帕金森氏病（PD）是一种神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能神经元逐渐丧失，剩余的黑质神经元出现细胞内包涵体，称为路易小体和路易神经节。虽然帕金森病最常见的形式是散发，但也有一些罕见的家族性帕金森病病例被描述。在几个常染色体显性帕金森综合征家系中发现了α-突触核蛋白（α-syn）基因（A53T和A30P）的两个错义突变(1，2). 此外，α-syn是散发性帕金森病路易体和路易神经炎的主要成分之一(三，4). α-Syn是一种140 aa的突触前神经终末蛋白，似乎是天然展开的，约占大脑中细胞溶质蛋白的1%(5). α-syn基因敲除小鼠的产生支持突触前活性依赖性多巴胺释放负调控因子α-syns的作用(6). 这些发现支持α-syn在黑质纹状体多巴胺途径中的重要作用，从而在PD的发病机制中发挥重要作用，并为基于突变的α-syn过度表达建立啮齿动物模型提供了理论基础。
PD的遗传动物模型再现了人类疾病的病理和细胞神经退行性方面，可能为这种神经疾病的发病机制提供了机制性见解。最近，通过过度表达野生型或突变型人类形式的α-syn，产生了转基因小鼠和苍蝇模型(7–10). 转基因果蝇表现出成年期多巴胺能神经元的丢失和路易体样内含物的形成(10). 相比之下，转基因小鼠模型只表现出轻微的神经病理学，偶尔有内含物，但没有多巴胺神经元的丢失(7–9，11，12). 人类α-syn的表达水平可以解释这两种模型之间的差异。为了克服啮齿类动物细胞变性的缺失，我们研究了一种经典转基因的替代方法，用于开发帕金森病的遗传模型。我们在受人类疾病影响的大脑区域局部注射表达正常或突变α-syn的HIV-1衍生慢病毒载体。直接黑质内注射表达野生型或突变型α-syn的病毒载体具有多种优势：(我)可以在哺乳动物物种而不是小鼠中建立模型，这为建立这种神经退行性疾病的非人类灵长类遗传模型打开了潜力；(ii（ii）)可以针对特定的大脑区域，而不用担心其他中枢神经系统结构中α-syn表达的影响；(三)与转基因技术相比，目前可用的慢病毒载体有望获得更高的基因表达，而转基因技术最近补充了可诱导形式，允许进行基因剂量实验；(iv（四）)载体操作的便利性可能会加快多种遗传模型的创建。
HIV-1衍生慢病毒载体因其对神经细胞的强嗜性而成为中枢神经系统最有希望的基因转移载体之一(13，14). 在大鼠和小鼠的纹状体中，90%以上的转导细胞是神经元(14–17)在灵长类动物中，80-88%为NeuN阳性(18). 注射慢病毒载体的小鼠和大鼠的黑质中转导了40%至50%的酪氨酸羟化酶免疫组织化学鉴定的多巴胺能神经元(16，17). 由于重组慢病毒载体能有效感染神经元并允许高水平的蛋白质表达，我们研究了慢病毒介导的人类α-syn野生型（HWT）或突变型（A53T和A30P）的过度表达是否导致α-syn-神经元的充分积累，从而诱导大鼠黑质多巴胺能神经元的变性。我们还通过表达大鼠野生型α-syn形式来研究α-syn-诱导毒性的特异性。
方法
立体定向注射与免疫组织学。
将慢病毒载体注射到大鼠的右侧黑质中，如所述(16). 为了靶向黑质，在以下前、侧和腹侧坐标（4.8、2、7.7和5.5、1.7、7.7）的两个部位（每个部位2.5μl，每毫升200000 ng p24）进行立体定向注射。每组注射五只动物，并按照描述对其大脑进行处理(16). 简言之，用PBS经心灌注动物，用4%多聚甲醛固定其大脑并转移到25%蔗糖中。取大鼠脑黑质和纹状体的冠状切片（25μm厚），进行免疫组织学标记。用亲和纯化兔抗体检测α-syn内含物，该抗体是针对101-124-aa人类α-syn（1:1000）序列产生的，并用抗生物素-生物素过氧化物酶（ABC）检测试剂盒（Vector，Burlingame，CA）检测。
为了进行免疫荧光标记，使用了以下主要抗体：酪氨酸羟化酶（TH）羊抗体（1:500，Pel-Freez Biologicals）、多巴胺转运体（DAT）兔抗体（1:50，Chemicon）、α-syn多克隆兔抗体（1:1400）、α-syn-1单克隆抗体（1:400，Transduction Laboratories）检测大鼠α-syn过度表达，人α-合成物特异性单克隆抗体LB509（1:500，Zymed）和谷氨酸脱羧酶（GAD）多克隆抗体（1:400，Chemicon）。尼塞尔染色按经典方法进行。
神经末梢细胞计数和密度。
如前所述，通过荧光显微镜以盲法测定TH-免疫活性（TH-IR）神经元相对于对侧的百分比(16，17). 为了定量γ-氨基丁酸（GABA）神经元，在表达A30P突变的大鼠黑质的12个冠状切片中对GAD阳性神经元进行计数。
为了量化纹状体的TH-IR终末，至少用ABC试剂盒对15个纹状体切片进行TH染色，并用NIH IMAGE 1.4软件评估光密度。通过测量皮层的光密度来评估每个切片中检测到的TH染色背景。最后，将TH-IR终端的密度计算为对侧光密度的百分比。
对于统计分析，通过方差分析（ANOVA）和舍夫可能的最小二乘差异事后检验评估数据的显著性(jmp公司3.0，SAS Institute，Cary，NC）。显著性水平设置为P（P）< 0.05.
