AcK5抗体在Lys5处乙酰化。

然后我们分析了hp150在早期爪蟾胚胎及其与xp150的种间关联对发育有任何影响。蛋白质的外观通过蛋白质印迹并行监测（图4A、 底部）。对照胚胎，仅注射缓冲液或编码绿色荧光蛋白（GFP）的RNA作为细胞谱系标记，发育正常（图4A、 缓冲液和GFP RNA）。在后一种情况下，在中囊胚转变（MBT）周围可见的GFP荧光在胚胎的一侧广泛分布，但在另一侧几乎不存在（图4A、 GFP RNA），如前所述(Zernicka-Goetz等人，1996年). 相比之下，注射hp150 RNA严重影响胚胎发育，胚胎发育未达到囊胚中期阶段（图4A、 hp150+GFP RNA）。这次逮捕爪蟾当注射1 ng编码hp150的RNA（胚胎注射的常规量）时，可重复获得早期发育(Vize等人，1991年). 然而，RNA<100 pg的量无效，这表明必须达到hp150表达的阈值，可能是为了定量滴定内源性xp150以诱导发育干扰。由于这些异常胚胎只有在注射hp150 RNA时才能检测到，因此我们可以排除由于微量注射本身或外源RNA过度表达造成的非特异性效应。重要的是，在MBT之前，在没有显著转录的活跃分裂期间的作用时间，以及检测来自胚胎注射侧的大细胞（图4A、 参见白色箭头，图4C） 认为细胞周期进展存在缺陷。为了更仔细地检查这些异常的大细胞，在检测到GFP的早期原肠胚阶段，对注射了缓冲液和hp150+GFP RNA的胚胎进行冷冻切片（图4B） ●●●●。值得注意的是，在联合注射GFP和hp150 RNA的胚胎中，检测到GFP的区域没有出现4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（图4B、 顶部和底部，hp150+GFP RNA，白色箭头），而在只注射缓冲液的胚胎中观察到正常的DAPI染色。抗hp150单克隆抗体（mAb1）的免疫荧光染色证实hp150的分布与GFP谱系标记的分布重叠（图4B、 底部，GFP+hp150）。因此，我们得出结论，在这个发育阶段，hp150的表达与正常细胞核的检测不兼容。

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图4。人类p150表达于爪蟾胚胎特别干扰早期发育。爪蟾胚胎注射RNA，如图3A所示。(A类)在23°C下，胚胎发育后注射：缓冲液、2 ng编码GFP（GFP）的RNA或编码GFP和hp150 CAF-1的RNA混合物（hp150+GFP）各1 ng。受精后时间及相应的发育阶段(Nieuwkoop和Faber，1994年)显示。受精后指定时间记录的胚胎图像显示为可见通道和GFP通道的融合。白色箭头表示缺陷首次可见的胚胎区域（MBT前，右上角）。显示比例尺。对于每个阶段，使用多克隆573抗体通过western blotting（底部）监测注射缓冲液（–）或hp150+GFP RNA（+）的胚胎中hp150的表达。(B类)在原肠胚形成早期选择注射缓冲液和hp150+GFP RNA的胚胎进行冷冻切片和免疫检测。注入的RNA或缓冲区显示在左侧。上图：用DAPI染色以显示DNA的整个胚胎切片，在明亮的区域（左栏）观察到DAPI（DNA，中栏）和GFP（右栏）荧光的适当滤镜，如图所示。底部：对胚胎冷冻切片进行免疫荧光处理，并使用单克隆抗体mAb1检测hp150。DNA（由DAPI显示）、GFP和hp150（德克萨斯红）荧光由顶部所示的适当过滤器记录。白色箭头表示GFP和hp150表达但DAPI染色缺失的区域。比例尺显示在底部。(C)相同的MBT前爪蟾胚胎，如（A）所示。对于每种情况，右侧显示注射区域的放大倍数较高。比例尺显示在底部。

