美国国家科学院院刊。2002年6月25日；99(13): 8968–8973.
携带家族性帕金森病相关Ala-53的人α-突触核蛋白→ Thr突变引起转基因小鼠α-突触核蛋白聚集性神经退行性疾病
,*†† ,* ,* ,* ,* ,†§ ,†§¶ ,‖ ,‖和*†§¶
迈克尔·K·李
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
万达·斯特林
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
徐燕群
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
徐雪莹
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
迪克·奎
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
艾伦·S·曼迪尔
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
泰德·道森
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
尼尔·G·科普兰
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
南希·詹金斯
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
唐·L·普莱斯
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖小鼠癌症基因计划，美国国家癌症研究所-弗雷德里克癌症中心研究与发展中心，马里兰州弗雷德里克21702
以下部门*病理学，§神经病学，以及¶神经科学和†约翰霍普金斯大学医学院约翰·霍普金斯-乌达尔帕金森病研究中心，马里兰州巴尔的摩，邮编21205；和‖国家癌症研究所小鼠癌症遗传项目——马里兰州弗雷德里克弗雷德里克癌症中心研发中心，邮编：21702
†转载请求的收件人：美国马里兰州巴尔的摩市拉特兰大道720号罗斯研究大楼558号，约翰霍普金斯大学医学院病理学/神经病理学系，邮编：21205-2196。电子邮件：ude.imhj@eelkm。 由马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院Solomon H.Snyder编辑，2002年5月2日批准
- 补充资料
支持信息
GUID:A09D0BA5-1181-4069-9DBB-11C0E2393A88
GUID:3277D0B5-1BD7-4141-A455-2AEB46419958
GUID:929F17B7-EAD8-4BF4-AA47-D1FFE61879CE
GUID:0828BC5E-5D25-453C-9A1C-C048FFD68527
GUID:D9EA43D8-C19D-4201-929C-6DF3384E7532
GUID:E22969C2-137D-441E-A9AD-41E5C64A9496
GUID:75A1DFDC-2ACB-4695-BA78-D359B11BBF5B
指南：E0C23E0B-36A1-4237-9CAD-021980F513AE
GUID:40574A0F-69C1-4C04-9967-34095228B592
GUID:CE9E9B8A-A11D-434C-B4A1-7450C719906D
摘要
α-突触核蛋白（α-Syn）的突变在少数家族性帕金森病（PD）家系中引起帕金森病。此外，α-Syn-作为路易小体和路易神经节的主要成分积累，这些神经内包涵体是PD的神经病理学特征。为了更好地了解α-Syn生物学改变与PD-相关神经退行性变之间的致病关系，我们培育了多个表达高水平野生型或家族型PD-linked Ala-30的转基因小鼠系→ Pro（A30P）或Ala-53→ Thr（A53T）人α-合成物。表达A53T人α-Syn，但不表达野生型或A30P变异体的小鼠，会发展成成人发病的神经退行性疾病，伴有进行性运动功能障碍，导致死亡。病理学上，受影响的小鼠表现出神经元异常（胞周和神经突），包括α-Syn和泛素的病理积聚。与α-Syn的异常神经元聚集相一致，病理性脑区的去污剂不溶性α-Syn和α-Syn-聚集物增加。我们的结果表明A53T突变体α-Syn引起的体内与其他α-Syn变异体相比的神经毒性。此外，α-Syn依赖性神经退行性变与洗涤剂不溶性α-Syn.的异常积聚有关。
在老年人中，帕金森氏病（PD）是继阿尔茨海默氏病之后第二常见的神经退行性疾病(1). 该病的特征是各种运动功能障碍，包括启动运动困难、运动迟缓（运动迟缓）、僵硬和静止性震颤(1). 这些症状是由于纹状体多巴胺水平降低所致，伴随着黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性(1). 虽然大多数帕金森病的病因尚不清楚，但遗传学研究已经确定了α-突触核蛋白（α-Syn）中的两个突变，A30P和A53T，这两个突变在许多常染色体显性遗传家系中导致帕金森病(2,三). α-Syn是一种由140个氨基酸组成的高度保守蛋白质，主要在神经元中表达，在突触前终末尤其丰富(4–8). 有人认为α-Syn可能在突触可塑性中发挥作用(4,7,9)并可能调节多巴胺能神经传递(10,11). 值得注意的是，在散发性和家族性帕金森病中，α-Syn是路易体（LBs）和路易神经节（LNs）的主要结构成分，而神经内包涵体是帕金森病的神经病理学特征(12,13). 此外，α-Syn与其他几种神经退行性疾病的发病机制有关，包括伴有LBs的痴呆和多系统萎缩(14–17). 因此，α-Syn异常可能在与PD和其他统称为α-Synucleinopathy的疾病相关的神经退行性变中具有重要的致病意义(14,16,17).