银色染色和荧光标记。
银染色用于检测副甲醛固定切片上的蛋白质聚集和退化神经元(20). FD NeuroSilver试剂盒是根据制造商的协议（FD NeuralTechnologies，马里兰州巴尔的摩）使用的。对于共定位研究，分别用ABC试剂盒对选定的黑质和纹状体切片进行α-syn和TH染色，然后进行银染色。
变性神经元也用阴离子荧光素衍生物FluoroJade B染色(21). 切片首先在水中清洗，安装在硅化玻璃载玻片上，并根据供应商手册进行染色（HistoChem，Jefferson，AR）。
透射电子显微镜。
用0.1 M二甲氨基甲酸钠缓冲液灌注动物，并将其固定在2%多聚甲醛和1.5%戊二醛中。对注射了lent-A30P-和lent-LacZ的动物的黑质振动切片进行经典电子显微镜检查。用二氨基联苯胺作为发色团对选定的切片进行α-syn染色，然后将其固定在1%锇中，并将其平铺在人造石中。收集超薄切片，用Philips CM12透射电镜观察。
结果和讨论
α-Syn在大鼠黑质中的过度表达。
我们首先在慢病毒感染的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的Western blots上评估每个载体的功能和表达水平。为了诱导高水平的蛋白表达，在HIV-1衍生慢病毒载体中，在土拨鼠肝炎病毒（WPRE）的上游PGK启动子和下游转录后调节元件之间插入各种α-syn形式(16，18，22). 每个慢病毒载体导致不同α-syn形式的等效过表达水平（图。A） ●●●●。然后我们研究了在大鼠黑质注射编码α-syn的慢病毒载体是否导致显著的转基因表达水平。使用针对人类α-syn的101-124肽产生的多克隆兔抗体显示组织表达。该抗体在Western blot上识别大鼠和人的形态（图。A类)但只检测人类α-syn体内黑质内注射HWT两周后，高比例的TH-IR神经元表达人类α-syn（图。 B–天). 病毒主要扩散到整个黑质区域（致密部、网状部和侧黑质）。
慢病毒介导的α-syn过度表达。(A类)Western blot分析显示正常和突变（A53T和A30P）人和大鼠α-syn在SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系中过度表达。对于相同数量的病毒颗粒，所有α-syn形式的表达水平相似。为非感染细胞（NI）和用编码细胞质LacZ、大鼠α-syn、野生型（HWT）和人类α-syn-突变形式的慢病毒载体转导的细胞加载蛋白质（每车道25μg）。用针对人类α-syn的101-124-aa序列产生的多克隆兔抗体检测19-kDaα-syn-条带（α-syns）。该抗体在Western blot上识别人和大鼠α-syn。通过用α-微管蛋白Ab（α-tub）重制相同的膜来检查蛋白质负载量。(B–天)将编码野生型和突变人类α-syn的慢病毒载体立体定向注射到大鼠的黑质中。黑质多巴胺能神经元被TH抗体特异性标记(B). α-syn多克隆抗体检测显示A30Pα-syn(C类)在注射的半球。对侧未见α-syn染色。双重染色(天（黄色或浅色）显示大部分TH-IR神经元过度表达α-syn。（比例尺=200μm。）
慢病毒介导α-Syn表达后啮齿动物大脑的神经病理学分析。
为了确定慢病毒介导的α-syn过度表达是否导致神经元变性，在病毒注射后5个月对大鼠的黑质TH阳性神经元进行定量。注射编码野生型、A30P和A53T人类α-syn的重组慢病毒分别导致平均35%、33%和24%的TH表达缺失（图。 A类和B). 在所有注射动物中，这种表达缺失仅限于黑质区域。相反，在过度表达大鼠α-syn的大鼠中，未观察到TH-IR神经元的显著减少。携带β-半乳糖苷酶慢病毒对黑质多巴胺能神经元TH表达无影响。
