再生能力的程度因物种和组织类型而异。再生事件的分析不仅本身具有信息性，而且还可能提供与早期形态发生事件有关的信息，因为再生通常会重演发育过程。斑马鱼的皮肤骨骼就是一个例子(达尼奥·雷里奥)尾鳍，截肢后迅速再生，其过程类似于幼虫期发生的过程（综述见参考文献）。1)包括发育基因的再表达(2–6).
斑马鱼鳍的真皮骨架由矿化的鳞屑菌（鳍射线）和更多的远端胶原放线菌组成（图。A类). 鳞状毛癣由两条分节的半射线组成，沿近轴-远轴周期性分叉，形成姐妹射线分支。截肢后，上皮细胞从残端迁移到伤口区域(7,8)在其下形成含有未分化增殖间充质细胞的基细胞(1). 然后，成核细胞在上皮/间充质界面的胚芽内分化，并开始分泌基质，形成新的真皮骨。
(A类)斑马鱼鳍中射线骨架的示意图。真皮骨形成两个分节的、凹面的和相对的半射线。图中显示了截肢的位置，与鳞状毛症的分叉有关；“低切”和“高切”分别在分叉起点近端1至2节段和远端4至6节段进行。(B类)的顺序嘘低切后的表达模式，导致光线分叉：(地下一层)2 dpa，无分叉射线表示1嘘远端基部的结构域；(地下二层)4~5 dpa嘘在分叉形成之前的两个域中表达；(地下三层)两条新形成的姊妹射线各展示一条嘘表达域；(B4类)这个过程会重复，形成第二轮分岔（而不是按比例）。(C类)注射EGFP 24小时后EGFP的异位表达pcmv5型EGFP报告基因构建于两条相邻射线的鳞状毛癣分支的分离组织中。注射速度为2 dpa（虚线所示的高切）。(D类–我)正常分叉(D类,E类)和N-shh(F类,G公司)或bmp2b(H（H）,我)注入融合射线，用阿尔西安蓝染色。在白色箭头所示的区域内注入构件(F类,H（H）). (D类,F类,H（H）)整体安装控制和融合射线；鳍的近端在左边。(E类,G公司,我)正常分叉区的冷冻（16μm）(E类)或融合(G公司,我). 箭头在G公司和我显示异位骨基质沉积的区域。带星号标记的鳞状细胞增多症（L）的间质内部没有异位骨沉积。（巴=50μm）
在再生过程中，信号分子声波刺猬(嘘)涉及许多结构的图案（参考文献。9)，其膜受体已修补1(ptc1型) (9)和骨形态发生蛋白2b(bmp2b型)，转化生长因子-β家族成员(10)，最初都在截肢射线的远端残端的单个结构域中重新表达。表达于表皮基底层的细胞亚群中ptc1型和bmp2b型在上皮细胞下方的间质内分泌骨基质的成核细胞中也发现了转录物(三). 在表达开始后的1至2天，除了最外层（侧面）射线（从未分叉）外，所有射线都会通过复制单个结构域发出即将分叉的信号嘘和ptc1型表达式分为两个域（图。B类).
重新表达嘘和bmp2b型在细胞增殖和新骨沉积区域，以及在射线分叉事件之前其表达域的变化，暗示它们参与新真皮骨的形成和模式化，并可能参与鳍再生过程中的细胞增殖。在依赖上皮-间充质相互作用的发育系统中，shh和骨形态发生蛋白，如bmp2和bmp4，经常在相邻的细胞群中共存或表达(11). 在这些发育中的一些器官中，例如羽毛芽(12)，肠道(13)和生殖器结节(14)bmp因子作为shh信号转导的下游靶点。然而，在其他情况下，如牙齿(15)与鳍射线一样，shh也是一种皮肤骨骼结构，shh的错误表达似乎并不影响bmp因子的表达，这表明在这些器官中，shh和bmp信号传导是平行独立的。
为了直接测试shh在真皮骨形成中的功能以及shh和bmp2b信号之间的关系，我们建立了一个体内转染法表达嘘和bmp2b型在再生鳍的局部区域进行体外实验，并使用环胺（a）研究shh信号受损的影响加利福尼亚藜芦已知阻断shh信号传导的生物碱(18–21).
材料和方法
动物。
斑马鱼在当地宠物店购买，并通过标准方法保持在28.5°C(22).