二聚化所需的p150的36个残基对于在胚胎中产生负干扰至关重要

下一步是确定对二聚化至关重要的hp150结构域是否对产生在体内干扰试验。hp150的各种截断形式在爪蟾胚胎（图5A） ●●●●。通过western blotting（数据未显示）验证等效表达水平，以比较对胚胎发育的影响。注射对应于缺乏ED或KER盒的hp150形式的RNA会产生与野生型hp150相当的发育缺陷（图5A、 重量，ΔED；和数据未显示）。由于hp150中含有ED和KER盒的区域被提议用于介导与组蛋白的相互作用(考夫曼等人，1995年)，简单的组蛋白滴定似乎不太可能解释观察到的表型。这与图中所示的免疫沉淀结果一致三重要的是，当注射的RNA编码一个缺乏蛋白质保守的C末端三分之一的hp150突变时，发育是正常的[图5A、 （1–649）]。因此，我们在胚胎中表达了hp150的后一个区域，并发现它足以产生异常表型[图5A、 （620–938）]。接下来我们测试了不能二聚化的p150突变体在体外对早期有影响爪蟾发展。注射缺失自结合关键域的截短型hp150的RNA编码[图5A、 （678–938）]，以及缺少此内部域的全长hp150[图5A、 Δ（642-678）]，不影响胚胎发育。这些结果与CAF-1最大亚单位介导早期胚胎发育停滞的种间关联一致。

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图5。p150的二聚化结构域需要扰动爪蟾早期开发。(A类) 爪蟾将编码全长hp150（WT）和截短形式hp150 RNA的缓冲液或RNA注入胚胎：（1-649）、ΔED、（620-938）、（678-938）和Δ（642-678），如侧面所示。在发育的第9和36阶段（根据对照胚胎判断），在解剖显微镜下记录图像。白色箭头指向胚胎中缺陷首次可见的区域。显示比例尺。(B类)注射如（A）所示，但RNA编码全长xp150（WT）或xp150（540-896）。右侧显示了hp150和xp150蛋白质的示意图以及每个物种的二聚体结构域的序列比对。

与显性负效应一致，注射编码xp150 Cter的mRNA（氨基酸540-896）也会损害胚胎发育[图5B、 （540–896）]而注射全长xp150 RNA的胚胎没有受到干扰（图5B、 重量）。后一结果使我们排除了仅仅由于CAF-1 p150亚单位的剂量变化而产生的毒性作用。总之体内早期干扰爪蟾由hp150或xp150蛋白截短介导的发育需要p150的C末端三分之一存在36个残基，这些残基对其二聚化至关重要，并且在人类和人类之间保守爪蟾蛋白质（图5，右侧）。

hp60的共表达拯救了由hp150表达介导的发育缺陷

值得注意的是，注射编码hp60（CAF-1的中间亚单位）的RNA在单独注射时并没有改变胚胎发育（图6，hp60），但可以抵消全长hp150表达引起的影响（图6A） ●●●●。以同样的方式，联合注射hp60 RNA抵消了hp150（620-938）表达引起的影响，hp150包含p150二聚结构域，能够与hp60相互作用在体外，但无法支持CAF-1活动(考夫曼，1995年)（图6B） ●●●●。这种效应也再次证明了与CAF-1相关的干扰。此外，hp60可以抵消hp150（620-938）引起的干扰（图6B） 表明hp60的作用是滴定出胚胎中表达的hp150，而不是形成功能复合物。

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图6。hp60的表达抵消了hp150表达引起的发育障碍。(A类)胚胎注射编码hp60或hp150的RNA，或如左图所示与hp60和hp150共同注射（各1 ng）。在发育的第9和33阶段记录图像。比例尺显示在底部。(B类)除注射hp150（620-938）外，其他注射方法如（A）所示。

人类和爪蟾p150亚单位的二聚体：CAF-1活性的调节开关？

通过使用酵母双杂交系统，在体外结合分析和沉淀分析表明爪蟾p150 CAF-1亚单位可以通过其C末端结构域进行同源二聚化（图2A和B）。p150蛋白的这种保守特性需要36个同源氨基酸（图1A和​和5，5（右）解释了物种间的相互作用。hp150中该区域的缺失消除了p150二聚体的形成（图2A和B），最重要的是，削弱了其促进染色质组装的能力在体外（图2C） ●●●●。此外，干扰分析如图所示7C认为CAF-1–p150二聚体积极参与核小体组装的功能重要性。这些数据不仅为体内hp150表达的影响也对CAF-1功能的机制有强烈的暗示。