注射编码野生型（HWT）或突变型（A30P，A53T）人类和野生型大鼠α-syn的慢病毒载体的大鼠黑质中多巴胺能特异性标记物（TH，DAT）的表达。(A类)正常或突变人类α-syn的过度表达显著减少TH-IR神经元的数量。编码大鼠α-syn或报告蛋白β-半乳糖苷酶（LacZ）的慢病毒没有观察到TH表达的显著损失。(B)在单侧注射不同慢病毒构建物的大鼠中，表示相对于对侧5个月时TH-IR黑质神经元丢失的直方图。(C类)对A30P突变体在3周和6周时多巴胺能神经元的丢失进行了量化，并与Lenti-LacZ或Lenti-ratα-同步注射动物在5个月时进行了比较。A30P慢病毒介导的损伤代表了6周内发生的一个延时过程。(天)在第3周和第6周对表达A30P的动物进行Nissl和DAT染色，证实随着时间的推移多巴胺能细胞丢失。数值是指平均值±SEM；n个=每组五只动物；*，P（P）< 0.005; §,P（P）< 0.05; *, 与注射慢lacZ的动物相比；§，与慢大鼠在5个月时注射α-syn的动物相比（比例尺=200μm）
为了跟踪细胞退化的时间进程，在慢病毒注射后3周和6周，表达A30P突变或大鼠α-syn的动物的多巴胺神经元数量也被量化（图。C类). 与5个月的数据类似，在过度表达大鼠α-syn的大鼠中，在3周和6周时均未检测到TH表达降低。对于注射表达A30P突变的慢病毒载体的大鼠，TH表达从3周开始逐渐减少，减少15%，到6周达到35%（图。C类). 多巴胺能特异性标记DAT和尼塞尔染色均证实表达A30P突变的动物黑质多巴胺能神经元减少（图。天). 这种相对快速的时间依赖性TH细胞减少可能是由慢病毒载体所达到的大量α-syn积累所解释的。这些数据表明，人类α-syn慢病毒介导的病变表现为6周内发生的一个相当迅速的时间依赖性过程。
在人类α-合成表达动物中观察到的退化过程也与纹状体TH表达的显著降低有关，纹状体是接受黑质神经元多巴胺能投射的大脑结构（图。 A类和B). 纹状体切片进行TH染色，随后进行银染色，结果显示备用多巴胺能纤维中含有神经末梢变性下方的银沉积（图。 C类和天). 与lent-HWT和lent-A30P相反，用lent-A53T进行静脉注射不会导致TH-IR终端的显著损失（图。E类). 内源性大鼠α-syn与人类A53T突变体（位于53位的苏氨酸）天然相同，其存在可能会减弱A53Tα-syn-诱导的退化。
慢病毒注射5个月后，表达不同α-syn形式的大鼠纹状体多巴胺能神经支配。(A类和B)注射lent-LacZ的大鼠纹状体切片(A类)或lent-A30P(B)在黑质的右侧。注射Lenti-A30P的动物显示纹状体同侧TH染色显著减少，而Lenti-LacZ无影响。(C类和天)注射lent-LacZ动物纹状体TH和银的双重染色(C类)或lent-A30P(天). 高倍镜显示，注射A30P的动物TH染色的减少与含有银沉积的退化纤维的存在有关。(E类)定量注射不同α-syn形式的大鼠纹状体TH-IR终末密度。直方图显示野生型和A30P突变体α-syn型TH阳性末端密度显著降低。数值是指平均值±SEM；n个=每组5只动物；*，P（P）< 0.05; §，P（P）< 0.01; *, 与注射Len-LacZ的动物相比；§，与慢反应α-注射动物相比。[比例尺=200μm(C类和天)10μm，放大倍数更高(C类和天).]
为了进一步评估退化过程，使用了荧光染料FluoroJade，这种荧光染料可以选择性地染色退化神经元的细胞体和轴突(21). 在Lenti-LacZ注射的动物和表达人类α-syn的动物的非注射侧均未检测到氟Jade标记的神经元（图。A类). 表达A30P突变的动物黑质中分散的神经元在核周、轴突和树突中显示荧光翡翠标记（图。B). 营养不良的α-突触突起的存在证实了变性过程（图。C类)以及异常肿胀的结构，具有轴突和肌周分布（图。天).