α-Syn异常在这些疾病的病理生理学中的重要性得到了转基因果蝇中α-Syn-依赖性神经变性的最新结果的支持(18)转基因小鼠的神经病理学(19,20)腺病毒诱导大鼠多巴胺能变性(21). 然而，目前尚不清楚α-Syn是否会导致哺乳动物进行性迟发性疾病，以及突变的α-Syn-变异体是否表现出差异体内神经毒性。为了更好地了解α-Syn生物学异常是如何导致神经退行性变的，我们研究了在转基因小鼠中表达野生型（WT）和家族性PD-linked突变人类（Hu）α-Syns的后果体内我们报告称，Huα-Syn（A53T）在转基因小鼠中的表达可导致以运动功能障碍为特征的迟发性神经退行性疾病，并进展至死亡。相反，Huα-Syn（WT）水平相对较高或甚至更高水平的Huα-Syn（A30P）转基因小鼠不会出现明显的表型或病理学。Huα-Syn（A53T）小鼠的神经病理学与α-Syn-、泛素和神经丝（NFs）的神经元积聚有关。
方法
Huα-Syn表达载体。
用PCR方法从人脑cDNA中扩增出编码Huα-Syn的cDNA(22)带有一个跨越Huα-Syn密码子1–6的有义引物（5′-gtcgaccatggatttattgaaag-3′）和一个跨越Huα-Ssyn密码子136–141的反义引物。在PCR过程中，通过包含编码A53T（5′-catggtg）的第三个引物，引入家族性PD-linked错义突变一caacagtggctgag-3′）或A30P（5-gtggcagaagcac（c）caggaagac-3′）。将得到的436 bp人类cDNA克隆到pCRII-TA载体（Invitrogen）中。通过DNA测序鉴定合适的克隆。使用以下方法从pCRII载体中释放产生的WT和突变Huα-Syn cDNA萨尔我和Xho公司我克隆到Xho公司I-线性化小鼠朊病毒蛋白启动子（PrP）-转基因小鼠表达载体(23)，生成MoPrP–Huα-Syn（WT）、MoPrP-Huα-Syn（A30P）和MoPrP-Huα-Syn（A53T）。
Huα-Syn转基因小鼠的制备。
如前所述，通过使用MoPrP载体生成转基因小鼠(23). 简单地说不是采用β-琼脂糖法（新英格兰生物实验室）纯化MoPrP-Huα-Syn质粒的I片段，并通过单细胞小鼠胚胎原核注射将转基因导入小鼠生殖系。利用引物检测内源性MoPrP基因组序列和转基因序列，通过尾部DNA PCR分析鉴定创建者和随后的转基因后代(23). 所用引物为编码Huα-Syn密码子4–11的正义引物（5′-ttcgaaaggactttcaaaggc-3′）、编码MoPrP密码子10–25的正义引子（5′-ctctttgactatggactggactgactgagtcgg-3′）和与MoPrP3′-非翻译区（5′-gtggatacccccccagctagacc-3′）互补的反义引物。所有MoPrP–Huα-Syn转基因小鼠系均建立为C3H/HeJ×C57BL6/J杂种，并通过连续回交到C57BL6/J株保持。
抗体。
为了追踪Huα-Syn蛋白在转基因小鼠中的表达，我们用与Huα-Syn（NH-Pro-Val-Asp-Pro）的117-125氨基酸对应的Keyhole帽贝血蓝蛋白结合合成肽免疫新西兰白兔，生成了抗Huα-Syn抗体（HuSyn1），该抗体不会与啮齿类动物α-Syns发生交叉反应-天冬氨酸-格林-Glu-Ala-Tyr-COH）。为了检测啮齿类动物和Huα-Syn，3320系列（位于肯塔基州列克星敦的转导实验室）。我们还使用了以下其他抗体：兔抗β-Syn抗血清（AB5086，Chemicon）；兔抗酪氨酸羟化酶抗血清（Pel-Freez Biologicals）；兔抗泛素抗血清（Dako）；兔抗纤毛酸性蛋白（GFAP）抗血清（Dako）；和小鼠抗磷酸化NF-H亚单位（SMI-31，Sternberger，Baltimore，MD）。
转基因表达分析。
对于mRNA的Northern blot和逆转录-PCR分析，使用Trizol试剂（GIBCO/BRL）从转基因或非转基因小鼠的大脑区域分离总RNA。通过Northern blot分析测定α-Syn mRNA的表达(22,24,25)带有32P标记全长Huα-Syn cDNA探针。α-Syn mRNA表达的分析就地杂交(22)通过使用33Huα-Syn cDNA产生的P标记cRNA探针。
通过SDS/PAGE分离的总SDS可溶性蛋白的免疫印迹分析测定α-Syn和其他蛋白的表达(22,24). 定量免疫印迹分析通过使用125I-结合蛋白A（如上所述）(22,24). 通过在含有蛋白酶抑制剂（5 mM PMSF/10μg/ml抑肽酶/10μg/ml亮蛋白肽/10μg/ml pepstatin）和洗涤剂（0.5%Nonidet P-40）的TNE缓冲液（10 mM Tris·HCl，pH 7.4/150 mM NaCl/5mM EDTA）中均匀化组织来制备非离子洗涤剂可溶性和不溶性组分。离心匀浆（10万×克)收集所得颗粒（P1）和上清液（S1，可溶性）部分。P1在含有TNE的非离子洗涤剂中洗涤一次，所得颗粒（P2，非离子洗涤器不溶）在含有1%SDS的TNE缓冲液中溶解。
为了进行免疫组织化学分析，小鼠在主动脉内灌注PBS，然后灌注4%多聚甲醛。大脑经过冷冻处理(22)或嵌入石蜡(26)部分。冰冻切片和石蜡切片都进行了各种组织化学和免疫细胞化学分析(22,26).
