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分子生物学细胞。2002年9月；13(9): 3178–3191.
数字对象标识：10.1091/桶。E02-05-0295号
预防性维修识别码：PMC124151型
PMID：12221124

新型蛋白抑制剂FIP200对黏附斑激酶的调控

斯米塔·阿比,植田博树,川海正,李安·库珀,赵继和,蕾妮·克里斯托弗、和关俊林*
琼·布鲁日，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

黏附斑激酶（FAK）是整合素信号通路的主要介导者。FAK活性的调节机制及其相关的细胞功能尚不十分清楚。在这里，我们提供的数据表明，一种新的蛋白质FIP200作为FAK抑制剂发挥作用。我们显示了内源性FIP200与FAK的相关性，在伴随FAK激活的整合素介导的细胞粘附时，FAK降低。体外和体内结合研究表明，FIP200通过多个域直接与FAK相互作用。与FAK激酶结构域结合的FIP200在体外抑制其激酶活性，在体内抑制其自身磷酸化。FIP200或其片段的过度表达抑制了细胞扩散、细胞迁移和细胞周期进展，这与它们对体内FAK活性的抑制有关。FIP200对这些细胞功能的抑制可以通过FAK的共表达来挽救。最后，我们发现内源性FIP200与FAK之间的功能性相互作用被破坏，导致FAK磷酸化增加，并部分恢复细胞周期进程-我-赖氨酸，进一步支持FIP200作为FAK的负调控因子。总之，这些结果确定FIP200是FAK的一种新型蛋白抑制剂。

简介

黏着斑激酶（FAK）是整合素信号转导的主要介质，参与细胞扩散、迁移、存活和增殖的调节(克拉克和布鲁格，1995年;施瓦茨等。, 1995;帕森斯，1996;Cary和Guan，1999年;施莱普费尔等。, 1999). FAK活化和酪氨酸磷酸化在多种细胞类型中都显示依赖于与细胞外配体结合的整合素(施瓦茨等。, 1995). 激活后，FAK在Y397处自动磷酸化，这介导FAK与许多Src同源性2（SH2）结构域包含的信号分子（包括Src家族激酶）的关联(陈等。, 1994;科布等。, 1994;沙勒等。, 1994;Xing（兴）等。, 1994)PI3K的p85亚单位(陈和关，1994年)，磷脂酶C-γ(张等。, 1999)和Grb7(韩和关，1999年). FAK与Src家族激酶的结合被提议允许通过Src磷酸化FAK的Y925，Src与Grb2的SH2结构域结合(施莱普费尔等。, 1994). FAK/Src复合物的形成还导致许多其他底物的酪氨酸磷酸化，包括帕西林(伯里奇等。, 1992;Schaller和Parsons，1995年)，第130页(武奥里等。, 1996;橘树等。, 1997)和Shc(施莱普费尔等。, 1998). 最近的研究表明，Grb7被FAK以Src非依赖性的方式磷酸化(汉族等。, 2000).

FAK及其下游信号通路在细胞扩散和迁移的调节中起着重要作用(伊利克语等。, 1995;卡里等。, 1996;Gilmore和Romer，1996年;Richardson和Parsons，1996年). FAK（传真）−/−与野生型小鼠的细胞相比，来自FAK基因敲除小鼠胚胎的成纤维细胞的细胞迁移明显减少(伊利克语等。, 1995). 同样，FAK C末端重组蛋白（即FRNK）对FAK的抑制导致成纤维细胞和内皮细胞的运动性降低(Gilmore和Romer，1996年)以及成纤维细胞扩散速度降低(理查德森和帕森斯，1996年). 最后，FAK在许多细胞系中过度表达，包括FAK−/−细胞，促进其在纤维连接蛋白（FN）上的迁移(卡里等。, 1996;欧文等。, 1999;西格等。, 1999). FAK信号通路也被证明在整合素介导的细胞粘附中调节细胞存活和细胞周期进展。FAK的过度表达可保护MDCK细胞或原代成纤维细胞免受细胞剥离、血清提取或其他处理诱导的凋亡(弗里希等。, 1996;伊利克语等。, 1998;陈等。, 1999). 相反，通过FAK反义寡核苷酸治疗肿瘤细胞系抑制FAK(徐等。, 1996)或用抗FAK单克隆抗体（mAb）微量注射CEF细胞；亨格福德等。, 1996)诱导细胞凋亡。用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法测定成纤维细胞或内皮细胞微量注射FAK的C末端片段抑制细胞周期进展(Gilmore和Romer，1996年). 通过破坏FN基质组装抑制FAK酪氨酸磷酸化也导致G1向S转变的延迟，这表明FAK在细胞周期进展中起作用(Sechler和Schwarzbauer，1998年). 最后，使用四环素调节的表达系统，我们最近发现野生型FAK的表达加速了G1到S的转变，而显性阴性FAK突变体的表达抑制了G1期的细胞周期进展(赵等。, 1998).

与阐明FAK下游信号通路的快速进展相比，对FAK活性及其相关细胞功能的调节机制知之甚少。利用酵母双杂交筛选，我们最近发现了一种新的蛋白质，200 kDa的FAK家族相互作用蛋白（FIP200），它与FAK相关酪氨酸激酶Pyk2相关(上田等。, 2000). 我们的初步分析表明，FIP200可以通过直接与Pyk2的激酶结构域结合来抑制其激酶和细胞活性。此外，FIP200还可以绑定到FAK。有趣的是，与Pyk2的有限表达模式相比，FIP200和FAK在多种组织和细胞系中广泛表达(乌辣罕等。, 1995;列夫等。, 1995;施瓦茨等。, 1995;长濑等。1996年;上田等。, 2000). 这表明FIP200与FAK在一些基本细胞功能中的相互作用可能具有重要作用。在本报告中，我们表明FIP200也可以结合到FAK的激酶结构域，并作为FAK激酶活性及其相关细胞功能的蛋白抑制剂发挥作用。

材料和方法

抗体

抗C末端FIP200（残基1374-1591；抗FIP200C；上田等。, 2000)，兔抗FAK抗血清(陈和关，1994年)，小鼠单抗KT3(卡里等。, 1996)和识别血凝素（HA）表位标签的小鼠单抗12CA5(陈等。, 1995)前面已经描述过。使用谷胱甘肽在兔子体内制备抗FIP200 N末端段的抗血清S公司-转移酶（GST）-FIP200 N末端含有1–373残基的融合蛋白。然后使用固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖上的相同融合蛋白作为亲和基质，从抗血清中亲和纯化抗-FIP200N抗体。抗FAK、Pyk2和paxillin的小鼠单克隆抗体和抗磷酪氨酸抗体PY20购自Transduction Laboratories（KY，Lexington）。针对FAK磷酸化Y397（抗pFAKY397）的兔抗体购自Biosource（加州卡马里洛）。兔抗HA（HA探针）、鼠抗Myc表位标签单克隆抗体（9E10）和兔多克隆抗绿色荧光蛋白（GFP）均来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。兔抗β-Gal多克隆来自5 prime-3 prime，Inc.（Boulder，CO）。小鼠单克隆抗Flag、抗BrdU、荧光素结合山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G和罗丹明结合山羊抗小鼠IgG购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。