鳍截肢。
将成年斑马鱼在0.6 mM Tricaine中麻醉，并将其尾鳍截去第一条射线分叉（低切；见图。A类)或在第一个分叉（高切；见图。A类).
DNA注射。
在高位切割后2天进行DNA注射。将分离射线再生枝芽基的组织微量注射0.2–0.6 nl的100 ng/μl圆形质粒DNA。共注嘘和腱蛋白每种DNA构建物用250 ng/μl质粒进行质粒检测。对于异位表达嘘和bmp2b型，将DNA注射到腹叶的每条射线中。用编码增强型绿色荧光蛋白基因(pCMV5型EGFP）。
分析嘘或bmp2b型在骨沉积处注射，让鳍再生1周，在室温下在PBS中的4%多聚甲醛中固定2小时。用0.01%Alcian blue在70%乙醇和30%乙酸中对高切鱼鳍进行染色，用PBS冲洗，用0.1%天狼星红在饱和苦味酸中染色1h，用0.01 N HCl冲洗，然后用蒸馏水冲洗。通过标准冷冻切片程序将选定的射线切割成16μm的切片(22). 为了分析DNA-construction注射对内源性基因表达的影响，允许鳍在注射后再生2天，切割成16-μm的切片，并加工成就地杂交。
现场杂交。
现场如前所述，在全安装翅片和冷冻切片上进行杂交(2,23). 这个嘘地高辛标记的核糖探针对应于一个1440 bp的C末端片段，该片段排除了不同基因之间保守的区域刺猬基因(24). 这个ptc1型探针由编码400–780氨基酸的1150 bp cDNA片段组成(25).
构建子克隆。
pCMV5型EGFP，增强型GFP公司从质粒pEGFP-C1（CLONTECH）中切下基因（EGFP），并将其连接到pCMV5（CMV，巨细胞病毒）的多重克隆位点（德克萨斯大学分子与普通生物化学系，西南医学中心）。pCMV5型嘘-NH公司2，shh cDNA的一个632-bp的N末端片段(26)，通过以下引物PCR获得：正向，5′-ATTAAGCTTGCGGCAAAATGCGG-3′；背面为5′-GAAGATCTCCCCCAGATTTCGCAGC-3′。它被克隆到pCMV5载体中Hin公司dIII和Bgl公司II站点。的位置632嘘序列对应于shh前体的裂解位点。pCMV5型bmp2b型是pCMV5载体的修改版本，用于创建方便的限制位点(生态RI和千磅I站点）放置bmp2b型在CMV启动子控制下的cDNA。pCMV病毒腱蛋白（由巴尔的摩华盛顿卡内基研究所M.Halpern善意提供），一个2.5 kb的片段，编码斑马鱼索蛋白cDNA(27)，插入含有CMV启动子的pCS2+表达载体。
环磷酰胺的制备和治疗。
在PBS中制备生物碱环胺和茄尼定的水溶性配合物，并在氮气下蒸发。复合物由10 mg环胺、5 mg柠檬酸和125 mg环糊精或10 mg茄尼定、5 mg枸橼酸和250 mg环糊素组成。10 mM生物碱复合物的储备用蒸馏水制成，并在4°C的黑暗中储存。
在低切截肢后，将斑马鱼放在装有1、5或10μM生物碱（环胺或对照，茄尼定）的烧杯中2天。鱼在28.5°C的黑暗中在生物碱溶液中保存5天，第三天溶液发生变化。每天，对鱼进行麻醉，并测量再生鳍的长度（每天相同的光线）。处理后，鱼鳍被修整，并固定在4%多聚甲醛/PBS中，然后用阿尔西安蓝和天狼星红染色进行组织学检查，或进行处理就地杂交。
BrdUrd公司。
根据参考文献，用BrdUrd标记增殖细胞。7，进行了一些修改(8)，除了与小鼠抗BrdUrd单克隆抗体（Sigma）孵育后，用ABC碱性磷酸酶检测试剂盒（Serotec）观察BrdUrd掺入。
结果
shh和bmp2b的异位表达破坏了再生射线的正常模式。