结果
A53Tα-Syn的表达导致迟发、快速进展的神经异常。
为了在小鼠中实现高水平的转基因表达，转基因表达（编码人类WT、A30P或A53T突变体α-Syn的cDNA）由小鼠朊病毒启动子（MoPrP–Huα-Syn。23). 对于每个转基因构建物，确定了12到23个创始人，并且后代来自至少6个转基因拷贝数最高的创始人。在对后代的转基因表达进行初步分析后，从大脑中转基因表达水平高、中、低的创始人中建立了系。
转基因衍生mRNA的分析（图。一)和蛋白质（图。 b条和c（c）)在转基因小鼠的大脑中显示出高水平的Huα-Syn表达。MoPrP–Huα-Syn转基因小鼠大脑中总α-Syn-蛋白（人和小鼠结合）的水平是非转基因小鼠的4–15倍（图。 一和b条).现场杂交分析显示转基因衍生的Huα-Syn mRNA在所有脑区广泛表达（图。 一–d日). 尽管在胶质细胞中观察到一些表达，但主要的表达与神经元相关，包括SNpc中的神经元（图。 c（c）和d日). 使用HuSyn-1兔多克隆Ab进行的免疫细胞化学分析显示，所有三种Huα-Syn变体都出现在神经纤毛的点状结构中，这一发现与突触前末端蛋白质的富集一致（图。 e（电子）和如果).
Huα-Syn在转基因小鼠中的表达。(一)使用Huα-Syn cDNA探针对非转基因（ntg）同窝小鼠、MoPrP–Huα-Syn（WT）转基因小鼠（系B2-1、B2和I2-2）、MoPr–Hu al-Syn（A53T）转基因鼠（系L5、N2-5、H5和G2-3）和MoPrP-Huα-Syn（A30P）转基因鼠的大脑总RNA进行Northern blot分析。放射自显影显示Huα-Syn mRNA在转基因小鼠的大脑中高水平表达。由于Hu-和Moα-Syn之间的序列同源性，cRNA探针还检测内源性Moα-Syn mRNA（Mo）。(b条和c（c）)MoPrP–Huα-Syn转基因小鼠α-Syn-多肽的免疫印迹分析。非转基因和转基因小鼠的总脑蛋白（车道与一)用HuSyn-1兔多克隆抗体进行免疫印迹分析(b条)或Syn-1(c（c）)，一种抗泛α-Syn单克隆抗体。
转基因小鼠中Huα-Syn表达的细胞定位。(一和b条)现场Huα-Syn转基因小鼠脑内Huα-Syn mRNA表达的杂交分析。反义(一)和控制感(b条)Huα-Syn mRNA探针显示，Huα-Syn在大多数脑区高水平、广泛表达。(c（c）和d日)为了确定Huα-Syn mRNA在转基因小鼠的SNpc中表达，对相邻切片进行处理就地杂交(c（c）)酪氨酸羟化酶免疫细胞化学(d日). 箭头显示了SNpc中多巴胺能神经元的位置。(e（电子）和如果)MoPrP–Huα-Syn转基因小鼠脑中Huα-Syn多肽的免疫细胞化学分析。非转基因小鼠冠状脑切片(e（电子）)和来自I2-2的Huα-Syn（WT）转基因小鼠(如果)用HuSyn-1抗血清进行免疫反应。Huα-Syn多肽的点状、神经纤维定位与突触末端α-Syn的富集一致。Huα-Syn（A53T）和Huα-Syn（A30P）的免疫细胞化学分析结果与WT蛋白相似。ctx，皮层；齿状凹痕。
一旦建立了多个Huα-Syn转基因小鼠系，就对这些小鼠进行神经异常症状跟踪。随着动物年龄的增长，四个已建立的Huα-Syn（A53T）系（G2-3、H5和N2-5）中的三个系的小鼠出现了以持续姿势、振幅降低和大量自发活动为特征的运动症状。在许多情况下，受影响的小鼠似乎表现出运动迟缓、轻度共济失调和肌张力障碍。小鼠最终会逐渐失去翻正反射和瘫痪（图。 一和b条; 图7和电影1，作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org). 