表达载体的构建

编码标记全长NT-FIP和CT-FIP的表达载体pSG5-FIP200、pSG5-N末端-FIP（NT-FIP）和pSG5-C末端-FIP(上田等。, 2000). pSG5-middle domain-FIP（MD-FIP）编码FIP200的标记中间结构域，通过使用带有生态5′端的RV现场和Bgl公司3′位置的橄榄岩。随后将该区域克隆到pSG5载体中相应的克隆位点中。类似地，通过扩增残基1-1591、1-638、639-1373和1374-1591，并添加Sma公司I站点位于5′端生态RV站点位于3′端。这些片段随后被消化并克隆到pKH3载体中相应的克隆位点。

pGEX-CT-FIP已在前面描述(上田等。, 2000). 通过聚合酶链反应（PCR）构建pGEX-NT-FIP，生成一个1.1-kb的N末端片段，对应于NT-FIP中的残基1-373，并添加Sma公司I位于5′端生态3′端的RV位点。这个碎片是用Sma公司我和生态将RV插入pGEX-2T载体的相应克隆位点。pGEX-MD-FIP由编码全长-FIP200的质粒的639-1373残基对应的扩增区域产生。引物包括Sma公司I站点位于5′端生态RV站点位于3′端。碎片被消化Sma公司我和生态将RV插入pGEX-2T载体的相应位点。

用正向（5′-CTGGATCCATGCAGCTTACTCTC-3′）和反向（5′-ATGATACTTATACTCTCTCTC TTCATC-3′）引物进行PCR扩增，得到含有N末端结构域的FAK片段（NT-FAK）。PCR产物用巴姆HI和生态RV并克隆到pKH3中巴姆HI和Sma公司I站点生成pKH3-NT-FAK。利用正向（5′-ATGATACAACCAGAGAGATAAATTC-3′）和反向（5′-GCTTTTAAATTAAGTAAACCTGTCTAC-3′）引物通过PCR扩增产生含有激酶结构域的FAK片段（KD-FAK）。PCR产物用生态RV和德拉我被克隆到pKH3中Sma公司I站点生成pKH3-KD-FAK。使用相同的引物扩增具有K454至R突变的激酶结构域，使用具有该突变的FAK cDNA作为模板(卡里等。1996年). 然后将该片段克隆到pKH3载体中，以获得HA标记的KD韩国构造。编码全长HA-tagged FAK和C末端FAK的表达载体已在前面描述(赵等。, 1998).

Pyk2的激酶结构域是通过使用正（5′-CAGGATCCCGGCATTGCCCGCGTGAAGATG-3′）和反（5′-ATGAATTCGTCACACAGCTCTCGGTG-3′）寡核苷酸进行PCR扩增产生的。然后将产物插入pKH3中以生成pKH3-KD-Pyk2。前面已经描述了编码全长Pyk2的矢量(郑等。, 1998). 编码HA标记的Grb7和控制蛋白（Grb7-SH2结构域）的表达载体已在前面描述(韩和关，1999年). 编码GFP-paxillin、HA-Shc和Myc-p130cas的表达载体分别来自C.Turner博士（纽约州锡拉丘兹市Upstate医疗中心）、D.Schlaepfer博士（加利福尼亚州拉霍拉市斯克里普斯研究所）和S.Hanks博士（田纳西州范德比尔特大学）。

体外结合

GST融合蛋白是使用蛋白酶缺陷产生和纯化的大肠杆菌菌株BL21-Dex，如前所述(上田等。, 2000). 将GST融合蛋白（3μg）固定在谷胱甘肽-甘露糖珠上，然后用293个细胞制备的裂解物（200μg）在4°C下孵育4小时，这些细胞已被转染了编码Pyk2激酶域、HA-FAK或其片段的表达载体。洗涤后，用抗HA（1:2000）蛋白印迹法对结合蛋白进行分析，如下所述。为了与重组FAK结合，如前所述，从杆状病毒感染的sf21细胞中纯化His-tagged重组FAK(威瑟斯等。, 1996). 将GST融合蛋白（5μg）与谷胱甘肽琼脂糖珠的量相等，并与1μg纯化的His-tagged FAK在结合缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0，137 mM NaCl，1 mM MgCl）中孵育2和1%Triton®声波风廓线仪）在4°C下隔夜旋转。然后用结合缓冲液洗涤样品五次，在SDS缓冲液中煮沸，用SDS-PAGE进行解析，并用α-FAK抗体进行蛋白质印迹。

免疫沉淀和Western Blot

在大多数实验中，用1%NP-40裂解缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0，137 mM NaCl，1%Nonide P40，10%甘油，1 mM Na）对细胞进行裂解三VO（旁白）41 mM苯基甲基亚砜、10μg/ml抑肽酶和20μg/ml亮氨酸蛋白酶）。为了检测HA-Shc的磷酸化，细胞在改良的RIPA裂解缓冲液中进行裂解（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.3%脱氧胆酸钠，0.1%Nonide P-40，10%甘油，1.5 mM MgCl2、1 mM EDTA、0.2 mM EGTA、20 mM NaF、25μM ZnCl21 mM NaVO4、1 mM苯基甲基亚砜、10μg/ml抑肽酶和2μg/ml亮氨酸蛋白酶），如前所述(赵等。, 1998). 免疫沉淀在4°C下进行，方法是将细胞裂解物与所示抗体孵育2-4小时，然后用蛋白A-琼脂糖或蛋白G-Plus孵育1小时。免疫沉淀物在不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中洗涤三次。然后将小球重新悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中，煮沸5分钟，并通过SDS-PAGE.进行解析。如前所述，使用Amersham增强化学发光系统（伊利诺伊州阿灵顿高地），使用适当的抗体进行蛋白质印迹(陈等。, 1995;上田等。, 2000). 在一些实验中，通过Western blotting直接分析全细胞裂解物。

FAK体外激酶检测

FAK是从中国仓鼠卵巢细胞中过度表达FAK的免疫沉淀(卡里等。, 1996). 如前所述测定免疫复合物的等分试样的激酶活性(上田等。, 2000)在含有FIP200片段或仅含GST的各种数量的GST融合蛋白存在下。

