Sir-Celecoxib是一种广泛使用的非甾体抗炎药，通过选择性抑制COX-2发挥作用。在这里，我们证明塞来昔布还显著增加了糖皮质激素受体（GR）的核定位，增加了GR与DNA反应元件的结合，并增强了GR介导的基因转录与p38 MAP激酶的抑制相关。这些结果扩大了COX-2抑制剂的细胞内靶点，同时扩大了其在与GR功能受损相关的多种疾病（包括抑郁症）中的潜在临床应用。
糖皮质激素在形成并最终抑制对环境应激源的生理反应方面发挥着重要作用，包括早期、先天的免疫反应（炎症）；交感神经系统的激活和神经内分泌途径的刺激，如果在压力源停止后继续保持不变，所有这些都会产生大量不良的健康后果。1许多疾病，包括某些自身免疫、感染性和炎症性疾病，以及一组神经精神疾病，如抑郁症，都与糖皮质激素反应性降低和GR功能受损有关。2,三这些疾病中GR功能受损的一个潜在介质是促炎细胞因子。三每种疾病的特征都是促炎细胞因子的循环和/或组织表达增加。此外，已发现促炎细胞因子通过其信号通路对GR功能进行负调控。例如，p38 MAPK通路的IL-1α激活已被证明可降低GR DNA结合和GR介导的基因转录。4在JNK和NF-kB炎症信号通路激活后，GR活性也出现了类似的下降。5,6
在本研究中，使用稳定转染MMTV-荧光素酶构建物的大鼠神经元PC12细胞来研究COX抑制对GR功能的直接影响。用选择性COX-2抑制剂塞来昔布处理细胞，在处理5和24小时时均能显著诱导GR介导的荧光素酶活性，且呈剂量依赖性(). 非选择性COX抑制剂布洛芬（100–1000μM）也有类似结果。有趣的是，戊基水杨酸（COX-1选择性抑制剂）对GR介导的荧光素酶活性没有影响，表明COX抑制对GR功能的影响是COX-2特异性的。为了确定塞来昔布对荧光素酶活性影响的GR特异性，我们将PC12细胞与塞来昔布和GR拮抗剂RU486（40μM）单独或联合处理5小时（数据未显示）。RU486显著降低塞来昔布对GR介导的荧光素酶活性的影响（降低32%，n个=每组3人，P（P）使用Newman–Keuls多重比较试验<0.05），尽管如之前报道的那样，RU486单独诱导GR功能轻度增加。7GR在基础条件下主要位于细胞质中，其核积累对于GR DNA结合和/或与其他相关转录因子的相互作用至关重要。因此，我们检测了塞来昔布处理的细胞核提取物中的GR蛋白，该细胞经合成糖皮质激素地塞米松（Dex）协同处理或不协同处理。如中所示塞来昔布单独或与地塞米松合用均导致GR核定位显著增加。值得注意的是，GR核定位伴随着GR与其DNA糖皮质激素反应元件（GRE）结合增加的证据，这是由电泳迁移率变化分析（EMSA）测定的(). 使用TansAM GR转录因子分析（Active Motif，Carlsbad，CA，USA）治疗塞来昔布（Cbx）后，GR-GRE结合显著增加（平均吸光度：对照177.7（SD 4.0）；Cbx 50μM 5 h 227.8（标准偏差15.4）；Cbx 50μM 24小时252.0（标准偏差15.4）；Dex 10 nM 2 h 348.7（标准偏差20.1），F类(3,8) = 69.0,P（P）< 0.001). 由于某些COX抑制剂也被报道抑制p38 MAPK，8为了探讨COX-2抑制剂介导的GR功能增强的分子机制，我们研究了塞来昔布对p38 MAPK的直接影响。中的结果表明塞来昔布单独（50μM）可显著降低磷酸化p38 MAPK。为了进一步研究p38的受累情况，我们使用了选择性p38激活剂茴香霉素。茴香霉素（50 ng/ml）对p38磷酸化具有强烈的时间依赖性诱导作用(). 此外，结果表明，茴香霉素联合治疗可显著逆转塞来昔布对GR功能的影响(). 本研究的结果首次表明，广泛使用的选择性COX-2抑制剂塞来昔布可诱导GR核定位并增强GR介导的基因转录。塞来昔布对GR功能的积极作用似乎是通过抑制p38 MAPK。本研究的数据表明，抑制COX通路可能是以糖皮质激素反应性降低为特征的疾病的GR功能正常化的治疗靶点。有趣的是，除了与炎症性疾病相关外，糖皮质激素反应性降低在神经精神疾病中常见，其中最显著的是抑郁症。这些数据表明，COX-2抑制剂可能是治疗抑郁症的新型治疗药物。事实上，与塞来昔布一样，抗抑郁药已被证明可以转移GR并增加GR介导的基因转录。9考虑到包括p38和COX-2在内的炎症信号通路对长期增强（LTP）的负面影响10和神经发生，11抑制COX-2可能是实现多种病理生理目标的独特途径，包括但不限于情感障碍中的GR。
（a） 用MMTV荧光素酶构建体稳定转染的PC12细胞在12孔培养板中生长至80%汇合，并用塞来昔布（Cbx）和山莨菪碱（Anis）单独或组合以所示浓度处理。在加入塞来昔布之前，用茴香霉素和塞来昔布加用茴香菌素处理的细胞培养1小时。培养5小时后收集细胞，并评估荧光素酶活性。每个数据点代表至少三个单独实验的平均值±SE**指示P（P）与对照组相比<0.001，**表示P（P）与Cbx单独使用相比<0.001。（b） 为了评估GR核转位，PC12细胞在有无Dex的情况下用塞来昔布（50μM）处理5小时（10 nM，2小时）。使用来自ABR-亲和生物试剂（Golden，CO，USA）的GR抗体，通过Western blot分析每个治疗组的核提取物（25μg）。核提取物通过在高盐缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，420 mM NaCl，10 mM KCl，0.1 mM Na）中重新悬浮核颗粒获得三VO（旁白）41 mM EDTA、1 mM EGTA、20%甘油、0.5 mM PMSF和1 mM DTT），并在4°C下剧烈摇晃30分钟。然后以48000 rpm（4°C）离心30 min后收集核提取物。GR-糖皮质激素受体。肌动蛋白被用作加载控制。（c） 使用EMSA和32P标记的合成双链GRE寡核苷酸（5′-AAG ATT CAG GTC ATG ACC TGA GGA）。数据来自三个独立实验的代表性实验。（d） 为了检测处理对p38 MAPK的影响，在细胞经塞来昔布（50μM）和/或茴香霉素（50 ng/ml）处理后，分离细胞总提取物。使用磷酸化p38 MAPK单克隆抗体通过Western blot分析每个治疗组的蛋白质（50μg）。