在大多数受影响的动物中，疾病在最初发病后14至21天内迅速发展到死亡，可能是因为无法进食和脱水（图。b条). 前30只受影响小鼠的临床异常平均发病年龄G2-3系（A53T）为10.1±1.2个月，H5系（A53T）为15.7±2.7个月（图。c（c）). N2-5系（A53T）受影响小鼠的平均发病年龄为15.7±4.2个月，但≈50%的小鼠在24个月大时没有发病（图。c（c）). 因此，A53Tα-Syn水平较高（G2-3>H5>N2-5；图。)与发病年龄较早和疾病表型外显率较高有关。在剩下的A53Tα-Syn系（L5）中，转基因表达水平与内源性蛋白相当，不足以引起疾病。
Huα-Syn（A53T）的表达导致转基因小鼠的神经异常和寿命缩短。(一和b条)中间的G2-3（AT）转基因小鼠(一)而且很晚了(b条)神经功能障碍阶段。(c（c）)Huα-Syn（A53T）转基因株系的存活曲线。转基因的高表达与疾病的早期发病和死亡有关。
尽管转基因表达水平与A53T系相当，但WT或A30P转基因小鼠即使在24个月大时也没有出现任何明显的神经异常[n个I2-2（WT）=14，n个=28，对于O2（A30P），以及n个T3（A30P）=16]。在WT和A30P系中获得的转基因表达水平足以引起A53T转基因的疾病，因为相似或较低水平的αSyn（A53T）转基因表达会导致这些转基因小鼠的疾病（见图。). 具体而言，I2-2（WT）和T3（A30P）品系中Huα-Syn的水平与H5（A53T）和N2-5（A53T）品系的水平相当。然而，来自I2-2（WT）或T3（A30P）系的小鼠在任何年龄都没有出现神经异常。此外，尽管O2（A30P）系中Hα-Syn的表达水平高于包括G2-3（A53T）系在内的任何其他MoPrP–Huα-Syn-系（图。 b条和c（c）)，来自O2系（A30P）的小鼠没有出现神经异常。因此，WT和A30P Huα-Syn变体对神经元的致病性显著降低体内与A53T突变体Huα-Syn相比。
此前，其他研究人员已经证明WT-Huα-Syn的表达(19)或A53T Huα-Syn(20)导致Rota棒性能的渐进性缺陷，而没有明显的明显神经症状或过早死亡。这些早期的Rotarod表现缺陷与较低运动神经元的缺陷有关(20). 与这些早期的α-Syn转基因小鼠相比，我们的α-Ssyn转基因小鼠在出现神经症状之前没有表现出Rotarod性能缺陷（图8和支持方法，作为支持信息发布在PNAS网站上）。
A53Tα-Syn转基因小鼠的神经病理学异常。
为了确定α-Syn转基因小鼠中与神经异常相关的细胞病理学，采用多种方法对A53T、A30P和WTα-Syn-转基因小鼠的大脑和脊髓进行了检查。因为LBs和LNs传统上与α-Syn、泛素和NF亚单位的异常积累有关(12,13,27–29)，我们询问这些蛋白的分布是否在Huα-Syn转基因小鼠中存在异常。在神经系统受损的Huα-Syn（A53T）小鼠中，α-Syn的免疫染色显示α-Syn-在神经元细胞体和神经突起中有病理性积聚（图。). 一般来说，异常的α-Syn积累仅限于中脑（数据未显示）、小脑（图。 一和哦)、脑干（图。b条)和脊髓（数据未显示）。在Huα-突触核蛋白病理学中，α-Syn的异常分布与泛素的平行积累有关（图。 克–k个)和磷酸化NF-H（图。我)在周核和神经突中。这些α-Syn和泛素的神经炎性堆积高度令人想起Huα-Synucleopathys中的异常。虽然包涵体与LB的致密球形形态不同，但硫黄素-S染色显示，受影响区域的许多神经元含有纤维包涵体，并且疾病的快速发展可能阻止了致密包涵体的形成（图。 米和n个).