细胞扩散的测量

根据制造商的说明，使用LipofectAmine和PLUS转染试剂（纽约州格兰德岛生命科技公司）转染NIH3T3细胞。转染后第1天，将细胞重新放置在FN（10μg/ml）上，固定在甲醛中，并进行免疫荧光染色（见下文）。或者，将细胞与编码β-半乳糖的质粒以及所示载体共同转染。转染后一天，将细胞重新放置在FN（10μg/ml）上30分钟，固定，并如前所述检测β-gal活性(卡里等。, 1996). 在三个独立的实验中，每次转染至少60个阳性转染细胞（蓝色），计算其传播表型。

细胞迁移分析

根据制造商的说明，使用LipofectAmine和PLUS转染试剂（Life Technologies），将NIH 3T3细胞与各种载体以及编码GFP的质粒以7:1的比例进行共转染。转染后1或2天，用p10尖端损伤细胞单层。然后清洗平板，并在37°C的生长培养基中培养8 h。每隔2 h拍摄一次相位对比和荧光图像，直到伤口闭合（～10 h）。迁移率是通过测量8小时内移向伤口中心的距离来计算的。使用OMAware进行的运动分析如前所述(汉族等。, 2000).

BrdU掺入法测量细胞周期进展

如前所述进行BrdU掺入分析(赵等。, 1998). 简而言之，根据制造商的说明，使用LipofectAmine和PLUS转染试剂（Life Technologies）转染NIH 3T3细胞。转染亚合流细胞在含有0.5%CS的DME中血清饥饿24小时。然后将其重新放置在FN（10μg/ml）上，并在DME和10%CS中用100μM BrdU（Sigma）培养16小时。用于FAK-KD实验韩国突变体，细胞在0.5%血清中饥饿30h。然后将其重新放置在FN（10μg/ml）或poly上-我-赖氨酸（PLL；0.1 mg/ml），并与1%血清中的100μM BrdU孵育20 h。用0.5 U/μl DNaseI消化细胞DNA(新英格兰生物实验室，马萨诸塞州贝弗利）在37°C下保持30分钟。然后用多克隆抗HA（HA探针；1:300）和单克隆抗BrdU（1:300）对细胞进行双重免疫荧光染色，如下所述。在每个独立实验中，对多个领域中至少80个阳性转染细胞（如抗HA所识别的）进行BrdU染色评分。对于FAK拯救实验，转染中还包括编码β-Gal的表达质粒。然后对细胞进行上述BrdU掺入分析，但阳性转染细胞通过多克隆抗β-Gal免疫染色鉴定+/β-半乳糖+通过分析40–50β-Gal测定细胞+每个细胞在多个场中进行转染。

免疫荧光染色

如前所述，对细胞进行免疫荧光染色(赵等。, 1998). 所用的主要抗体为多克隆抗FIP200N（1:200）、单克隆抗FAK（1:100）、多克隆抗HA（1:200。所用的二级抗体为荧光素结合山羊抗兔IgG（1:300）和罗丹明结合山羊抗鼠IgG。将细胞安装在Slowfade（Molecular Probes，Eugene，OR）上并进行检查。使用免疫荧光显微镜拍摄染色细胞的图像(奥林巴斯（日本东京）和充电耦合设备摄像头。

结果

内源性FIP200与FAK的相关性

为了探讨FIP200与FAK相互作用的机制和潜在功能，我们首先分析了内源性FIP200和FAK的相互作用。裂解物由悬浮或重新植入FN、IV型胶原或I型胶原的细胞制备。用抗FIP200抗体对其进行免疫沉淀，然后用抗FAK蛋白进行免疫印迹，以检测免疫复合物中的相关FAK。图​图1A1A显示内源性FAK与FIP200的相关性，并且当细胞粘附到FN时，相关性降低，在较小程度上，粘附到IV型胶原或I型胶原。免疫沉淀物与另一种抗FIP200抗体的免疫印迹显示，在这些不同条件下，从细胞裂解物中沉淀出的FIP200数量相似（图​（图1B）。1B） ●●●●。与以往研究一致(施瓦茨等。, 1995)细胞粘附FN，在较小程度上，IV型胶原蛋白或I型胶原蛋白激活FAK，导致Y397处FAK自身磷酸化增加（图​（图1，1、C和D）。这些结果表明，FIP200与FAK的解离与细胞粘附过程中FAK的激活有关，这与我们之前的发现一致，即FIP200也可能作为FAK的蛋白质抑制剂(上田等。, 2000). 这些联合免疫沉淀分析还检测到其他几种细胞系中内源性FIP200和FAK的相关性，包括大鼠主动脉平滑肌细胞、293细胞和NIH 3T3细胞（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）。

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FIP200和FAK的关联和本地化。（A-D）裂解物由MDA-MB231乳腺癌细胞制备而成，如图所示，这些细胞被悬浮或移植到FN、IV型胶原或I型胶原上。用抗FIP200N免疫沉淀，然后用抗FAK（A）或抗FIP200 C（B）免疫印迹法进行分析。用抗pFAKY397（C）或抗FAK（D）蛋白直接免疫印迹法分析全细胞裂解物（WCL）。（E） 如图所示，按照“材料和方法”中所述，使用抗FIP200N或抗FAK处理转染FIP200（底部面板）的NIH 3T3细胞（顶部面板）或ECV304细胞进行免疫荧光。FIP200和FAK在外周焦点接触中的共定位示例用箭头标记。

我们以前的研究表明FIP200主要定位于细胞质(上田等。, 2000). 使用针对FIP200 N末端结构域的新的多克隆抗体，我们检测到，除了部分细胞的细胞质染色外，细胞外围的局部接触点中还存在内源性FIP200（图​（图1E）。1E） ●●●●。反FAK成本（图​（图1E，1E、 顶面板）或抗病毒素（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）显示FIP200与FAK和病毒素在焦点接触中部分共定位。在转染全长FIP200的细胞中，也可以更清楚地看到FIP200与FAK在细胞外围的局部接触中的部分共定位（图​（图1E，1E、 底部面板）。这些结果表明，至少部分FIP200与FAK部分共定位。