慢病毒介导的α-syn表达诱导的神经病理学。(A类)在Lenti-LacZ注射的动物和表达人类α-syn的动物的非注射侧均未检测到荧光翡翠B标记的神经元。(B)在表达A30Pα-syn的大鼠黑质中检测到分散的FluoroJade B阳性神经元。高倍镜显示，核周和轴突中有一个荧光翡翠B标记的退化神经元。(C类和天)α-Syn染色显示转导的神经元形成营养不良的轴突(C类和异常的α-syn免疫阳性肿胀结构(天)具有轴突和胞体分布。(E类)在过度表达A30Pα-syn的大鼠中，黑质神经元在胞体和神经突中异常积聚细胞质α-syn-免疫阳性聚集物。为了证实内含物的存在，而不是α-syn的特定细胞亚定位，只进行了银染色（深色沉积物）(F类)或结合α-syn染色（红棕色）(G公司). 两种方法都能检测到细胞质内含物（箭头）和广泛的神经炎病理（箭头）。双染色骨料的高倍放大显示包裹体中含有丰富的α-syn。(H（H）–J型)表达A30Pα-syn的黑质神经元的超微结构分析。在两个轴突中均检测到丰富的α-syn免疫反应性聚集(H（H）和我)和细胞体(J型)表达人α-syn的黑质神经元。这些细胞质结构主要表现为散在的颗粒微聚集体，偶尔与线粒体或突触小泡有关(H（H）)和核膜或细胞质膜(J型). 一个退化的细胞，其胞体周围有聚集的聚集体，这表明细胞质中的细胞器丢失，核膜紊乱(J型). 细胞体的大小以及（顶部）观察到的充满突触小泡的静脉曲张与α-syn-阳性结构紧密并列，支持了这种退化细胞是一个神经元。[比例尺=50μm(A类，B、和G公司); 25微米(C类，E类、和F类); 8微米(天); 和0.3微米(H（H）和J型).]
存活的表达α-syn的黑质神经元，无论是人还是大鼠，都在突起和细胞体中积累细胞质α-syn。E类). 为了确认内含物的存在，而不是α-syn的特定细胞亚定位，只进行了银染色（图。F类)或与α-syn免疫染色结合使用（图。G公司)知道路易体和路易神经突在人类疾病中可以通过镀银有效检测(20). 注射了编码人类α-syn的慢病毒的大鼠黑质神经元的神经突和细胞体中的较大内含物中观察到清晰的颗粒银沉积（图。 F类和G公司). 这些神经病理学特征与帕金森病患者观察到的路易体和路易神经节病理非常相似(4). 在表达细胞质β-半乳糖苷酶的对照动物中，没有银染和α-syn染色。几乎所有的银沉积都局限于病毒靶区，并通过α-syn染色进行共定位（图。G公司). 在5个月时，不同人类形态或大鼠α-syn之间的聚集物定位和丰度没有观察到明显差异（数据未显示）。类似于α-syn转基因苍蝇模型(10)，在表达人α-syn或大鼠α-syn-的大鼠中未观察到明显的泛素化（数据未显示）。有趣的是，在帕金森病大脑中，高达10%的内含物对泛素呈阴性(4)，表明含有α-syn的内含物的泛素化可能代表了人类病理学的晚期过程。最近，α-syn也被20S蛋白酶体以泛素非依赖性的方式降解(23). 这些发现可能解释了这种基于病毒的模型中缺乏泛素聚集物的原因。
α-Syn阳性内含物的超微结构分析。
为了阐明这些包涵体的超微结构特征，从表达野生型或突变型人类α-syn的动物的黑质注射慢病毒后5个月，进行透射电镜观察。在两个轴突中都检测到丰富的α-syn免疫反应性聚集（图。 H（H）和我)和电池体（图。J型)黑质神经元。这些细胞质结构主要表现为分散的颗粒微聚集体，偶尔与线粒体、突触小泡有关（图。H（H）)和核膜或细胞质膜（图。J型). 在过度表达α-syn的神经元细胞核中未观察到α-syn-聚集。这些微聚集体显示出一个致密的核心和更弥漫的周围染色（图。我). 颗粒结构的存在也是人类路易体的一个特征(24)，α-syn转基因果蝇(10)和杀虫剂诱导的PD模型(25). 然而，这些包涵体缺乏在人体路易体内发现的典型纤维元素。人和内源性大鼠α-syn的同时存在可能解释了这种纤维结构的缺失。α-syn转基因果蝇中颗粒内含物和纤维内含物的出现支持了这一假设，其中未鉴定出α-syn-同源物。
