临床投资杂志。2005年10月1日；115(10): 2784–2792.
在进行性脑病中线粒体复合物I组装的分子伴侣发生突变
,1 ,2和1,三
奥格尔维岛
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所。2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系。三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学人类遗传学系。
南希·G·肯纳韦
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所。2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系。三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学人类遗传学系。
埃里克·A·寿桥
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所。2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系。三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学人类遗传学系。
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所。2美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学分子与医学遗传学系。三加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学人类遗传学系。
通信地址：Eric A.Shoubridge，蒙特利尔神经研究所，3801 University Street，Montreal，Quebec H3A2B4，Canada。电话：（514）398-1997；传真：（514）398-1509；电子邮件：ac.lligcm.im.cpcire@cire. 收到日期：2005年6月20日；2005年7月26日接受。
摘要
NADH：泛醌氧化还原酶（复合物I）缺乏是线粒体氧化磷酸化疾病的常见原因。它与婴儿的多种临床表型相关，包括Leigh综合征、心肌病和脑肌病。在至少一半的患者中，酶缺乏是由于未能组装全酶复合物所致；然而，组装哺乳动物酶所需的分子伴侣尚不清楚。使用带有和不带有复合物I的酵母的全基因组减法来生成候选装配因子，我们确定了一个副产物(B17.2升)的B17.2段结构亚单位。我们在B17.2升在一名进行性脑病患者中发现，相关的复合物I组装缺陷可以通过患者成纤维细胞中B17.2L的逆转录病毒表达而完全修复。抗B17.2L抗体与全酶复合物无关，但在一些具有复合物I组装缺陷的患者中特异性识别出830-kDa亚组分，并从正常人心脏线粒体共免疫沉淀出复合物I结构亚单位的子集。这些结果表明，B17.2L是一种真正的分子伴侣，对复合物I的组装和神经系统的正常功能至关重要。
介绍
NADH：泛醌氧化还原酶（复合物I）催化线粒体呼吸链的第一步，其中电子从NADH转移到泛醌（辅酶Q）伴随着质子穿过线粒体内膜的易位。这有助于形成质子电化学梯度，用于通过络合物V（ATP合成酶）合成ATP。在原核生物中，复合体I由14个结构亚单位组成的基本核心组成，这些亚单位被认为是由用于电子传递和质子传递的独立模块融合而来(1). 在进化过程中，许多所谓的额外亚单位被添加到复合物中，现在在需氧真菌中包含37-40个亚单位，在哺乳动物中至少包含46个亚单位。其中7个亚单位编码在线粒体DNA中(2–4). 该复合物形成一个L形结构，其疏水臂包含嵌入线粒体内膜的mtDNA编码亚单位，亲水外周臂包含延伸至线粒体基质的NADH结合位点和氧化还原活性中心(5,6).
现已在复合物I的9个核编码结构亚单位中描述了致病突变(NDUFS1、NDUFS2、NDUFS 3、NDUVS4、NDUXS7、NDUFS8、NDUFV1、NDUS6、和NDUFV2型) (7–15). 这些与多种常染色体隐性遗传、早发、致命的临床表型相关，包括Leigh综合征、心肌病和脑肌病。一项对1组常染色体隐性遗传复合物I患者中几乎所有结构亚单位编码基因的调查显示，约60%的患者未能发现突变(16)，表明与复合体I的组装或维持有关的因素是疾病的重要原因；然而，对哺乳动物这些过程的调控知之甚少。
用于研究复合物I生物发生的最广泛的模式生物是需氧真菌粗糙脉孢菌。酶在N.克拉萨将基质和膜臂组装成独立的模块，然后将其逐步连接在一起形成全酶(17). 阻止一条或另一条手臂组装的结构亚单位突变导致未受影响的手臂堆积。膜臂本身由一个小的和一个大的亚复合物的结合形成，两个组装蛋白CIA30和CIA84通过与大的膜臂亚复合物短暂结合在这个过程中发挥作用(18). CIA30具有哺乳动物同源物，但其在哺乳动物细胞中的功能尚未得到证实，在复杂I装配缺陷患者中尚未发现该基因的突变(19).