FIP200通过多个交互域与FAK关联

为了在FIP200中定义FAK绑定域，我们将HA-taged FAK与Flag-taged FIP200和几个FIP200段共存（参见图​图2A）2A） 293个细胞。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，然后用抗FAK抗体进行免疫印迹。如图所示​图2B，2B、 FAK与全长FIP200和CT-FIP共沉淀，这与我们之前的结果一致(上田等。, 2000). 然而，令人惊讶的是，在这些实验中，FIP200 NT-FIP和MD-FIP片段也与FAK相关。然后，我们进行体外结合分析，以确定所有三个FIP200片段是否与FAK上的同一区域结合。图​图2C2C显示，含有三个FIP200片段中任何一个片段的GST融合蛋白与全长FAK结合，而GST本身没有。有趣的是，含有NT-FIP或MD-FIP的GST融合蛋白与FAK的激酶结构域结合，而含有CT-FIP的GST融合蛋白则与FAK N末端区域结合。没有GST融合蛋白与FAK的C末端区域结合。NT-FIP和MD-FIP与FAK激酶域的相互作用是特异性的，因为它们在同一实验中没有与FAK同源物Pyk2的激酶域相互作用。同样，GST本身并没有像预期的那样绑定到任何FAK域。为了检测所有三个FIP200片段是否通过293细胞裂解物中的其他蛋白直接或间接地与FAK结合，我们在体外结合分析中使用了来自昆虫细胞的纯化重组FAK。图​图2D2D显示，含有NT-FIP、MD-FIP或CT-FIP，但不单独含有GST的GST融合蛋白与重组FAK结合。综上所述，这些结果表明FIP200可以通过多个相互作用域直接和特异性地与FAK关联。

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FIP200与FAK相关性分析。（A） 顶部显示了全长FIP200的示意图。NT-FIP和CT-FIP段以及FIP200的MD-FIP如下所示。（B） 如图所示，用编码HA-FAK的表达载体和编码Flag-FIP200、其片段或空载体对照（V）的载体转染293T细胞。用抗-FAK免疫沉淀裂解液，然后用抗-FAK免疫印迹法检测相关的HA-FAK（顶面板）或用抗-Fag免疫沉淀法验证免疫沉淀中相似数量的样品（底面板；Flag-FIP200和片段用箭头标记）。（C） 如图所示，用编码HA-FAK（WT）或其片段（N末端、激酶结构域和C末端）或Pyk2激酶结构域的载体转染293T细胞。然后将转染细胞的裂解液与含有FIP200片段或仅含GST的固定化GST融合蛋白孵育，如图所示。结合蛋白在SDS-PAGE上进行解析，并用单克隆抗体12CA5（抗HA）进行Western blotting分析。（D） 用1μg重组FAK孵育等量的含有FIP200片段或仅含GST的固定化GST融合蛋白。结合蛋白在SDS-PAGE上进行解析，并通过Western blotting和抗FAK（顶面板）进行分析。膜也用Ponceau S染色来检测GST融合蛋白（用箭头标记；底部面板）。

FIP200抑制FAK激酶活性和自身磷酸化

FIP200与FAK激酶结构域的结合增加了FIP200可能影响FAK激酶活性的可能性。为了直接测试这一点，我们使用E4Y1作为外源底物，在含有FIP200片段或仅含GST的不同量纯化GST融合蛋白作为对照的情况下，进行了FAK体外激酶分析。图​图3A三A表明，含有NT-FIP和MD-FIP的GST融合蛋白抑制FAK激酶活性，而仅GST没有任何作用。含NT-FIP的GST融合蛋白比含CT-FIP的谷胱甘肽融合蛋白显示出更大的抑制作用。含有MD-FIP的GST融合蛋白表现出中间活性，也显著高于含有CT-FIP的谷胱甘肽融合蛋白。特别是，在较低浓度（例如<5 pmol/反应）下，含有NT-FIP或MD-FIP的GST融合蛋白降低了FAK激酶活性，而CT-FIP没有，这表明NT-FIP和MD-FIP在体外抑制FAK激酶活动方面比CT-FIP更有效。这些FIP200片段还抑制了来自SYF细胞的FAK（Src、Yes和Fyn表达不足），其程度与来自野生型对照细胞的FAK相同（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据），表明FIP200直接抑制了FAK的激酶活性，但不是通过其对相关Src家族激酶的潜在影响。

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FIP200抑制FAK活性。（A） 如图所示，在含有FIP200片段的各种量的GST融合蛋白或单独的GST存在下测定FAK的激酶活性。在不存在GST融合蛋白的情况下，将相对激酶活性标准化为FAK活性。显示了三个独立实验中相对激酶活性的平均值±SE。插图显示融合蛋白（1，GST-NT-FIP；2，GST-MD-FIP；和3，GST-CT-FIP）代表性制剂的考马斯蓝染色。（B） 如图所示，用编码HA-FAK和HA-FIP200的质粒、其片段或载体对照共同转染293T细胞。转染后一天，对细胞进行胰蛋白酶处理，并将其悬浮（S）或重新放置在FN（10μg/ml）上30分钟。然后用抗-HA进行裂解和免疫沉淀，然后用PY20进行Western blotting检测FAK磷酸化（顶面板）或抗-HA，以验证类似的FAK表达水平（中面板）。相应的全细胞裂解物（WCL）在SDS-PAGE凝胶上溶解，并用抗-HA蛋白进行免疫印迹，以检测类似数量的FIP200及其片段（用箭头标记，底部面板）。

接下来我们研究了FIP200及其片段对完整细胞中细胞粘附诱导的FAK磷酸化的影响。如图所示​图3B三B（顶部和中间面板），FIP200的表达抑制了FAK粘附到FN后的酪氨酸磷酸化（图​（图3B，三B、 比较车道FIP200和V）。NT-FIP或MD-FIP的表达也抑制了FAK磷酸化（图​（图3B，三B、 将车道NT-FIP和MD-FIP与车道V进行比较），而CT-FIP没有任何影响（图​（图3B，三B、 比较通道CT-FIP和V）。FIP200片段的类似表达水平通过抗HA的western blotting进行验证（图​（图3B，三B、 下部面板）。总之，这些结果表明，通过不同域的相互作用将FIP200与FAK结合可以在体外抑制FAK激酶的活性。然而，他们也表明，FIP200片段体外抑制活性的数量差异可能导致NT-FIP和MD-FIP对完整细胞中FAK活性的不同抑制，而CT-FIP则没有。