Huα-Syn转基因小鼠的神经病理学。(一–c（c）)病态G2-3（A53T）转基因小鼠神经元中α-Syn的病理性神经元积聚。小脑深部核内神经元α-Syn异常积聚(一)，网前核附近(b条)和新皮质(c（c）). (d日和如果)HuSyn-1监测的O2（A30P）小脑深部细胞核内神经元中α-Syn积累增加(一)和Syn-1(b条). 注意α-Syn积累的神经元分布更加均匀。(克–j)患病G2-3（A53T）小鼠的泛素病理学。脑桥中泛素的病理性染色体和神经炎积聚突出(克和小时)和小脑(我). 偶尔出现的皮层神经元(j)也表现出泛素病理学。(k个)尽管来自O2系（A30P）的小鼠体内α-Syn积累（如图所示d日和如果)，这些小鼠不会发生泛素病理。A53T病鼠的其他病理学表现包括小脑深部核内磷酸化NF-H的积聚(我)和硫黄素S-阳性结构(米和插入). (n个)硫黄素-S处理的非转基因小鼠显示为阴性对照米. (哦和第页)α-合成(哦)和泛素(第页)临床前H5（A53T）转基因小鼠Pons的病理学。星号表示核周病理，箭头表示神经炎病理。
对接近发病年龄的Huα-Syn（A53T）系症状前小鼠进行临床体征检查，发现α-Syn-神经元异常积聚（图。哦)和泛素（图。第页). 这些异常在分布和外观上与临床受累小鼠相似，但症状前小鼠的神经元异常在数量和质量上都不太严重。在较年轻（2-4个月大）的Huα-Syn（A53T）小鼠中，α-Syn-和泛素的异常神经元积累不明显（数据未显示）。因此，在Huα-Syn（A53T）小鼠中，神经病理学异常在运动功能障碍的临床表现之前发生，并且随着疾病的进展，病理学恶化。与缺乏临床表型一致，表达Huα-Syn（WT）的小鼠未表现出明显的α-Syn-或泛素异常积累（数据未显示）。来自O2系（A30P）的小鼠表达非常高水平的A30Pα-Syn（见图。)，显示α-Syn的显著染色体积累（图。 d日和如果). 然而，累积的α-Syn似乎分布更均匀，即使在高龄小鼠中，A30Pα-Syn的表达也不会导致泛素在神经元中的累积（图。k个).
由于星形胶质细胞反应是神经退行性改变的可靠指标，我们检查了神经受损的Huα-Syn（A53T）小鼠的脑切片，以检测GFAP免疫反应（图。). GFAP表达的综合调查表明，星形胶质细胞反应在Huα-Syn（A53T）转基因小鼠的受累脑区显著，包括中脑背侧、小脑深部核、脑干和脊髓（图。b条). 相反，皮层、海马、丘脑和尾状核/壳核的GFAP表达没有增加（图。一). 这些结果表明，Huα-Syn（A53T）小鼠的神经异常与中脑、小脑、脑干和脊髓内神经元的区域选择性参与有关。具体来说，脊髓的病理变化包括显著的星形胶质细胞反应以及腹角运动神经元中泛素和α-Syn的积聚。其他大脑区域，如皮层和海马体，没有明显的病理变化。与A30P和WT系小鼠缺乏神经功能障碍类似，WT和A30P系小鼠大脑中的GFAP染色与年龄匹配的对照组相似（数据未显示）。
星形胶质细胞反应仅限于表现出广泛神经病理学的大脑区域。临床感染G2-3（A53T）转基因小鼠的矢状脑切片(一,b条、和插入)和一只年龄相配的同窝老鼠(c（c）和d日)进行GFAP免疫细胞化学分析。G2-3转基因小鼠皮层（ctx）和海马（Hippo）中的GFAP免疫反应(一)表现出很少的病理学，几乎与非转基因（ntg）同窝婴儿的病理学相同(c（c）). 然而，中脑（中脑）和脑干区域(b条)受影响的G2-3转基因小鼠中，GFAP免疫抑制的星形胶质细胞与未转基因的同卵鼠相比明显增加(d日). cblm，小脑。
Huα-Syn（A53T）转基因小鼠的α-Syn-依赖性神经变性与洗涤剂敏感性α-Syn.的积累有关。
为了确定α-Syn的异常积累是否与α-Syn.生化特性的变化有关，将Huα-Syn-转基因小鼠和非转基因同窝小鼠的病理受影响（脑干）和未受影响（皮质）脑区分为非离子洗涤剂-可溶性（S1）和-不溶性（P2）组分。使用Syn-1单克隆抗体对SDS可溶性总蛋白进行的免疫印迹分析显示，两种主要的α-Syn多肽对应于全长α-Syn-多肽（α-Syn16）和一种截短的（α-Sn12）α-Sin多肽，这两种多肽存在于来自Huα-Sn转基因小鼠的所有样品中（图。 一和b条). S1（未显示数据）和P2（图。 c（c）和d日)组分表明，大多数α-Syn与S1组分分离（数据未显示），这一观察结果与α-Syn-是一种细胞溶质蛋白一致(5–8,30). 然而，临床感染的Huα-Syn（A53T）转基因小鼠脑干P2组分中的α-Syn-在数量和质量上与其他P2组份中的α-Syn多肽不同（图。c（c）). 具体而言，受影响的Huα-Syn（A53T）的脑干P2部分含有更多不溶于洗涤剂的全长（≈16-kDa）α-Syn。此外，P2组分还富集了具有较低分子量α-Syn（α-Syn10）和一系列较高分子量α-Syn聚集体的α-Syn。α-Syn的这些生化变化与神经病理学的存在直接相关，因为它们在皮层中没有发现（图。d日)在这些小鼠中相对没有损伤。此外，在较年轻的Huα-Syn（A53T）小鼠中，α-Syn没有发现异常的生化改变（图。c（c）). 最后，对Huα-Syn（WT）和Huα-Syn（A30P）小鼠的平行分析表明，富含P2组分的α-Syns物种对Hu a-Syn（A53T）的表达具有特异性（图。c（c）). 虽然蛋白水解过程和α-Syn聚集体的性质需要进一步研究，但很明显，α-Syn-的蛋白水解过程以及稳定聚集体的形成是α-Syn-dependent神经病理学发病机制的重要组成部分，这也反映在我们小鼠的临床表现中。