为了研究shh和bmp2b在骨沉积和骨形成中的作用，我们开发了一种局部基因转染方法（基于基因治疗研究，例如参考文献。28和29)，以表象的方式嘘和bmp2b型在再生翅片的特定区域。
初步实验表明，10–60个间充质细胞可以转染含有EGFP公司报告基因，置于CMV启动子的控制下，当以100到250 ng/μl的浓度注射到分离再生分支射线芽基的组织中时（图。C类). 注射后24小时射线的正常形态（用光学显微镜进行评估）表明，该过程没有中断正常再生模式。注射后GFP荧光持续至少1周。在未经修饰的射线中，转染效率较低，表明该技术适用于创伤组织和/或未分化、高度增殖的组织。
为了研究射线分叉中的shh信号传导，嘘和bmp2b型构造在两个姐妹射线分支之间表达错误，其中嘘和bmp2b型通常不表示。射线在“高切口”水平处被截肢（图。A类)鳞状毛分支的正常瞬间融合很少发生(三). 截肢（dpa）后2天，用含有氨基末端编码部分的质粒注射鳍嘘【N】-嘘; 负责其生物活性的部分(24,26)]，的bmp2b型基因(10)，或控件EGFP公司记者。
当N-嘘或bmp2b型将基因构建物转染到两条姊妹射线的芽基之间，观察到融合发生率增加，最明显的是分叉起点以上的四到五个片段。在这个水平上，51%的射线注入N-嘘(n个=159/300）瞬时熔化，相比之下，15%的翅片注射EGFP公司(n个=48/320），40%的射线注入bmp2b型(n个=18/45）显示融合，而13%(n个=4/30）EGFP公司控制。
索丁能对抗shh异位表达诱导的骨融合形成。
Chordin，一种直接结合bmp因子并阻止bmp–bmp受体相互作用的分泌蛋白(30)用N造币-嘘在一次大幅度削减之后。共投导致更少（3.4%；n个=1/29）与N相比，在分叉原点上方四到五段的射线瞬时融合-嘘单独注射（51%；见上文）。共射还将分叉起始点上方1–2.5段的自然射线融合发生率从100%降低到52%(n个= 10/19). 弦蛋白对骨融合的抑制表明异位骨形成需要bmp因子。此外，我们观察到自然融合和shh诱导的融合均受到抑制，这表明导致骨融合的异位shh表达是通过激活bmp信号传导介导的。
融合过程中真皮骨沉积在层间区域。
为了确定在两个N-嘘（图。F类)和bmp2b型注入（图。H（H）)，控制（图。D类)并注入（图。 F类和H（H）)射线（每个结构至少四条）用阿尔西安蓝染色，并在融合区域切割成水平切片（图。 E类,G公司、和我). 在检查的每一个融合鳍中，异位基质仅在上皮基底层和间质细胞之间的间隙中发现（图。 G公司和我). 在鳞状毛癣的间充质内部没有发现真皮骨沉积N-秒和bmp2b型由转染细胞表达，这表明只有能够形成真皮骨的细胞[即靠近基底膜的成核细胞(7,31)]能够对异位基因表达作出反应。
shh的异位表达而非bmp2b的异位表达改变了ptc1型表达式。
在发育中的肢芽中，shh信号被认为受与其他蛋白质（如成纤维细胞生长因子）的反馈回路调节(32,33). 我们观察到，作为bmp信号的抑制剂，chordin可以拮抗shh诱导的骨融合形成，这表明shh和bmp信号之间存在相互作用。为了研究骨形成过程中bmp2b和shh之间可能的相互作用，我们检查了ptc1型表达受N的异位表达影响-嘘和bmp2b型.注射N后两天-嘘,ptc1型在间充质细胞和位于两个射线分支之间的基底上皮层细胞中诱导表达（图。D类)，其中ptc1型还有嘘和bmp2b型通常不表示（图。 A类–C类). 相反，2天后bmp2b型注射，无变化ptc1型与未插入翅片的比较（图。E类). 这一结果表明，shh信号通路并不是对异位表达的bmp2b型.