多巴胺能神经元选择性丢失。
慢病毒注射后5个月，一些TH-IR神经元仍过度表达大鼠α-syn（图。A类). 尽管在过度表达A30P人类突变体的动物中观察到TH-IR神经元的显著丢失，但在黑质损伤区内仍有大量过度表达人类α-syn的非多巴胺能神经元存活（图。A类). 基于这些观察结果，通过量化GABA能的黑质神经元群来评估α-syn诱导损伤的选择性。通过对GAD和α-syn的双重染色，证实了该非多巴胺能性黑色素种群的慢病毒转导（图。B). 在注射编码A30P突变的慢病毒的动物中评估GAD阳性神经元的数量（图。C类). 在黑质慢-A30P注射侧和非注射侧之间没有观察到GAD阳性神经元的差异，这表明对黑质多巴胺能神经元的毒性具有特异性。
人类A30Pα-syn表达诱导损伤的特异性。(A类)慢病毒注射后5个月，对大鼠α-syn或表达A30P的动物进行TH（红色）和α-syn（绿色）双重染色。TH-IR黑质神经元仍然过度表达大鼠α-syn（黄色或橙色），而在过度表达A30P人类突变体的动物中观察到TH-IR神经元的显著缺失。然而，过度表达人类α-syn（绿色）的非多巴胺能神经元在黑质损伤区存活。(B)表达A30P突变体α-syn的大鼠保留GABA能神经元。双重染色显示备用GAD阳性神经元（绿色）转导并高水平表达A30Pα-syn（红色）。表达人α-syn的GABA能神经元呈黄色。(C类)测定未注射和慢-A30P注射侧黑质中GAD阳性神经元的数量。A30Pα-syn的过度表达不会引起GABA能神经元的显著损失。数值参考平均值±SEM。[比例尺=200μm(A类)和50微米(B).]
这种基于慢病毒的α-syn啮齿动物模型再现了PD最显著的特征：(我)α-syn在类似路易体和路易神经突的细胞质结构中的积累(ii（ii）)多巴胺能神经元的选择性变性。正如α-syn转基因果蝇所报道的那样，正常和突变的人类α-syns都会导致神经元变性(10). 虽然这两个α-syn突变体仅能解释罕见的家族性PD病例(26)，散发性帕金森病患者通常表现为野生型而非突变型人类α-syn的异常积聚(27).
考虑到受编码核LacZ的慢病毒载体感染的大鼠黑质中最多有50%的TH-IR神经元被转导(16)在表达人α-syn型的大鼠中，超过一半的潜在转导神经元丢失。因此，一些转导的多巴胺能神经元在人类α-syn积累5个月后仍能存活。在毒性阈值以下表达α-syn的细胞可以抵抗α-syn-损伤。病理表型的可变性是动物模型中蛋白质表达水平的函数(28). 帕金森病患者的观察结果(29)在慢病毒介导的α-syn过度表达中，多巴胺能神经元亚群的脆弱性也可能存在差异。
大鼠α-syn在大鼠体内的表达导致包涵体形成（数据未显示），而TH-IR细胞未丢失，这表明α-syn-聚集体的单独形成不足以诱导细胞死亡。后一个观察结果支持人类α-syn的特定毒性。与大鼠α-syn相反，人类α-syn的积累可能导致有毒低聚物的形成。我们的结果与一些在体外研究结果表明，包涵体形成本身可能不是PD中细胞死亡的致病原因，而是神经元对毒性更强的室前中间产物的保护作用(30，31). 尽管啮齿动物或人类α-合成物都能形成淀粉样纤维在体外，只有人类和啮齿动物α-syn的混合物会导致非纤维、潜在有毒低聚物的积累(32). 这些室前α-合成中间体有效地诱导囊泡膜的破坏(33). 同样，在其他人类疾病中，如聚谷氨酰胺扩张相关疾病中，神经变性过程中内含物的毒性作用目前也存在争议(34).
目前的研究表明，野生型或突变的人类α-syn的过度表达会导致啮齿动物的多巴胺神经细胞死亡。使用慢病毒载体模拟神经退行性疾病为建立非人类灵长类PD遗传模型以及通过在表达抗凋亡或抗凋亡基因的转基因动物中注射编码人α-syn的慢病毒来剖析导致多巴胺能神经元选择性变性的信号通路开辟了新的视角保护蛋白。因此，这种病毒诱导的帕金森病模型可能有助于理解与α-syn相关的潜在致病过程，并有助于开发更有效的帕金森病治疗方法。