神经系统受损的Huα-Syn（AT）转基因小鼠中非离子洗涤剂不溶性α-Syn-多肽的积累。(一和b条)使用Syn-1单克隆抗体对SDS-soluble脑干进行免疫印迹分析(一)和皮质提取物(b条)来自Huα-Syn转基因小鼠和非转基因（nTg）幼崽配偶。在转基因小鼠提取物中，全长α-Syn≈16 kDa（α-Syn16）和截短α-Syn12 kDa。(c（c）和d日)使用Syn-1单克隆抗体对脑干非离子洗涤剂不溶性（P2）组分进行免疫印迹分析(c（c）)和皮层(d日). (d日)临床受影响小鼠脑干（G2-3-Sick和H5-Sick）的神经病理学改变与全长α-Syn（α-Syn16）、截短α-Syns（α-Sn12和α-Syn10）和高分子量α-Syn-多肽积累增加有关。未经病理检查的小鼠脑干中未发现α-Syn的这些生化变化。(d日)与皮层缺乏明显病理学一致，皮层P2组分均未显示异常α-Syn多肽。分子质量标准（凝胶右侧的勾选）为9、13、20、35、50、60、80、111和173 kDa。
讨论
总之，我们已经产生了几种表达高水平WT和家族性PD连接突变体（A30P和A53T）Huα-Syn的转基因小鼠系。Huα-Syn（A53T）的表达导致以运动功能障碍为特征的成年性神经退行性疾病，并迅速发展至死亡。然而，尽管转基因表达水平很高，但来自Huα-Syn（WT）和Huα-Syn（A30P）系的小鼠没有出现神经功能障碍。尽管其他研究表明，Huα-Syn（A53T）或Huα-Syn（WT）的表达与转基因小鼠的神经病理学有关(19,20)和苍蝇(18)，我们的研究清楚地证明，Huα-Syn（A53T）导致显著增强体内与A30P或WT-Huα-Syn变异体相比，哺乳动物的神经毒性。此外，Huα-Syn（A53T）的表达导致进行性神经退行性变导致死亡。虽然增加了体内A53T突变的毒性与A53T突变相比A30P突变与人类更具侵袭性的疾病过程有关是一致的(2,三)表达Huα-Syn（A30P）的小鼠缺乏明显的神经病理学是意料之外的。虽然A30P突变是在一个只有两个受影响成员的小家系中发现的(三)，与A30P突变相关的毒性被认为更大(31,32)，因为A30P是一个非常非保守的变化，而A53T突变实际上是啮齿动物的正常序列(2,三). 因此，Huα-Syn的两个突变可能以不同的方式引发疾病，或者A30P可能是一个罕见的多态性。
除了突变α-Syn的病理特异性外，Huα-Syn-（A53T）依赖性病理的细胞特异性也很显著。尽管转基因在所有脑区都有高表达（参考文献。23; 图。)，只有一部分神经元群受到病理性影响。因此，很明显，即使在可以获得非常高水平突变α-Syn蛋白的转基因小鼠中，特定细胞群体也更容易受到α-Syn-依赖性毒性的影响。值得注意的是，尽管我们就地杂交研究表明，转基因在SNpc中表达，我们没有观察到纹状体多巴胺的显著缺失(支持方法和图9，作为支持信息发布在PNAS网站上）。同样，免疫细胞化学分析未显示纹状体和SNpc中酪氨酸羟化酶或多巴胺转运体表达的任何明显定性变化（数据未显示）。此外，SNpc中的多巴胺能神经元没有明显的神经病理学变化（数据未显示）。SNpc缺乏病理学可能表明啮齿动物SNpc神经元可能比人类SNpc神经元对α-Syn毒性更具抵抗力。这种可能性也得到了转基因小鼠缺乏病理学的支持，其中α-Syn通过酪氨酸羟化酶启动子在多巴胺能神经元中表达(33). 人类和灵长类黑质神经元对帕金森神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP；参考文献。34). 因此，人类和啮齿动物多巴胺能神经元的脆弱性存在明显的差异。
尽管SNpc神经元缺乏明显的病理改变，但已知受影响的区域（红核、脑干、小脑和脊髓运动神经元）会影响小鼠的运动行为。因此，α-Syn小鼠的剧烈运动功能障碍是可以预测的。此外，MoPrP–Huα-Syn（A53T）转基因小鼠中受病理影响的神经元表现出与Huα-synucleopathys中观察到的细胞异常非常相似的细胞异常。具体而言，Huα-Syn（A53T）转基因小鼠的神经功能障碍与α-Syn-、泛素和NFs的异常积累有关。值得注意的是，对来自O2系的Huα-Syn（A30P）小鼠进行的检查显示，神经元α-Syn-积累没有泛素积累（图。 d日,如果、和k个)α-Syn无异常碎裂（图。c（c）). 因此，在转基因小鼠中，α-Syn的神经元积累并不总是导致神经元泛素异常和α-Syn.的异常生化过程。最后，这些小鼠的病理学显然与神经元中泛素的异常积累和α-Syn多肽的蛋白水解处理/聚集有关，因为α-Syn的截短与聚集能力的增加有关(35,36)，对培养细胞产生毒性(37)并在多种Huα-突触核蛋白病中积累(38–41)截短α-Syn积累的生物学基础对于理解PD和其他α-Synucleopathy的发病机制非常重要。
致谢
我们非常感谢Debbi Swing女士在创造本研究所述转基因小鼠方面的技术援助。我们感谢David Borchert博士和Philip C.Wong博士的有益讨论。感谢希尔达·斯伦特女士的技术帮助。特别感谢Anne M.Andrews博士对多巴胺和多巴胺代谢物的神经化学分析。这项工作得到了美国国立卫生研究院AG14248、NS38065和NS38377的支持。
缩写
| PD公司 | 帕金森氏病 |
| 黑质致密带 | 黑质致密部 |
| α-合成 | α-突触核蛋白 |
| LB（磅） | 路易体 |
| 液态氮 | 路易神经节 |