有人认为，人类复合体I的组装是通过一种类似于神经孢子菌属(20); 然而，还没有令人信服地证明膜和外周臂的独立亚复合物的存在，而在一些复杂I装配缺陷患者的骨骼肌中发现了包含双臂成分的亚复合物(21). 此外，膜臂结构亚单位的突变(22)阻止全酶组装而不明显积累亚复合物。
在本研究中，我们试图使用生物信息学方法识别复杂的I组装因子。我们证明了这一点B17.2升是基质臂中编码一个小结构亚单位的基因的副序列，作为一个复杂的I组装因子，当发生突变时，会导致早期发作的进行性脑病。
结果
候选复合物I装配基因的鉴定。
发酵酵母酿酒酵母是最广泛用于研究线粒体氧化磷酸化的模式生物；然而，它缺乏一个复杂的I，这阻碍了对复杂I生物成因的研究。最近，其他几种酵母的基因组已全部测序，其中2种，溶脂雅罗华和汉森德巴利酵母，是表达复合物I的需氧酵母。我们推断，通过使用全基因组减法鉴定需氧酵母常见但在发酵酵母中缺失的线粒体蛋白，应该可以找到复合物I组装基因。为了验证这一想法，我们首先评估了与溶脂酵母和D.汉塞尼但不在酿酒酵母,乳克鲁维酵母、和光滑念珠菌（472个家族的1080个序列，在Genolevres网站上分类），用于使用MITOPRED程序进行线粒体靶向。这产生了141个家族，其中1个或多个成员被预测为线粒体。然后我们使用PSI-Blast搜索来确定这些蛋白质的哺乳动物同源物。使用线粒体靶向的MITOPRED和MitoProt II对这些进行了重新测试。该策略有望获得大多数核编码复合物I结构亚单位，事实上，我们能够在27个预测的核编码亚单位中识别出16个溶脂酵母与人类同源物(2). 此外，我们鉴定了唯一已知的复合物I组装因子CIA30和CIA84的同源序列，它们在真菌中已被鉴定N.克拉萨在排除这些复杂的I结构亚单位和装配因子后，我们剩下36个基因家族。人工处理去除了另外22个蛋白质功能已经明确或靶向预测明显错误的家族。
在这项研究揭示的基因中，我们称之为1B17.2升（对于B17.2类），作为一个复杂的组装因子，似乎是一个特别好的候选。B17.2升是B17.2段是一种编码复合体I基质臂中一个小结构亚单位的基因。虽然不存在于原核生物中包含复合体I核心14个结构亚基的nuo操纵子中，但B17.2结构亚单位存在于线粒体的直接祖先α-蛋白杆菌（COG 3761）的基因组中。它在其他细菌中不存在，包括大肠杆菌.
B17.2和B17.2L预测蛋白的比对表明，它们的同源性为17%，相似性为31%，没有大的序列保留块（图A） ●●●●。这个B17.2升基因似乎是结构亚单位基因的古老复制，因为它存在于基因组测序过的所有真核生物中，除了那些缺乏复合物I的真菌，但在原核生物中不存在(4). 多序列比对B17.2升脊椎动物和溶脂酵母在脊椎动物中，蛋白质N末端部分的序列同源性相对较高，长C末端尾部缺失（图B） ●●●●。总的来说，酵母蛋白与人类蛋白的同源性为20%，相似性为34%。
人类B17.2和B17.2L预测蛋白序列的比对(A类)和B17.2L的多重对齐(B类)显示了酵母对人类蛋白质的保护作用。
B17.2升定位于人类染色体5q，人类2号染色体上有一个假基因。它很可能是一种可溶性蛋白质，因为预计它没有跨膜结构域（TMpred或TMHMM）。
人体组织中B17.2L的线粒体靶向和表达。
据预测，B17.2L蛋白产物被MITOPRED（100%）和MitoProt II（97%）以线粒体为靶点。为了验证这一点，我们在HEK293细胞中瞬时表达了B17.2L-GFP融合蛋白，并将其分布与线粒体标记物MitoTracker红的分布进行了比较。两幅图像的叠加显示红色和绿色荧光信号完全重叠（图A） ，证实了B17.2L的线粒体靶向性。免疫印迹分析表明，B17.2L普遍表达，尽管与其他线粒体标记物相比，组织中的蛋白质稳态水平存在一些变化（图B） ●●●●。特别是，与心脏、肝脏或成纤维细胞相比，骨骼肌中相对于孔蛋白或49-kDa复合物I亚单位的B17.2L更少。