FIP200对FAK下游信号转导的影响

FAK的激活和自磷酸化被认为会导致其他几种细胞蛋白的酪氨酸磷酸化，包括paxillin、p130cas、Grb7和Shc(伯里奇等。, 1992;沙勒和帕森斯，1995年;武奥里等。, 1996;橘树等。, 1997;施莱普费尔等。, 1998;汉族等。, 2000). 因此，我们研究了FIP200对FAK促进的下游靶点激活的影响。图​图44如前所述，FAK的过度表达诱导了所有四种潜在底物（paxillin、p130cas、Grb7和Shc）的酪氨酸磷酸化(伯里奇等。, 1992;沙勒和帕森斯，1995年;武奥里等。1996年;橘树等。, 1997;施莱普费尔等。, 1998;汉族等。, 2000). 有趣的是，NT-FIP的过度表达对FAK激活和片段间磷酸化的抑制最大（见图​图3），三)FAK降低细胞粘附依赖性帕西林和Shc磷酸化（图​（图3，三，A和C），但对p130cas和Grb7磷酸化几乎没有影响（图​（图3，三、B和D）。FIP200选择性抑制FAK下游靶点的机制尚不清楚。FAK对这些底物磷酸化所需的阈值活性可能不同。因此，在这些实验条件下，FIP200对FAK的抑制足以抑制paxillin和Shc磷酸化，但不足以抑制p130cas和Grb7磷酸化。

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FIP200对FAK下游信号传导的影响。如图所示，用编码FAK、NT-FIP或空载体的质粒以及编码GFP-paxillin（A）、Myc-p130cas（B）、HA-Shc（C）或HA-Grb7（D）的载体共同转染293个细胞作为对照。转染后第1天，将细胞进行胰蛋白酶处理，并在FN（10μg/ml）上重新放置30分钟。然后用抗GFP、抗Myc或抗HA免疫沉淀整个细胞裂解液，以分别下拉表位标记的paxillin、p130cas、Shc和Grb7。然后用PY20进行免疫复合物的Western blotting分析，以检测其磷酸化（顶部面板），或用抗疟灵、抗Myc或抗HA进行分析，以显示其各自的表达水平（底部面板）。HA-Shc的位置由C中的箭头指示。

FIP200对FAK依赖性细胞扩散和迁移的影响

接下来我们研究了FIP200对FAK调节的细胞功能的影响，包括细胞扩散和迁移以及细胞周期进展。为了研究细胞扩散，我们用编码FIP200或其片段的表达载体瞬时转染NIH3T3细胞（见图​图2A）。2A） ●●●●。用抗HA抗体标记阳性转染细胞，用抗小病毒抗体标记同一领域背景未转染细胞。图​图5A5A显示用全长FIP200转染细胞可阻止细胞在FN上扩散（图​（图5，5，顶面板），而CT-FIP的表达不影响细胞扩散（图​（图5，5，底部面板）。类似的研究表明，NT-FIP或MD-FIP的表达也抑制了细胞扩散（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）。在FN上重放4小时后，细胞扩散的差异仍然明显（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据），尽管所有细胞在过夜培养后都完全扩散（见图​图7A），7A） 表明FIP200对细胞扩散的抑制是暂时的。我们还使用编码β-gal的表达载体的共转染来鉴定细胞扩散分析中的阳性转染细胞。图​图5B5B显示了使用此方法的类似结果。与对照未转染细胞或表达CT-FIP的细胞相比，FIP-200、NT-FIP或MD-FIP的表达抑制了约50%的细胞扩散。NT-FIP和MD-FIP（而非CT-FIP）抑制细胞扩散与其抑制FAK活性的相关性（见图​图3）三)提示FIP200可能通过抑制内源性FAK功能来抑制细胞扩散。与这种可能性一致的是，FAK与FIP200的共表达挽救了FIP200对细胞传播的抑制（比较图中的第一条和最后一条泳道​图5B），5B） 尽管在这些条件下，FAK的过度表达对细胞扩散没有影响。转染细胞裂解物等分样品的Western blotting显示FIP200及其片段的表达水平相似，FAK共表达对FIP200水平没有影响（图​（图5，5、C和D）。

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FIP200抑制细胞扩散。（A） 如图所示，用编码FIP200或CT-FIP的表达载体转染NIH3T3细胞。转染后第1天，将细胞胰蛋白酶化，并在FN（10μg/ml）上重新放置45分钟。细胞固定，并用抗HA进行免疫染色，以检测阳性转染的细胞（绿色），并用抗病毒蛋白显示所有细胞（红色）。（B-D）NIH3T3细胞转染有编码FIP200的载体、其片段或空载体对照，以及编码HA标记FAK的质粒（在一些实验中），以及编码β-Gal的质粒，如图所示。转染后一天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并在FN（10μg/ml）上复制45分钟。然后固定细胞，并进行β-Gal测定以鉴定阳性转染的细胞。显示了三个独立实验中扩散细胞百分比的平均值±SE（B）。全细胞裂解物（WCL）的等分样品也直接通过Western blotting进行分析，使用anti-Flag检测FIP200及其片段（C）或anti-HA检测FAK（D）。

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FIP200对细胞周期进程的调节。如图所示，用编码HA-FIP200或其片段的表达载体或无关的控制蛋白（C）转染（A和B）NIH3T3细胞或模拟转染。然后按照“材料和方法”中的描述对其进行BrdU掺入分析。（A）转染HA-FIP200或对照细胞的代表性区域。抗-HA免疫染色鉴定阳性转染细胞（绿色），抗-BrdU染色显示新DNA合成细胞（红色）。（B） BrdU百分比的三个独立实验的平均值±SE+/通过分析多个场中每次转染至少80个阳性转染细胞来确定阳性转染的细胞。（C） 如图所示，NIH3T3细胞与编码FAK和编码HA-FIP200或空载体对照（V）的表达载体共转染。还包括编码β-Gal的质粒。然后按照“材料和方法”中的描述对其进行BrdU掺入分析。通过抗β-Gal免疫染色鉴定阳性转染细胞+/β-半乳糖+通过分析40–50β-Gal测定细胞+每个细胞在多个场中进行转染。BrdU阳性细胞的百分比归一化为100%的载体控制。结果显示三个独立实验的平均值±SE*p=0.18和0.59分别是空载体加FAK转染和HA-FIP200加FAK转基因的值，与空载体单独转染的值相比。插入物显示FIP200（α-HA-blot）的表达水平与FAK共转染或未共转染（KT3 blot）相似。