再生鳍的横截面显示了嘘(A类),ptc1型(B类)在两条相邻的射线中；bmp2b型(C类)在一条射线中，4dpa；ptc1型注射后2天表达N-秒(D类)或bmp2b型(E类)构造。注意异位表达ptc1型异位表达N后，在分隔分支射线（括号所示）的间质和基底上皮细胞中-嘘(D类)但不是bmp2b型(E类). 箭头在A类–C类表明嘘,ptc1，和bmp2b型基底上皮细胞表达。箭头输入B类和C类表明ptc1型和bmp2b型在成核细胞中表达。（巴=50μm）
环磷酰胺抑制鳍再生并改变嘘和ptc1型基因表达。
我们通过将再生鳍暴露于环胺来研究shh信号下调对骨骼模式的影响，环胺是一种阻断刺猬（hh）信号转导的甾体生物碱(18–21). 尾鳍在低切平面截肢（图。A类)，然后用1、5或10μM生物碱处理，从2 dpa开始，当嘘表达式已建立(三). 每天评估再生部分的形态和长度。作为对照，以相同剂量用茄尼定（一种结构类似的甾体生物碱）处理等量的鱼，但对hh信号没有已知影响。添加茄尼定后的鱼鳍生长与未处理鱼鳍的生长相似（数据未显示）。
10μM处理（图。A类)和5μM（图。B类)第2天，环胺显著抑制鳍的生长(P（P）<0.05）和4(P（P）<0.05）。到第5天，这两种剂量都会导致黑素细胞在远端胚芽中积聚（图。D类和F类)新沉积的骨似乎较厚，并突然终止（图。 D类和F类)与控制相比（图。 C类和E类). 此外，在10μM时，在远端射线中发现了放线菌（图。E类)不存在（图。F类). 抑制翅片生长与再生节段数量显著减少相关(P（P）< 0.001; 表). 然而，每个节段的长度似乎没有受到影响（未显示）。与茄尼定处理的鳍不同，接触环胺的射线不会分叉。
(A类,B类)10μM处理翅片的生长曲线(A类)或5μM(B类)茄碱（黑色条）或环胺（斜线阴影条）。纵坐标表示鳍的长度（以毫米为单位）和治疗当天的横坐标，其中第0天是鱼首次放入生物碱溶液的日子。在10μM时，鳍的生长在治疗的第2天受到显著抑制（星号，P（P）<0.05），在第4天以5μM（星号，P（P）< 0.05).P（P）通过使用学生的t吨测试，误差条=SEM(C类–F类)环胺对尾鳍再生的影响，尾鳍的近端位于左侧；(C类,D类)整个坐骑鳍都染上了阿尔西安蓝。暴露于5μM环胺(D类)与5μM茄尼定相比，5天可抑制鳍的生长(C类). 黑素细胞聚集在射线的远端残端（大箭头），芽基明显缺失。中的小箭头D类表示鳍截肢的程度（低切）。虚线表示中所示的截面平面E类和F类.经10μm环胺处理的翅片纵轴上的结晶（16μm）(F类)或茄尼定(E类)并用阿尔西安蓝和天狼星红染色。注意切片最远端（箭头）的色素堆积和额外的骨沉积，以及缺乏放线菌，如E类（箭头）。[条形图(C类,D类)=100μm；(E类,F类)=25微米。]
5μM茄尼定处理后再生尾鳍的基因表达(A类,C类,E类)或环胺(B类,D类,F类). 在环胺作用1天后，ptc1型表达式，通常在单个域中表示(A类)，不存在(B类)和嘘，通常在两个域中表达(C类,E类，箭头）是沿着近端-远端轴的单个扩展域(D类). 在治疗的第3天，经环胺处理的鳍只显示出一个弱且弥散的区域嘘表达式(F类，箭头）在色素积累和鳞状毛癣终止区域（方括号）。（巴=150μm）
表1
治疗5天后，经生物碱处理的鳍片中的平均片段数±SEM
| 生物碱，μM | 索拉尼丁 | 环磷酰胺 |
|---|
| 5 | 4.6 ± 0.4* | 1.8 ± 0.7* |
| 10 | 4.6 ± 0.4† | 1.26±0.19† |
我们研究了嘘和ptc1型用5μM生物碱治疗1、3和5天后(n个=每组4人）。ptc1型表达，通常出现在远端再生（图。A类)在经过环胺处理的翅片中，在所有时间点都不存在（图。B类). 相反，嘘，在对照中，在每个胚芽中用两个域表示（图。 C类和E类)，在第1天在一个扩展域中表达（图。D类)以及3处较小的扩散区域（图。F类)以及5天（未示出）。暴露于1μM环胺(n个=14）对形态或shh/ptc1型基因表达（未显示）。
环磷酰胺影响细胞增殖和胚泡/上皮界面的形态。
鳍生长停止和表达改变嘘和ptc1型提示环胺可以影响胚芽细胞，胚芽细胞是细胞增殖、成核细胞分化和骨基质分泌的场所。环胺可能会以某种方式影响芽基向远端延伸的能力。为了确定这种影响是否是由有助于再生的细胞增殖减少引起的，我们在用10μM环胺或茄尼啶处理1天和3天后检测了BrdUrd的掺入(n个=每组4个），从2 dpa开始。在开始治疗后24和72小时，给鱼注射BrdUrd，7小时后收获鱼鳍(8).