| 重量 | 野生型 |
| 胡 | 人类 |
| 钼 | 鼠标 |
| PrP公司 | 朊蛋白启动子 |
| 法国试验标准 | 神经丝 |
| GFAP公司 | 胶质纤维酸性蛋白 |
脚注
这篇论文是直接提交给PNAS办公室的（第二轨道）。
工具书类
1Fahn S、Przedborski S.In：梅里特神经病学。罗兰·L·P，编辑。Williams&Wilkins，纽约：Lippincott；2000年，第679–695页。[谷歌学者] 2Polymeropoulos M H、Lavedan C、Leroy E、Ide S E、Dehejia A、Dutra A、Pike B、Root H、Rubenstein J、Boyer R等。科学。1997;276:2045–2047.[公共医学][谷歌学者] 三。Kruger R、Kuhn W、Muller T、Woitalla D、Graeber M、Kosel S、Przuntek H、Epplen J T、Schols L、Riess O。自然遗传学。1998;18:106–108.[公共医学][谷歌学者] 4George J M，Clayton D F。神经科学新闻。1998;1:12–17. [谷歌学者] 5Maroteaux L、Campanelli J T、Scheller R H。神经科学杂志。1988;8:2804–2815. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6上田K、福岛H、Masliah E、夏Y、岩井A、吉本M、Otero D A、近藤J、岩原Y、Saitoh T。美国国家科学院程序。1993;90:11282–11286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7戈德特·M·。自然（伦敦）1997;388:232–233.[公共医学][谷歌学者] 8Irizarry M C、Kim T W、McNamara M、Tanzi R E、George J M、Clayton D F、Hyman B T。神经病理学实验神经学杂志。1996;55:889–895.[公共医学][谷歌学者] 9克莱顿·D·F，乔治·J·M。神经科学研究杂志。1999;58:120–129.[公共医学][谷歌学者] 10Abeliovich A、Schmitz Y、Farinas I、Choi-Lundberg D、Ho W H、Castillo P E、Shinsky N、Verdugo J M、Armanini M、Ryan A等。神经元。2000;25:239–252.[公共医学][谷歌学者] 11Lee F J S、Liu F、Pristupa Z B、Niznik H B。美国财务会计准则委员会J。2001;15:916–926.[公共医学][谷歌学者] 12斯皮尔安蒂尼·M·G、施密特·M·L、李·V·M·Y、特洛伊亚诺夫斯基·J·Q、杰克斯·R、戈德特·M。自然（伦敦）1997;388:839–840.[公共医学][谷歌学者] 13斯皮尔甘蒂尼·M·G、克劳瑟·R·A、杰克斯·R、长谷川·M、戈德特·M。美国国家科学院程序。1998;95:6469–6473. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14迪克森·D·W。Curr Opin Neurol公司。2001;14：423–432。[公共医学][谷歌学者] 15Galvin J E、Uryu K、Lee V M、Trojanowski J Q。美国国家科学院程序。1999;96:13450–13455. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Galvin J E、Lee V M Y、Trojanowski J Q。Arch Neurol（芝加哥）2001;58:186–190.[公共医学][谷歌学者] 17Goedert M，Spialantini M G。分子精神病学。1998;三:462–465.[公共医学][谷歌学者] 18Feany M B，Bender W W。自然（伦敦）2000;404：394–398。[公共医学][谷歌学者] 19Masliah E、Rockenstein E、Veinbergs I、Mallory M、Hashimoto M、Takeda A、Sagara Y、Sisk A、Mucke L。科学。2000;287:1265–1269.[公共医学][谷歌学者] 20Van der Putten H、Wiederhold K H、Probst A、Barbieri S、Mistl C、Danner S、Kauffmann S、Hofele K、Spooren W P J M、Ruegg M A等。神经科学杂志。2000;20:6021–6029. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Kirik D、Rosenblad C、Burger C、Lundberg C、Johansen T E、Muzyczka N、Mandel R J、Bjorklund A。神经科学杂志。2002;22:2780–2791. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Lee M K、Slunt H H、Martin L J、Thinakaran G、Kim G、Gandy S E、Seeger M、Koo E、Price D L、Sisodia S S。