用编码FIP200或其片段的表达载体和编码GFP的质粒瞬时转染NIH3T3细胞后，通过单层损伤试验评估FIP200及其片段对细胞迁移的影响。在受伤后定期采集相位对比度和荧光图像，以监测细胞从伤口边缘到伤口中心的运动。然后通过测量GFP阳性细胞在8小时内向伤口中心移动的距离，计算伤口边缘转染细胞的迁移率，如图所示​图6A，6A、 用控制载体转染的细胞（图​（图6V）6V） 以与周围未转染细胞相同的速率向伤口中心移动。相反，FIP200转染的细胞比周围未转染的细胞移动得少得多。迁移率的量化显示，FIP200、NT-FIP和MD-FIP抑制细胞迁移约60-80%，而CT-FIP没有影响（图​（图6B）。6B） ●●●●。此外，FAK或paxillin与FIP200的共表达可缓解FIP200对细胞迁移的抑制（图​（图6B）。6B） ●●●●。如前所述，使用基于延时成像的计算机化运动分析方法OMAware的替代细胞迁移分析也获得了类似的结果(汉族等。, 2000). 虽然FIP200抑制细胞迁移，但与FAK共表达可将这种抑制逆转至控制水平（图​（图6C）。6C） ●●●●。综上所述，这些结果表明，FIP200抑制FAK导致抑制FAK依赖性细胞的扩散和迁移，并表明抑制FAK下游的paxillin磷酸化可能是这些影响的原因。

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FIP200抑制细胞迁移。如图所示，将生长在FN（10μg/ml）上的（A和B）NIH3T3细胞转染FIP200、其片段或空载体对照，在一些实验中使用编码FAK或paxillin的载体，以及以7:1比例编码GFP的质粒。转染后一天，用p10尖端损伤细胞单层，在37°C下培养，每隔2小时拍摄一次图像，直到8小时。典型实验的图像显示在a中。通过量化阳性转染细胞（GFP）的总距离来测量迁移率+)在8小时内从伤口边缘向伤口中心移动。（B）三个独立实验得出的迁移率的平均值±SE*与单独转染载体的细胞相比，从左到右，样品的p分别为0.48、0.76、0.32和0.89。（C） 如“材料和方法”所述，还使用基于延时视频显微镜的OMAware分析FN（5μg/ml）上细胞的运动性。对照未转染细胞（a）、转染了编码FIP200（b）的表达载体的细胞、，以及用编码FIP200和FAK（c）的两种载体转染的细胞。箭头表示阳性转染细胞。同一领域的未转染细胞作为内部控制。

FIP200对细胞增殖的抑制及其FAK的拯救作用

为了探索FIP200在细胞周期进展中的潜在作用，我们用编码FIP200或其片段的表达载体瞬时转染NIH3T3细胞（见图​图2A），2A） ，然后测量BrdU掺入的程度。图​图7A7A显示FIP200的过度表达抑制了BrdU掺入测量的细胞周期进展（图​（图7A，7A、 顶部面板）。在相同条件下，编码无关蛋白的控制载体的表达不会影响BrdU掺入（图​（图7A，7A、 底部面板）。定量分析表明，与转染对照质粒或模拟转染细胞的细胞相比，FIP200抑制了约90%的细胞周期进展（图​（图7B）。7B） ●●●●。类似分析表明，NT-FIP和MD-FIP也抑制BrdU掺入，抑制程度与全长FIP200相似，而CT-FIP没有任何影响。在任何转染细胞中都没有凋亡的证据（S.Abbi、H.Ueda和J.Guan，未发表的数据），这表明细胞周期效应不是由于FIP200或其片段在细胞生存或凋亡中可能起的作用。

FAK已被证明在细胞周期进展中发挥作用(赵等。, 1998)，我们已经证明FIP200可以抑制FAK活性。因此，我们检测了FAK和FIP200的过度表达是否可以挽救这种对细胞周期进展的抑制。在这些条件下，FAK本身并没有促进细胞增殖，但它将FIP200对BrdU掺入的抑制作用恢复到了控制水平（图​（图7C）。7C） ●●●●。细胞裂解物等分样品的蛋白质印迹显示，FAK的共表达并不影响FIP200的表达水平（图​（图7C，7C、 插图）。总之，这些数据表明FIP200对FAK的抑制也会导致FAK依赖性细胞周期进展的抑制。

内源性FIP200与FAK功能相互作用的破坏效应

我们还通过破坏这两种蛋白质的功能相互作用，研究了FIP200作为FAK的蛋白质抑制剂的作用。虽然FIP200可以通过多个域与FAK关联（参见图​图2），2)，与FAK激酶结构域结合的FIP200负责抑制体内FAK激酶和细胞活性（见图​图3三–7). 因此，我们设计了一个FAK构造，即KD韩国，仅包含FAK的激酶结构域（残基403–672）和激酶缺陷突变（K454到R）。KD过度表达韩国应滴定FAK激酶结构域的FIP200功能结合位点，从而减轻其对FAK的抑制。使用激酶缺陷突变体代替野生型激酶结构域构建，以最小化表达该结构域（作为激酶）的潜在影响，而不是与FIP200结合的内源性FAK激酶结构域竞争。这种突变并不影响其与作为KD的FIP200的结合韩国与野生型激酶结构域对应物一样有效地结合FIP200（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）。

我们首先研究了KD的影响韩国细胞粘附过程中FAK磷酸化。与FIP200作为FAK抑制剂相一致，KD的过度表达韩国与转染对照质粒的细胞相比，PLL细胞中FAK的酪氨酸磷酸化增加（图​（图8A）。8A） ●●●●。KD的特异性韩国影响FIP200/FAK相互作用的原因是，在山梨醇刺激或不刺激的情况下，它对Pyk2的酪氨酸磷酸化缺乏影响（图​（图8B）。8B） ●●●●。然后我们检查了KD的影响韩国通过测量FN或PLL上细胞的BrdU掺入，研究FAK依赖性细胞周期进展。图​图8C8C表明，在实验条件下，大量（～50%）的FN细胞进入了细胞周期的S期，而只有一小部分（～10%）的PLL细胞进入了S期。相反，KD的过度表达韩国导致PLL细胞周期进展减少的部分缓解（～30%）。这些结果表明，FIP200对FAK抑制的破坏可能导致FAK磷酸化增加，并在细胞与FN无粘附的情况下部分恢复细胞周期进程。除了FAK磷酸化外，可能还需要来自FN的其他信号来全面恢复细胞周期进程。然而，这些数据进一步支持FIP200作为FAK的蛋白抑制剂。

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内源性FIP200与FAK相互作用的中断。（A和B）NIH3T3细胞与编码HA标记KD的质粒共转染韩国或不相关的控制蛋白（Grb7 SH2结构域，指定为C）和编码HA-FAK或HA-Pyk2的质粒，如图所示。转染后第1天，将细胞进行胰蛋白酶处理，重新接种在PLL（0.1 mg/ml）或FN（10μg/ml；A）或饥饿的血清上，并用或不用山梨醇处理（400 mM，10 min；B），如图所示。然后用抗-HA或抗-Pyk2免疫沉淀细胞裂解物，并用PY20（顶面板）或抗-HA（中面板）进行免疫印迹。全细胞裂解物（WCL）也用抗HA（底部面板）进行印迹，以显示转染KD的水平韩国和控制蛋白（C）。（C） 用编码HA标记的KD的质粒转染NIH3T3细胞韩国或不相关的对照蛋白，或模拟转染的，如所示。然后按照“材料和方法”中的描述，分析FN（10μg/ml）和PLL（0.1 mg/ml）上的BrdU掺入+/在每个实验中，计算阳性转染细胞，并将其归一化为未转染细胞。显示了三个独立实验数据的平均值±SE。