B17.2L的线粒体定位和组织特异性表达(A类)用表达B17.2L-GFP融合蛋白的载体转染HEK293细胞，用线粒体标记物MitoTracker红染色，并在荧光显微镜下观察。这两个图像的叠加显示了这两个标记的完全重叠，显示了B17.2L的线粒体定位(B类)人体组织中B17.2L的免疫印迹分析。用抗B17.2L抗体通过免疫印迹分析测定正常人成纤维细胞（F）、心脏（H）、骨骼肌（M）和肝脏（L）中B17.2L的稳态水平。孔蛋白是一种线粒体外膜蛋白，与复合物I的49-kDa结构亚单位进行了比较。
复合物I组装缺陷和进行性脑病患者B17.2L突变。
我们最初对8名患者的B17.2L cDNA进行了测序，我们之前对这些患者的复杂I组装缺陷进行了表征。我们在该基因的第2外显子中发现了一个明显纯合子C182T突变B17.2升，预测进展性脑病患者蛋白质中氨基酸45（R45X）提前停止（图、A和B）。基因组DNA第2外显子的测序显示出相同的明显纯合子突变，这已通过包含突变位点的PCR产物的RFLP分析得到证实（图C） ●●●●。基于限制性内切酶的分析显示，母亲是突变的杂合子；然而，父亲似乎是野生型序列的纯合子。这表明患者可能从母亲那里遗传了2个等位基因（等位基因），或者患者实际上是突变等位基因的半合子，从父亲那里遗传了一个缺失的等位基因。使用覆盖5号染色体的微卫星标记，我们发现患者中有16/18个标记是杂合的（数据未显示），这使得母亲不太可能发生等位基因分裂，并表明父亲将一个缺失的等位基因传给了女儿，而这两个标记都是半合的B17.2升对另外20名患有复合I缺陷症的患者进行测序，未能发现B17.2升.
分析B17.2升复杂I装配缺陷患者的基因。(A类)DNA序列分析B17.2升患者中显示C182T突变的cDNA。(B类)已预测B17.2升显示突变位置的基因结构和基因外显子2中预测的无义密码子。基因表示下面的灰色线表示B17.2结构域的位置。(C类)基于限制性内切酶的患者和父母基因组DNA外显子2突变分析。病人的突变破坏了限制酶的一个位点Taq1型.
患者成纤维细胞复合物I缺陷的功能互补。
为了测试R45X突变是否真的是致病突变，我们用表达野生型的逆转录病毒载体转导患者成纤维细胞B17.2升cDNA并通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）寻找复合物I组装缺陷的补救方法，并通过凝胶内分析恢复复合物I催化活性。在两个独立的实验中，完全组装的复合物I的数量及其活性都恢复到用表达载体转导的细胞中的控制水平B17.2升（图A） ●●●●。复合物I–III超复合物的数量和活性也恢复到控制水平。
患者成纤维细胞复合物I组装缺陷的抢救。(A类)患者中复合物I组装缺陷的BN-PAGE分析（泳道A）显示，与对照（泳道C）相比，通过凝胶内活性测定（上图）测量的酶的活性和通过使用抗ND1抗体的BN凝胶的免疫印迹分析（中间图）测量的全酶的量严重降低。用表达野生型的逆转录病毒载体转导患者细胞B17.2升cDNA（通道A+B17.2L）完全修复了生化缺陷。超复合体（复合体I和III）标记为α。下部面板显示负载控制的免疫印迹（复合物II的70-kDa亚单位）。(B类)用抗B17.2L抗体对成纤维细胞进行的免疫印迹分析显示，与对照组（C区）相比，患者成纤维细胞（A区）中完全没有全长B17.2L，并且用表达野生型的逆转录病毒载体转导后，蛋白质积累接近控制水平B17.2升cDNA（车道A+B17.2L）。
我们在B17.2L中制备了一种抗C末端肽的抗体，并用免疫球分析检测了突变对该蛋白及其在B17.2 L转导的细胞中表达的影响。患者细胞中未检测到全长蛋白的免疫反应性，但逆转录病毒载体中野生型cDNA的表达使其恢复到对照组中观察到的水平的两倍左右（图B） ●●●●。