治疗开始后一天，茄尼定组与对照组的细胞增殖量无显著差异（图。A类)和环胺（图。B类)组(P（P）> 0.05; 表). BrdUrd-阳性细胞可见于沿鳍长度方向的上皮层（箭头所示）和胚芽间质（图。 A类和B类，箭头）。到第3天，环胺治疗导致再生细胞的增殖显著减少，这两种细胞都在基部(P（P）< 0.005; 表，图。 C类和D类)和上皮细胞(P（P）< 0.005; 表，图。 C类和D类，箭头所示），且残端的BrdUrd-阳性上皮细胞明显增多(P（P）< 0.005; 表). 虽然shh信号的缺失可能除了影响基细胞的增殖外，还会影响上皮细胞，但似乎它更可能影响上皮细胞的分布，因为已知这些细胞会从残端的侧面迁移到再生细胞(8). 经环丙胺处理的鱼的上皮细胞迁移可能因再生停滞而受损。
经环胺或茄胺处理的鳍中掺入BrdUrd。用茄尼定治疗1天后（以2 dpa开始）(A类)或环胺(B类)在新骨基质分泌区的表皮（实心箭头）和间质（箭头）中发现增殖细胞。到第3天，在对照和环胺处理的鳍的表皮层中仍然发现BrdUrd标记的细胞(C类,D类和茄尼定处理过的鳍的间充质中(C类，箭头），但不在经环胺处理的鳍的间充质中(D类). 虚线表示截肢的程度。（巴=50μm）
表2
处理1天和3天后，经生物碱处理的鳍中BrdUrd-阳性细胞的平均数±SEM
| n个* | 树桩†
| 重新生成
|
|---|
| 平均值±SEM | P（P）价值‡ | 平均值±SEM | P（P）价值‡ |
|---|
| 第1天 |
| 上皮 |
| 环磷酰胺 | 9 | 39.89±2.6 | 0.468 | 23.9 ± 5.5 | 0.909 |
| 索拉尼丁 | 7 | 51.7 ± 15 | | 23.14 ± 3.2 |
| 间充质酶 |
| 环磷酰胺 | 9 | 24.78 ± 2.4 | 0.075 | 49.2 ± 5.5 | 0.2 |
| 索拉尼丁 | 7 | 33.43 ± 3.7 | | 62.4 ± 8 |
| 第3天 |
| 上皮 |
| 环磷酰胺 | 10 | 53.7 ± 5.4 | <0.001 | 29.3 ± 3.8 | 0.002 |
| 索拉尼丁 | 8 | 9.75 ± 3 | | 118 ± 18 |
| 间充质酶 |
| 环磷酰胺 | 10 | 3.7 ± 1.5 | 0.49 | 6.7 ± 1.7 | 0.001 |
| 索拉尼丁 | 8 | 5 ± 1.1 | | 108.3 ± 17 |
讨论
N后异位骨沉积-嘘和bmp2b型异位表达。
通过使用体内通过DNA转染，我们能够靶向N-嘘和bmp2b型在切除的鳍中，在已经分叉的射线分支之间，内源性嘘和bmp2b型通常不表达。在截肢射线的芽基中注射报告基因DNA对再生没有不良影响。N的异位表达-嘘和bmp2b型导致正常情况下无骨的骨间质中额外的骨沉积。然而，只在表皮基底层和间质之间发现多余的骨，在那里可以发现分泌骨基质的成核细胞(7,31). 这种效应取决于截肢部位（注射位置）和分叉起点之间的距离，最大值为分叉起点以上四到五段，当DNA注射到更远的地方时，这种效应会逐渐减弱。这一发现表明，N-shh和bmp2b可以刺激骨基质的分泌，可能是通过影响分泌骨的成核细胞的分化，但仅在能够这样做的间充质区域-嘘-表达细胞位于鳞状毛细胞的间充质内部，在那里通常不存在成核细胞及其前体。嘘已知上皮细胞的表达在与其他系统中相邻间充质组织的相互作用中起作用。例如，嘘鸡毛囊上皮的表达被认为是诱导间充质冷凝形成羽毛板(34)、和嘘毛囊的形态发生需要皮肤中的表达(17).嘘在发育中的肺部间充质细胞的分化中也很重要(16)牙齿的正常生长和形态发生，但成釉细胞和成牙本质细胞的分化似乎并不需要它(15). 然而，尚不清楚此处所述的骨基质异位分泌是由于新成核细胞与层间区现有前体细胞的分化，还是由于现有成核细胞刺激骨分泌所致。