神经科学杂志。1996;16:7513–7525. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Borchert D R、Davis J、Fischer M、Lee M K、Slunt H H、Ratovitsky T、Regard J、Copeland N G、Jenkins N A、Sisodia S S等。基因分析生物工程。1996;13:159–163.[公共医学][谷歌学者] 24Lee M K、Borchlt D R、Kim G、Thinakaran G、Slunt H H、Ratovitski T、Martin L J、Kittur A、Gandy S、Levey A I等。自然医学。1997;三:756–760.[公共医学][谷歌学者] 25Thinakaran G、Borchert D R、Lee M K、Slunt H H、Spitzer L、Kim G、Ratovitski T、Davenport F、Nordstedt C、Seeger M等。神经元。1996;17:181–190.[公共医学][谷歌学者] 26Borchert D R、Ratovitski T、Van Lare J、Lee M K、Gonzales V B、Jenkins N A、Copeland N G、Price D L、Sisodia S S。神经元。1997;19:939–945.[公共医学][谷歌学者] 27Galvin J E、Lee V M Y、Baba M、Mann D M A、Dickson D W、Yamaguchi H、Schmidt M L、Iwatsubo T、Trojanowski J Q。Ann Neurol公司。1997;42:595–603.[公共医学][谷歌学者] 28Hill W D、Lee V M Y、Hurtig H I、Murrary J M、Trojanowski J Q。《计算机神经学杂志》。1991;309:150–160.[公共医学][谷歌学者] 29Manetto V、Perry G、Tabaton M、Mulvihill P、Fried V A、Smith H T、Gambetti P、Autilio-Gambetti L。美国国家科学院院刊。1988;85:4501–4505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Kempermann G、Kuhn H G、Gage F H。神经科学杂志。1998;18:3206–3212. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Conway K A、Lee S J、Rochet J C、Ding T T、Williamson R E、Lansbury P T、Jr美国国家科学院程序。2000;97:571–576. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Conway K A、Lee S J、Rochet J C、Ding T T、Harper J D、Williamson R E、Lansbury P T、JrAnn NY科学院。2000;920:42–45.[公共医学][谷歌学者] 33Matsuoka Y、Vila M、Lincoln S、McCormack A、Picciano M、LaFrancois J、Yu X、Dickson D、Langston W J、McGowan E等人。神经生物学疾病。2001;8:535–539.[公共医学][谷歌学者] 34Gerlach M、Riederer P。神经传输杂志。1996;103:987–1041.[公共医学][谷歌学者] 35Crowther R A、Jakes R、Spialantini M G、Goedert M。FEBS信函。1998;436:309–312.[公共医学][谷歌学者] 36Park S M、Jung H Y、Chung K C、Rhim H、Park J H、Kim J。生物化学。2002;41:4137–4146.[公共医学][谷歌学者] 37神田S、主教J F、Eglitis M A、Yang Y、Mouradan M M。神经科学。2000;97：279–284。[公共医学][谷歌学者] 38Baba M、Nakajo S、Tu P H、Tomita T、Nakaya K、Lee V M、Trojanowski J Q、Iwatsubo T。《美国病理学杂志》。1998;152:879–884. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39坎贝尔·B·C、麦克莱恩·C·A、库文纳·J·G、盖·W·P、布隆伯格·P·C、贾卡拉·P、贝鲁瑟·K、大师赛·C·L、李·Q·X。神经化学杂志。2001;76:87–96.[公共医学][谷歌学者] 41Duda J E、Giasson B I、Gur T L、Montine T J、Robertson D、Biaggioni I、Hurtig H I、Stern M B、Grossman M、Lee V M等。神经病理学实验神经学杂志。2000;59:830–841.[公共医学][谷歌学者] 