B17.2L是一种与复合物I亚组分相关的组装蛋白。
为了研究B17.2L的功能，我们使用BN-PAGE分析了两个患有复合物I组分缺陷的兄弟姐妹肌肉线粒体中复合物I亚组分的组成，我们之前在他们身上发现了NDUFV1型，它编码51-kDa复合物I结构亚单位（未发表的结果）。这些患者未能组装正常数量的全酶，并积累复合物I亚组分（图A） ●●●●。第一维BN凝胶在两名患者的约830 kDa的亚复合物中显示出抗B17.2L免疫反应性（图B） ●●●●。对照组或如预期的那样B17.2升B17.2L蛋白无效的患者（图B） ●●●●。这一结果表明，B17.2L与复合物I的特定亚组分有关，但与成熟的全酶无关。为了确保这代表B17.2L的真正免疫反应，我们在二维变性凝胶上分析了上述1名患者和其他2名复杂I装配缺陷患者的样本（图C） ●●●●。另外一名患者（Bo）在NDUFS4型（18-kDa亚单位，我们未发表的结果）并积累830-kDa子复合物（以及包含该亚复合物和复合物III的超复合物），但不组装任何成熟的全酶（图D） ●●●●。另一名患者（F）的分子缺陷尚不清楚。2名已知结构亚单位缺陷患者的830kDa亚复合体中明显存在B17.2L的免疫反应性（图C） ●●●●。在对照组和患者F中，其表现为近似单体分子量的短涂片。
用BN-PAGE免疫印迹分析B17.2L的表达。(A类和B类)对照组（C区）和患者（Be区、Br区和A区）肌肉的线粒体进行了一维BN-PAGE分析。凝胶被免疫印迹并与针对ND1的抗体反应(A类)或B17.2L(B类). 中的下部面板A类是负载控制的免疫印迹（复合物II的70-kDa亚单位）。(C类)患者成纤维细胞复合体I组装的BN-PAGE分析。从对照组和患者成纤维细胞中分离出线粒体，并进行二维BN-PAGE分析。使用针对所示蛋白质的抗体混合物来探测第二维免疫印迹。凝胶上标记为1-3的线分别表示复合物I-III超复合物、完全组装复合物I和830-kDa复合物III亚复合物的位置。位于49-kDa亚单位上方并与线3相交的点是一种由抗-49-kDa抗体识别的非特异性蛋白质。BI7.2L在对照组和患者F（涂片在凝胶的最右侧）中的分子量约为单体分子量，在已知结构亚单位基因突变（Be和Bo）的患者中，分子量为830-kDa的亚复合物I。(D类)第一维BN-PAGE凝胶显示患者Bo的肌肉线粒体中完全没有组装的复合物I。
为了测试这些结果的普遍性，我们检测了另外两名聚集830-kDa亚复合物的患者的成纤维细胞系，以及另外两名未在可检测水平上聚集该亚复合物且有装配缺陷的患者的细胞系（图A） ●●●●。该分析清楚地显示B17.2L免疫反应与830-kDa复合物（患者Be、Br、Bo、Ly和O）相关，但在低分子量（380和480 kDa）亚组分中不存在（在患者F和M中可见）（图B） ●●●●。在大于1 MDa的更高分子量复合物中也观察到B17.2L免疫反应（图中标记的βA） ●●●●。这可能代表一个超级复杂(23)其中830-kDa子组件与复合体III相关。
患者成纤维细胞复合物I组装的BN-PAGE分析。从对照组和患者成纤维细胞中分离出线粒体，并进行一维BN-PAGE分析。对凝胶进行免疫印迹，并与ND1抗体反应(A类)和B17.2L(B类). 络合物I–III超复合体表示为α，830-kDa络合物I亚复合体和络合物III之间的超复合体显示为β。
具有抗B17.2L的复合物I亚组分的免疫沉淀。
为了研究复合物I的哪些成分与正常细胞中的B17.2L相关，我们测试了是否可以使用抗B17.2L抗体从正常人心脏线粒体中结合免疫沉淀复合物I亚单位（图A） ●●●●。我们使用特定抗体检测了9种不同的复合物I亚单位的存在，并检测了复合物II和IV亚单位的亚单位，以控制非特异性相互作用。定量分析（图B） 结果表明，免疫沉淀相对富集ND1和49-、75-、18-、51-和30-kDa亚单位，而GRIM19的恢复水平仅略高于COX-1，免疫沉淀中未检测到2个复合I亚单位B14和39-kDa子单位。