讨论

FIP200是一种新的细胞蛋白，最近通过酵母双杂交筛选发现它与FAK相关激酶Pyk2相互作用(上田等。, 2000). 此外，FIP200可以通过与Pyk2的激酶结构域直接结合来抑制其激酶和细胞活性。与Pyk2的受限表达模式相反(乌辣罕等。, 1995;列夫等。, 1995)，FIP200在许多组织和细胞系中广泛表达(长濑等。, 1996;上田等。, 2000)这表明它可能在涉及FAK的一些基本细胞过程中发挥重要作用。在本报告中，我们提供证据证明FIP200是一种新型的FAK蛋白抑制剂。FAK在整合素的信号转导中发挥着重要作用，这一点已被广泛报道。最近的研究已经确定了与FAK相互作用并在细胞功能调节中调节其下游通路的多种信号分子(帕森斯，1996;Cary和Guan，1999年;施莱普费尔等。, 1999). 然而，据我们所知，FIP200是第一个报道的FAK蛋白抑制剂，其功能是直接结合其激酶结构域，从而抑制其激酶和细胞活性。

连同我们之前的报告(上田等。, 2000)这些结果表明，FIP200可以作为FAK家族酪氨酸激酶、FAK和Pyk2两个成员的蛋白抑制剂。此外，FIP200对FAK和Pyk2的抑制可能由类似的机制介导，因为两者都涉及FIP200与激酶催化域的结合。相反，我们无法检测到FIP200与另一酪氨酸激酶Src的结合（S.Abbi、H.Ueda和J.Guan，未发表的数据），表明FIP200对FAK家族激酶具有特异性。研究表明，FAK和Pyk2在激活时都与Src家族激酶相关(陈等。, 1994;科布等。, 1994;沙勒等。, 1994;Xing（兴）等。, 1994;列夫等。, 1995). 然而，我们之前表明，FIP200抑制SYF细胞Pyk2的激酶活性（缺乏Src、Yes和Fyn表达），其程度与野生型对照细胞Pyk2相同(上田等。, 2000). 从SYF或对照细胞中分离的FAK也获得了类似的结果（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）。这些结果支持FIP200直接抑制FAK和Pyk2的激酶活性，而对相关的Src家族激酶几乎没有影响。

尽管FIP200对FAK和Pyk2的抑制有这些相似之处，但FIP200的不同片段参与了它与这两种激酶的催化域的相互作用。虽然CT-FIP，但不是NT-FIP或MD-FIP，与Pyk2激酶结构域结合(上田等。, 2000; 参见图​图2C），2C） 我们发现NT-FIP和MD-FIP都与FAK激酶结构域相关，并抑制其激酶和细胞活性。此外，CT-FIP结合到FAK的N末端结构域，仅当在高浓度下使用时（但在低浓度下无效），在体外降低FAK激酶活性，并且在体内不抑制FAK功能。这些结果表明，FIP200的不同残基参与了其与FAK和Pyk2的结合，尽管它们具有同源的激酶结构域。事实上，尽管FAK和Pyk2之间存在同源性，但它们被细胞内的不同信号激活，并在体内发挥不同的功能作用。除了常见的结合伙伴外，还有一些蛋白质可以与其中一个结合，但不能与另一个结合。例如，NIRS（哺乳动物同源物果蝇属视网膜降解B；列夫等。, 1999)绑定到Pyk2，但不绑定到FAK。同样，talin可以区分FAK和Pyk2的C末端结构域，这两个结构域39%相同，并且仅与FAK结合(郑等。, 1998). 最近，人们发现了一种新的蛋白质PSGAP，它可以在体外结合Pyk2和FAK，但只在Pyk2介导的信号传导中发挥作用(任等。, 2001). 因此，这些蛋白质似乎能够利用Pyk2和FAK中的细微差异来调节差异性相互作用和功能。FIP200与FAK和Pyk2的差异结合也提出了一种有趣的可能性，即FIP200可能与这两种激酶相互作用，并在某些条件下协调它们的信号功能。目前正在进行实验，以确定FIP200与FAK以及Pyk2相互作用所涉及的序列模体，从而进一步深入了解相互作用的分子机制和可能的关系。

通过FAK的整合素信号已被证明调节多种细胞功能，包括细胞扩散、迁移和细胞周期进展(克拉克和布鲁格，1995年;施瓦茨等。, 1995;帕森斯，1996;Cary和Guan，1999年;施莱普费尔等。, 1999). FIP200或其片段在成纤维细胞中的过度表达抑制了这些细胞功能，这与其作为FAK的蛋白抑制剂是一致的。一些证据表明，FIP200通过抑制FAK影响这些细胞功能，尽管我们不能完全排除其他机制的可能参与。首先，FIP200对细胞扩散、迁移和细胞周期进程的抑制完全被FAK的共表达所挽救。其次，FIP200片段对这些细胞活性的抑制与其体内结合FAK激酶结构域和抑制其生化活性（通过自身磷酸化测定）的能力相关（图​（图3B）。三B） ●●●●。值得注意的是，全长FIP200（图​（图1E，1E、 底部面板）或其碎片（S.Abbi和J.Guan，未发表的数据）不影响FAK在焦点接触中的定位，表明FIP200并没有通过改变FAK定位来抑制这些细胞活动。第三，NT-FIP的表达降低了几个FAK下游靶点的酪氨酸磷酸化，包括帕西林和Shc（图​（图4），4)已证明在这些细胞功能中发挥作用。第四，FIP200没有抑制FAK的迁移−/−FN上的细胞（S.Abbi、H.Ueda和J.Guan，未发表的数据），表明其对细胞功能的影响是通过与FAK的相互作用而实现的。此外，内源性FIP200/FAK与FAK激酶结构域的功能性相互作用的破坏（具有激酶缺陷突变）可增加PLL上细胞的FAK磷酸化并部分恢复细胞周期进程（图​（图8）。8). 这种结构的特异性得到了对Pyk2激活刺激缺乏影响的支持（图​（图8B）。8B） ●●●●。这也得到了以下事实的支持：已知没有其他蛋白质与FAK的这一区域相互作用（残基403–672，排除了FAK基序，如Y397或P712/715），因此可能受到非特异性影响。它是激酶死亡的版本，因此潜在的非特异性效应在这里也被最小化。最后，它只影响PLL上细胞的FAK磷酸化和BrdU掺入（当FIP200与FAK相关时；见图​图1）1)但不适用于FN上电镀的细胞（当存在最小的FIP200/FAK复合物时；见图​图1）。1). 如果它通过其他机制增强了BrdU的掺入，人们预计它在这两种条件下都会产生影响（例如，v-Src的共转染将导致PLL和FN上细胞的FAK磷酸化增强；Guan和Shalloway，1992年). 综上所述，这些数据表明FIP200在适当的细胞环境中也起到FAK抑制剂的作用。