我们展示了腱蛋白，是的抑制剂bmp格式信号转导可以拮抗shh异位骨的形成，提示shh和bmp途径在鳍真皮骨形成中相互作用，bmp因子作为shh的下游靶点。相反，我们观察到，与shh相反，bmp2的异位表达并不影响内源性ptc1型shh信号转导靶点的表达质疑了bmp2和shh通路在真皮骨形成中是否存在正反馈机制。
环磷酰胺抑制鳍生长。
再生鳍暴露于环胺后，最初减少，然后抑制鳍的生长，导致放线菌减少或没有，并导致色素细胞的远端积聚。伴随着这些效应，胚芽内的细胞增殖减少，胚芽大小减小。
环胺对hh信号通路的抑制与胚芽维持的干扰相一致，包括间质内特殊细胞类型的增殖和分化，可能包括分泌骨的成核细胞和/或合成放线菌的细胞，它们被认为有助于新组织向远处迁移(35,36). 虽然环胺可能影响所有刺猬相关蛋白的信号传导，但我们观察到的影响可能是由shh介导的，而不是其他刺猬-相关基因，如虎翼刺猬(37)和刺猬(38)，因为在这些实验过程中，这些家族成员没有在再生鳍中表达（未发表的观察结果）。我们不能排除as-yet未描述的可能性刺猬-类似基因在再生鳍中表达，可能受到环胺处理的影响。
我们的研究表明，shh信号转导参与再生过程中芽基中特殊骨分泌细胞的增殖和/或分化，这可能是通过上皮-间质相互作用，包括shh/ptc1和bmp2b，基底上皮细胞亚群表达嘘相同的细胞和相邻的间充质细胞表达ptc1型和bmp2b型在斑马鱼鳍的再生过程中，成纤维细胞生长因子功能的抑制导致上皮细胞的下调嘘表达，进而抑制细胞增殖和芽基生长(5). 在发育肢芽的过程中，外胚层顶嵴中的成纤维细胞生长因子与极化区中的shh之间的相互作用已被充分证实(32,33,39,40). 用环胺治疗后成纤维细胞生长因子的表达分析可能有助于确定鳍再生过程中上皮-间充质相互作用的重要性。
中的更改嘘和ptc1型接触环磷酰胺后的表达模式。
我们发现用环胺处理的射线很少分叉，这可能是由于嘘表达域与分叉过程有明确联系。经过1天的环胺处理后，基因表达出现了明显差异，其中用5μM环胺处理过的鳍显示嘘近-远轴的表达和ptc1型表达式。治疗3天后，当鳍的生长几乎停止时嘘表达存在，但仍然没有ptc1型抄本。快速上调嘘环胺治疗后的表达表明反馈机制参与了嘘表达域并进一步支持这样的假设，即这种机制导致嘘表达在再生的最远端。最终下调嘘伴随鳍生长停止的这一现象表明，shh信号可能在胚芽中骨分泌细胞的增殖和分化或骨沉积本身中起重要作用。然而，对骨沉积的直接影响似乎不大可能，因为在环胺治疗的前3天，即使没有shh受体ptc1，骨仍然沉积。
我们报告说嘘再生鳍的表达与新骨基质沉积区域相关(三). 此外，我们观察到嘘表达到与骨分叉形成相关的两个域嘘与新分支的成骨区域相对应的表达。这些观察结果表明shh在真皮骨模式形成中的作用(三). 然而，尚不清楚shh功能缺失是分支间骨缺失的结果还是原因。在这里，我们提供了证据表明嘘或bmp2b型在再生鳍的胚芽中，会导致能够产生骨分泌细胞的区域出现过多的骨沉积。相反，用环胺处理再生鳍可减少鳍的生长，并最终停止细胞增殖和胚芽中的远端骨沉积。这些结果表明，shh信号在鳍生长过程中胚芽内骨分泌细胞的增殖和/或分化中起作用，并得到以下观察的支持：用环胺治疗可导致早期扩张，随后减少嘘鳍生长停止后的表现。shh和bmp2b信号可能通过影响骨分泌性成核细胞的分化，在确定再生鳍中的骨沉积区域中起着重要作用。然而，已经分化的成核细胞分泌骨基质并不需要shh信号。