从正常人心脏线粒体中免疫沉淀B17.2L和复合物I亚基的一个子集。从正常人心脏中分离线粒体，并用固定化的抗B17.2L抗体免疫沉淀。(A类)检测免疫沉淀物中是否存在B17.2L以及凝胶右侧显示的特定复合物I亚单位。复合物IV的亚单位COX-1和复合物II的亚单位SD70用于控制非特异性相互作用。Lane I显示了应用于固定化抗体的线粒体蛋白样本。Lane E代表洗脱与固定化抗体特异结合的蛋白质后获得的样品的一半。W巷显示了与洗脱液体积相同的最终清洗样品。(B类)通过免疫印迹的密度分析获得的抗B17.2L抗体免疫沉淀蛋白的定量分析。
讨论
一些证据表明B17.2L是一种分子伴侣，对复合物I的有效组装至关重要B17.2升导致全长B17.2L蛋白缺失。当野生型B17.2升cDNA在患者成纤维细胞中表达，B17.2L蛋白积累，生化缺陷完全修复。其次，B17.2L在一些装配缺陷患者中与复合物I的830-kDa亚组分特异性相关，但在成熟的全酶中不存在。第三，一种抗B17.2L抗体特异性地与正常人心脏分离的线粒体共免疫沉淀一组复合物I结构亚单位。最后，B17.2升存在于所有含有复合物I但不含复合物I的测序真核生物中。
虽然B17.2L蛋白与B17.2结构亚单位没有高度的序列一致性，但编码这两个亚单位的基因显然是同源的。复合物I的这项研究和最近的系统发育分析(4)表示B17.2升起源于真核生物谱系中结构亚单位编码基因的古老复制。有趣的是，最近在筛选c-myc转录靶点时，B17.2L也被鉴定为功能未知的线粒体蛋白(24). 蛋白质的敲除，作者称之为含羞草素（对于myc诱导的线粒体蛋白），RNAi显示抑制一些肿瘤细胞系的生长。根据我们在这里提供的数据，这种效应似乎可能是由复合物I的含量和活性的降低介导的。
我们不知道B17.2L是什么时候被招募来帮助组装新生的复合物I的；然而，观察到B17.2L与一个830kDa的大亚组分特别相关，这表明在组装的后期需要它，因为全酶的估计分子量为980kDa(25). 事实上，我们未能检测到B17.2L与各种装配缺陷患者细胞中较小亚复合物相关，并且观察到它与基质和膜臂的成分共免疫沉淀，这也支持了它在后期装配中起作用的观点。此外，B17.2L蛋白缺失的患者积累了380和480kDa的亚组分（参考文献中的亚组分V和VI）。21)但未检测到830-kDa亚复合物。基因突变患者的证据NDUFV1型（51 kDa）和NDUFS4型（18kDa）表明830-kDa亚复合物在这两种情况下都最小程度地缺失了这2个亚单位（我们未发表的结果）。以前有报道称，患有糖尿病的患者体内存在约800-kDa亚复合物NDUFS4型也不能组装全酶复合物的突变(26–28)，它几乎肯定代表了我们在这里确定的相同的子复杂体。最近的一篇论文报道了一名患者在NDUFS6系列（13-kDa亚单位）描述了患者成纤维细胞中750-kDa-亚复合物的积累，但亚复合物大小的估计基于900kDa的全酶分子量。这表明它可能与830-kDa子复合体相同，13-kDa亚单位也在该子复合体中缺失。
上述观察结果表明，人类复合体I的组装不太可能像基质臂与膜臂的逐步添加那样简单，因为830-kDa亚复合体太大，无法代表任何一个独立臂。此外，我们通过免疫印迹分析清楚地检测到830-kDa亚复合物和用抗B17.2L抗体免疫沉淀的亚复合物中酶的双臂的亚基。有趣的是，没有与B17.2L联合免疫接种的复合物I亚单位中的2个（B14和39-kDa亚单位）被放置在复合物I的一个模型中(4)靠近基质和膜臂的接合处。因此，我们可以推测B17.2L在某种程度上参与稳定一个包含酶的双臂元素的大型复杂I亚组分，其中该连接尚未完全成熟。尽管我们之前的研究(21)确定B14和B39亚基都存在于830kDa的复合物中，它们可能在野生型细胞的这一阶段被添加，并且我们在患者细胞中鉴定的亚复合物代表了一种在添加后仍然停滞的中间体，因为关键的结构亚基在患者中缺失。