人们很容易推测，p150亚单位在同二聚体和二聚体形式之间交替存在，并且这些形式表现出不同的相互作用特性。一种可能性是CAF-1复合物的内在成分，即p60和p48蛋白，将不能同样好地与这些形式结合。在这种情况下，值得注意的是，基于免疫沉淀实验(史密斯和斯蒂尔曼，1991年)有人建议，可能有一部分p150与p60无关。其他相互作用也可以由p150的单体状态调节，对染色质组装反应产生主要影响，例如与PCNA以及组蛋白H3和H4的结合。因此，探索单体p150突变体是否能够与PCNA以及组蛋白H3和H4结合的未来实验将非常有趣，并将为CAF-1功能的机制提供重要的见解。无论如何，这些可能含有p150的复合物之间的动态循环可用于调节CAF-1活性。DNA损伤的存在(Gaillard等人，1996年;Martini等人，1998年)或者早期胚胎发生的快速细胞分裂增加了对CAF-1的需求，这可能会影响p150复合物之间的平衡。这种平衡的调节可以通过结合一个尚未确定的因子来完成，或者通过翻译后修饰，如磷酸化/去磷酸化，因为p150的各种磷酸化形式确实存在(史密斯和斯蒂尔曼，1991年;马尔海内克和克鲁德，1998年;Martini等人，1998年;Keller和Krude，2000年). 因此，干扰p150复合物之间的快速转换将损害CAF-1依赖的染色质组装活性体内.

染色质组装分析

DNA修复和染色质组装的分析按所述进行(Gaillard等人，1997年). 简单地说，模拟处理或紫外线照射的圆形pBscript质粒（500 J/m²)与一起孵育爪蟾胚胎提取物（HSE）（模拟或xp150耗尽），S100人细胞溶质提取物(史密斯和斯蒂尔曼，1989年)是否辅以HeLa核提取物(Martini等人，1998年),在体外在[α]存在下翻译或纯化细菌产生的蛋白质或HSE-³²P] dCTP在23（HSE）或37°C（S100）下持续3小时。通过琼脂糖凝胶电泳、凝胶干燥和X射线胶片曝光检查超螺旋和DNA合成的程度。

免疫学程序

注射纯化的GST–xp150（540–896）和His后，获得多克隆抗xp150抗体（血清566）和抗hp150抗体（血浆573）₆-兔体内的hp150（620-938）蛋白质（AgroBio，Villeny）。通过将200µl血清与5–10µg纯化的GST或His孵育，对两种抗体进行亲和纯化₆硝化纤维条上的融合蛋白(Smith和Fisher，1984年).

对于免疫耗竭，将50µl HSE与与蛋白A–Sepharose结合的等体积抗xp150抗体（566）在4°C下混合30分钟。离心后，上清液在用于染色质组装反应之前进行第二轮消耗。

通过在缓冲液E[20 mM HEPES–KOH pH 7.5、250 mM蔗糖、50 mM KCl、2中均质制备胚胎提取物。5 mM氯化镁₂，1 mM二硫苏糖醇（DTT），0.1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF），10 mg/ml胃蛋白酶抑制素和亮氨酸蛋白酶抑制剂]，并在10万克在4°C下保持30分钟。对于免疫沉淀，将清除的胚胎提取物与等体积的抗xp150亲和纯化抗体（566）或抗hp150亲和净化抗体（573）在4°C下孵育1小时。使用在缓冲液E中平衡的蛋白A–Sepharose（Pharmacia Amersham Biotech）浆液（50µl）来提取抗体。

用多克隆抗hp150 573抗体（1/1000稀释）、多克隆抗xp150 566抗体（1/100稀释）、单克隆抗核纤溶酶PAC35抗体（1/500稀释）在western blot上检测蛋白质(迪尔沃思等., 1987)、单克隆抗PCNA抗体（PC10，DAKO，1/500稀释）、多克隆抗H4AcK5抗体（1/500稀释度）(特纳和费罗斯，1989年)和反他的₆抗体（圣克鲁斯，1/000）。使用辣根过氧化物酶结合的抗鼠或抗兔二级抗体和SuperSignal底物检测试剂盒（Pierce）进行可视化。

对于免疫荧光，胚胎在2%多聚甲醛、15%蔗糖和0.1×MBS[88 mM NaCl、1 mM KCl、0.41 mM CaCl中固定过夜₂，0.33 mM钙（NO_三)₂，0.82 mM硫酸镁₄，2.4 mM NaHCO_三，10 mM HEPES–KOH pH 7.4]溶液，嵌入TissuTek（樱花）中，并在液氮冷却的异戊烷中深度冷冻。使用低温恒温器（徕卡）制备5µm的冷冻切片。将切片吸附在Superrost plus载玻片上，并保存在-20°C下。使用mAb1（1/100稀释）检测人类p150(Smith和Stillman，1991年)和德克萨斯州红偶联二级抗体(马提尼等1998年).