基于这些结果，我们提出了以下关于FIP200与FAK相互作用在整合素介导的细胞粘附和信号传递中的作用的工作假设（图​（图9）。9). 在未转染的对照细胞中（图​（图9，9，A，左），一些FIP200和FAK在悬浮条件下络合。在细胞粘附和整合素与配体结合方面，FIP200与FAK分离。负性抑制剂的释放可能有助于细胞粘附中FAK的激活和磷酸化，从而触发各种细胞功能中的下游信号通路，如细胞迁移和增殖。FIP200在这些细胞中过度表达（图​（图9，9，B，右）推动FIP200与FAK（即使在粘附细胞中）的更多关联达到平衡，从而导致FAK信号和功能的抑制。这些假设与图中的结果一致​图11和其他观察结果(克拉克和布鲁格，1995年;施瓦茨等。, 1995;帕森斯，1996;Cary和Guan，1999年;施莱普费尔等。, 1999). 虽然该模型暗示了FIP200在整合素激活FAK的调节中的一些作用，但重要的是要注意，其他因素也可能在整合素酶或其他受体激活FAK中起关键作用。

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细胞粘附过程中FIP200与FAK相互作用的工作假设。

对于我们提出的FIP200作为FAK蛋白抑制剂的作用的一个潜在担忧是，数据主要基于FIP200或其片段的过度表达。当过度表达时，阳性活性复合物组分的蛋白质可能作为主要抑制剂（例如，p85亚单位的过度表达抑制p85/p110复合物的PI3K功能）。然而，在本研究中，过表达研究得到了其他补充方法的数据支持。这些包括内源性蛋白质的关联和调节（图​（图1），1)，使用纯化蛋白质进行体外研究（图​（图22和​和3A），三A） ，以及FAK片段的表达，该片段中断了FIP200与FAK的功能性相互作用（图​（图8）。8). 鉴于这些其他方法的一致结果，内源性FIP200不太可能作为阳性FAK复合物的一部分发挥作用。

有趣的是，FIP200抑制FAK介导的帕罗西汀和Shc的活化，而对p130cas和Grb7磷酸化没有影响。激活其各种底物所需的FAK的阈值活性可能存在差异，尽管FIP200对FAK活性的抑制足以阻止其激活paxillin和Shc，但不会影响其他下游靶点的激活。还可能存在FAK与其各种底物的单独复合物，它们与FIP200的相互作用在细胞内受到不同的调节。无论如何，这些数据表明，FIP200对FAK介导的paxillin和/或Shc酪氨酸磷酸化的抑制至少是FIP200抑制各种细胞活动的部分原因。有趣的是，FRNK抑制细胞扩散与帕西林酪氨酸磷酸化降低相关(理查德森和帕森斯，1996年;理查森等。, 1997). 此外，最近有报道称，帕西林的酪氨酸磷酸化及其与Crk刺激肿瘤细胞系NBT-II在胶原上迁移的关系(佩蒂特等。, 2000). 此外，使帕西林去磷酸化的磷酸酶PP2A负向调节细胞周期进展和细胞运动(Wera和Hemmings，1995年;伊藤等。, 2000). 与paxillin在细胞运动中的作用相一致，我们还观察到paxilin的过度表达挽救了FIP200对细胞迁移的抑制（图​（图6B）。6B） ●●●●。需要进一步的研究来阐明各种FAK下游靶标在FIP200调节细胞活性中的作用。

先前的研究表明，许多蛋白酪氨酸磷酸酶通过FAK去磷酸化抑制FAK信号传导(阿雷奎等。, 1998;塔穆拉等。, 1998;于等。, 1998;安格斯-卢斯托等。, 1999;马内斯等。, 1999;苗族等。, 2000;). 然而，所有这些抑制事件都需要磷酸酶的酶活性。相反，FIP200通过与FAK的激酶结构域结合来抑制FAK，这为开发FAK的小肽抑制剂提供了潜在机会。有趣的是，两个FIP200片段（NT-FIP和MD-FIP）都可以通过明显相似的机制抑制FAK。NT-FIP和MD-FIP之间有几个高同源性区域（～30%同源性）。未来的研究将有必要确定这些共同区域是否在FIP200与FAK的相互作用中发挥作用。作为FAK抑制剂的小肽或其衍生物的可能产生也是一个令人兴奋的未来研究途径，特别是因为FAK的激活与癌症转移等疾病有关(韦纳等。, 1993;欧文斯等。, 1995).

致谢

我们感谢C.Turner博士的GFP-paxillin、S.Hanks博士的Myc-p130Cas、D.Schlaepfer博士的HA-Shc、D.C.Han博士的HA-Grb7质粒以及D.W.Fry博士的编码His-tagged FAK的重组杆状病毒。我们还感谢Jackie Wypij在一些实验中提供的帮助，以及Jihe Zhao、Dong Cho Han、Heinz Reiske和Tang Long Shen对手稿的批判性阅读和有益的评论。这项研究得到了美国国立卫生研究院的支持（向J.-L.G.授予GM48050和GM52890）。J.-L.G.也是美国心脏协会的资深研究员。

使用的缩写：

溴化铀溴脱氧尿苷
CT-FIP公司C端子FIP
FAK（传真）粘着斑激酶
FIP200型200 kDa的FAK家族相互作用蛋白
第2页XXXX年
GFP公司绿色荧光蛋白
消费税谷胱甘肽S公司-转移酶
哈血凝素
免疫球蛋白免疫球蛋白
单克隆抗体单克隆抗体
MD-FIP公司中间域FIP
NT-FIP公司N端FIP
聚合酶链反应聚合酶链反应
锁相环聚乙烯-我-赖氨酸
第2页Src同源性2

脚注

文章在印刷前在线发布。Mol.Biol。单元格10.1091/mbc。E02–05–0295。文章和出版日期为www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc。E02–05–0295。

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文章来自细胞分子生物学由提供美国细胞生物学学会