完全缺乏全长B17.2L并不完全阻止成熟复合物I的组装，因为凝胶和分光光度酶分析中的BN-PAGE显示患者细胞和组织中存在残余酶活性。这让人想起功能丧失患者的情况SURF1号机组突变(29)其中绝大多数人没有免疫检测的Surf1蛋白，但仍能产生15-20%的holocomplex IV(30,31). 因此，这些分子伴侣可以作为促进剂，将酶的某些组分聚集在一起，可能是通过如上所述稳定复合物的亚组分，从而提高过程的效率。就B17.2L而言，生化缺陷的严重程度似乎具有某些组织特异性。患者骨骼肌的缺陷相当轻微（约为对照活性的40%），而成纤维细胞的缺陷更为显著（低于对照活性的20%）。矛盾的是，与我们检测的其他组织（包括成纤维细胞）相比，肌肉中B17.2L的表达最低（图B） ●●●●。同样，由于装配基因突变对心脏、肝脏、大脑或骨骼肌的影响不同，复合物IV也有一些类似的缺陷，这取决于基因缺陷的性质(32–34). 在普遍表达的家政基因中，这些组织特异性效应的基础尚不清楚，但似乎可能涉及组装的差异调节，以满足组织特异性代谢需求。
与儿科综合征I病例相关的最常见临床表型是Leigh综合征或亚急性坏死性脑病(35). 这种神经退行性疾病与双侧对称性海绵状病变有关，尤其是丘脑和脑干(36). 患者的临床表现B17.2升患者与Leigh综合征患者并不相似，也不是大多数其他线粒体疾病患者的典型特征（尽管必须指出，线粒体疾病的临床谱非常广泛）。事实上，患者与白质消失的白质脑病患者的大多数特征性诊断标准相同(37)是由5种不同的细胞溶质翻译因子中的任何一种突变引起的(38). 事实上，我们还没有发现其他患者患有B17.2升突变可能反映出这种临床表型通常与线粒体疾病无关。
复杂I装配缺陷患者被分为几个不同的基因互补组（参考文献。15以及我们尚未公布的结果），因此我们不太可能在这些病例中发现常见的基因缺陷。我们用来寻找B17.2升该基因可能有助于发现其他复杂的I组装基因，但它确实有其局限性。最明显的两个原因是电子版线粒体靶向预测算法的不准确（大约80%的准确率），以及作为大基因家族成员的蛋白质在许多酵母物种中无法存活的事实。有趣的是B17.2升是第一个具有特征的哺乳动物复合体I组装因子基因，是复合体本身结构亚单位的副产物。为配合物III、IV或V确定的组装因子与这些配合物的结构亚单位没有任何明显的关系。复合体I演化的最新分析(4)确定了几个复杂I结构基因的同源序列，现在必须考虑这些同源序列作为复杂I组装因子的候选序列。
方法
病例报告。
该患者是一名足月女性，为臀位剖宫产，母亲为中葡血统，父亲为高加索犹太人。在12至14个月大之前，当发现水平眼球震颤和宽基步态时，她看起来很健康；脑部MRI正常。3岁时，她因耳朵感染而出现急性共济失调、嗜睡、脱水和眼球震颤加重。她有右侧共轭凝视障碍，右侧视盘苍白，肌病相，反射减弱，感觉检查正常。血乳酸正常，但脑脊液乳酸略有增加（4.2 mM；对照组1.4-3.9 mM）。肌电图（EMG）和神经传导速度（NCV）测试提示脱髓鞘，可能是多发性神经根神经病。脑部MRI（图（A和B）显示乳头丘脑束、黑质/内侧丘系、内侧纵束和棘丘脑束对称性病变。小脑延髓体也可见高信号的汇合区。对推测的急性播散性脑脊髓炎进行类固醇治疗3天后，发现肥厚性心肌病，并停止类固醇疗法。然后给她静脉注射免疫球蛋白和普萘洛尔。她的临床症状有所改善，心肌病也得到了解决。外周血淋巴细胞活性测定排除丙酮酸脱氢酶缺乏症。
患者A的脑部MRI。3岁、4个月大时拍摄的横向T2加权图像(A类和B类). 10岁、3个月大时拍摄的横向液体衰减反转恢复（FLAIR）图像(C类和D类).