重组蛋白，GST下拉

重组蛋白通过转化BL21（DE3）细菌共同表达(Studier公司等., 1990)包含pET30-hp150（620-938）质粒或pET30-hp150（678-938）带有pGEX4T-hp150（630-938，pGEX4-hp150（678–938）或pGEX6T-xp150（540–896）的质粒。用0.4mM异丙基-β诱导后-d日-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在30°C下保持1.5 h，细胞在缓冲液A（20 mM Tris–HCl pH 8，150 mM NaCl，0.1%NP-40，1 mM EDTA，1 mM DTT，0.1 mM PMSF，10 mg/ml胃蛋白酶抑制素和亮氨酸蛋白酶）中溶解，并将可溶性部分与谷胱甘肽–Sepharose 4B树脂（Pharmacia Amersham Biotech）在4°C下培养1.5 h。在缓冲液A中进行大量洗涤后，用缓冲液A内的1 M NaCl萃取树脂。通过直接在SDS–PAGE样品缓冲液中重新悬浮洗涤的树脂，回收与树脂结合的总蛋白(莱姆利，1970年). 如上所述，生产含有野生型hp150、hp150Δ（642-678）和野生型xp150的细菌提取物。根据制造商的建议，在镍柱（Pharmacia）上纯化蛋白质，然后用HSE提取缓冲液进行透析(盖拉德等., 1997).

体外转录-翻译和甘油梯度

蛋白质被翻译在体外使用TNT网织红细胞裂解物偶联的DNA构建物pβhp150/RN3、pβhp150Δ（642-678）/RN3和pβxp150/RN4在体外转录-翻译系统（Promega）遵循制造商的说明。将缓冲液G（20 mM Tris，100 mM或2 M NaCl，0.025%NP-40，2 mM EDTA）中连续10–40%的甘油梯度倒入5 ml试管中。50µl等分样品在体外在10 000下旋转10分钟后，将添加150µl缓冲液G的翻译蛋白或细菌提取物加载到梯度顶部克温度为4°C。将牛血清白蛋白（BSA；66kDa）和过氧化氢酶（258kDa。样品在SW55贝克曼转子中以45 000转/分的速度在4°C下离心18小时。对收集的每个组分（200µl）测量折射率，以验证梯度是否相同。

DNA构建物

质粒pPK8(考夫曼等人，1995年)用于PCR克隆hp150的以下片段（括号中显示了第一个和最后一个氨基酸）：hp150（1-649）到pET30载体（His₆标签，Novagen）；hp150（678–938）并入pGEX4T-1（GST标签，Pharmacia）；和pET30载体。从质粒pNLX-hp150（620-938）中切下hp150（62 0-938）（参见双杂交筛选）并插入pGEX4T-1和pET30载体。质粒pPK8和pED(考夫曼等人，1995年)用PCR将全长野生型hp150、hp150（1-649）和hp150ΔED克隆到pβGFP/RN3质粒中(Zernicka-Goetz等人，1996年). 为了产生hp150Δ（642-678），生成了两个PCR片段，一个编码hp150（1-642），另一个编码hp150（678-938）。将这些PCR产物混合，用作第二次PCR的模板，引物退火第一片段的5′和第二片段的3′。PCR产物hp150Δ（642-678）被克隆到pβGFP/RN3中。在我们的双杂交筛选中检索到的xp150（540–896）被克隆到pGEX4T-1中。完整的xp150 cDNA被克隆为生态RI–不是我分裂成生态RI–不是I-裂解pβGFP/RN3P载体，生成pβxp150/RN3。将野生型hp150、hp150Δ（642–678）和xp150从pβ/RN3质粒亚克隆到pET30中，以产生His₆融合。