俄勒冈州健康与科学大学在44个月大时对骨骼肌和腓肠神经进行了活检。肌肉和神经组织化学及肌肉EM正常。特别是，没有粗糙的红色纤维或细胞色素c（c）氧化酶阴性纤维。肌肉线粒体呼吸链活性的测量显示复合物I中度缺乏（患者105 nmol/min/mg蛋白质；对照组276±84 nmol/min蛋白质）。复合物II、III、IV和II+III、ATP酶和柠檬酸合成酶的活性均正常。通过BN-PAGE和凝胶内活性测量评估，在永生化患者成纤维细胞中，复合物I的量和活性低于对照水平的20%（见图). 她接受了维生素C、辅酶Q10和L（左）-肉碱。临床上，她智力正常，力量正常，张力减退，深部肌腱反射消失，轻度共济失调和视神经萎缩。6岁时，她又经历了一次乳酸酸中毒加重和共济失调加重的发作。她的智力保持正常。
8岁时，虚弱、吞咽困难、排尿困难、睡眠呼吸暂停、高血压和心动过速加剧，并伴有呼吸衰竭和并发呼吸道感染。在这些事件之后，她需要进行气管造口术进行机械通气，并进行胃造口术进行喂养。她昏迷了几个月。她接受了维生素鸡尾酒、辅酶Q10、肉碱、鱼油、尿苷和肌酸的治疗。呼吸衰竭后，给予醋酸二氯酯3个月。从8年6个月到13年7个月去世，她基本上没有活动能力，语言不通，并且患有反复发作的肺炎和电解质失衡。她还患有肌肉萎缩、深层肌腱反射缺失、严重视神经萎缩、严重骨质疏松、脊柱侧凸、中枢性性早熟、体温不稳定和小细胞贫血。T4和TSH（促甲状腺激素）升高；血乳酸、肝功能和超声心动图均正常。肌电图和NCV测试显示严重的轴突感觉运动性多神经病。脑部MRI（图（C和D）表现为广泛的骨髓软化、白质脑软化、皮质萎缩和蚓部萎缩。她仍然依赖呼吸机和胃造口术，但对音乐治疗反应灵敏，能够发出声音来表示不适或不愉快。
大脑半球的神经病理学检查显示，整个白质和深灰质都有明显的海绵状改变，皮质相对较少。白质中有一些U纤维保存。胼胝体被减为很薄的板层，纹状体和苍白球明显萎缩。丘脑和下丘脑萎缩严重，但海马结构相对较少。在中脑，Sylvius的导水管扩大，并有多腔病变累及中脑导水管周围区域，延伸至脑桥被盖。脑桥和髓质明显萎缩。整个小脑蚓部的叶明显萎缩，小脑白质严重受累于海绵状改变。大脑皮层、海马体和小脑的显微镜检查显示，白质广泛而奇异的变性，被胶质瘢痕所取代。未发现少突胶质细胞。
获得患者父母的知情同意，方案得到俄勒冈州健康与科学机构审查委员会和蒙特利尔神经医院研究所研究伦理委员会的批准。
基因组减法。
包含两种基因家族序列的文件D.汉塞尼和溶脂酵母，但不在光滑梭菌或乳杆菌，从Genolevures财团网站下载(http://cbi.labri.fr/Genelevures网站) (39). 基于网络的程序MITOPRED(http://bioinformatics.albany.edu/～米托普雷德/）(40)然后用于预测哪些基因序列是线粒体。最终PSI爆破(http://helix.nih.gov/docs/gcg/psiblast.html)与Blosum 45矩阵一起用于寻找人类同源物(41)，并使用MITOPRED和MitoProt II对这些同源物进行了第二次线粒体预测(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html) (42).
细胞系。
从患者皮肤活检材料中培养出原代皮肤成纤维细胞。为了使细胞永生化，用表达人端粒酶催化成分和16型人乳头状瘤病毒E7基因的逆转录病毒载体进行转导(29). 成纤维细胞在含有110 mg/l丙酮酸和10%胎牛血清的高糖DMEM中生长。
cDNA和基因组DNA的测序。
使用RNeasy迷你试剂盒（QIAGEN）从患者和对照成纤维细胞中分离RNA。cDNA是通过使用OneStep RT-PCR试剂盒（QIAGEN）和专门设计的扩增B17.2升.第2外显子B17.2升使用特异性引物从基因组DNA中扩增。PCR产物使用相同的引物自动测序。
B17.2L cDNA构建物。
逆转录病毒载体是使用网关克隆系统（Invitrogen Corp.）创建的。cDNA来自B17.2升经一步法RT-PCR（QIAGEN）扩增。使用修改后的特异性引物克隆到Gateway载体中，以便PCR产物可以克隆到逆转录病毒表达载体pLXSH中(43)，修改后用于网关系统。自动DNA测序证实了cDNA克隆的保真度。
患者成纤维细胞系的病毒产生和转导。
使用HBS/CaPO将含有逆转录病毒载体的cDNA瞬时转染到Phoenix两性细胞系（美国加利福尼亚州斯坦福大学G.P.Nolan赠送的礼物）4方法(http://www.stanford.edu/group/nolan/retroviral网站_systems/retsys.html）。如前所述，患者和对照组成纤维细胞在48小时后暴露于含病毒的含有聚brene（4μg/ml）的培养基中受到感染(44). 在100 U/ml潮霉素中选择表达cDNA的细胞，然后收获进行BN-PAGE或SDS-PAGE分析。
人类心脏、肌肉、肝脏和成纤维细胞线粒体的制备。
线粒体由1 g冷冻对照人心脏组织、100 mg冷冻对照人肝脏或患者和对照组的5×15 cm成纤维细胞培养板制成。将组织或细胞在250 mM蔗糖、10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA（pH 7.4）中均质（5%），并将完整蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics Corp.）以建议的浓度添加到均质缓冲液中。为了从肌肉中制备线粒体，在150 mM KCl、20 mM Tris-HCl和2 mM EDTA（pH 7.5）中均质100 mg患者或对照的冷冻肌肉组织。将所有上述匀浆在600下离心两次10分钟克获得核后上清液。线粒体在14000℃离心20分钟制成丸克蛋白质浓度通过Micro-BCA方法（Pierce Biotechnology Inc.）测量。
BN-PAGE和免疫印迹分析。
如前所述，线粒体由成纤维细胞制备(45)用0.8mg洋地黄素/mg蛋白质处理细胞。用1%的月桂基麦芽糖苷溶解线粒体或线粒体，并使用20–30μg（成纤维细胞）或10–15μg（组织）溶解蛋白进行电泳。空白页(46)用于在6–15%聚丙烯酰胺梯度上分离一维样品。如前所述，对复合物I进行凝胶内活性测定(47). 为了进行第二维度分析，将第一维度凝胶条在1%十二烷基硫酸钠和1%β-巯基乙醇中培养45分钟。然后在10%三嗪/SDS-PAGE上运行这些条带，以分离第二维度的蛋白质(46). 使用单克隆和多克隆抗体对上述凝胶进行Western blot分析，检测复合物I、II和IV的亚单位。以下抗体购自Invitrogen Corp.：复合物I、抗B14（NDUFA6）亚单位、复合物II、抗SD70（70kDa）亚单位和复合物IV、抗COX-1。Anti-GRIM19从MitoSciences购买。其他针对复合物I亚单位的抗体如下：J.Walker（英国剑桥MRC Dunn人类营养单位）、抗-75-kDa（NDUFS1）和抗-51-kDa的亚单位；B.Robinson（加拿大安大略省多伦多市儿童医院），抗-49-kDa（NDUFS2）亚单位；R.Capaldi（美国俄勒冈州尤金俄勒冈大学），抗-39 kDa（NDUFA9）亚单位；A.Lombes（法国巴黎皮埃尔和玛丽·居里大学INSERM U582），反ND1；和V.Petruzzella（意大利巴里巴里大学），抗18-kDa（NDUFS4）亚单位。
SDS-PAGE分析。
用1 mg TritonX-100/mg蛋白质在4°C下溶解30分钟，从成纤维细胞制备全细胞提取物。不溶性细胞碎片通过750℃离心去除克在4°C下保持5分钟。将可溶性蛋白质（10–20μg）加载到Laemmli样品缓冲液中的10%甘氨酸/SDS-PAGE凝胶上。从细胞和组织中分离的线粒体在加载前溶解在Laemmli样品缓冲液中。随后用上述一些抗体进行免疫印迹。
抗B17.2L抗体。
通过向兔子注射人B17.2L特异性合成肽（CSAPYFGKEEPS），通过反应性巯基与锁孔帽贝血蓝蛋白偶联，并在Titermax中乳化，从而产生抗B17.2L的抗体（Pierce Biotechnology Inc.）。B17.2L抗血清的特异性测试表明，免疫印迹不需要亲和纯化，而是使用粗血清。
人心脏和人成纤维细胞B17.2L蛋白的免疫沉淀。
使用SulfoLink试剂盒（Pierce Biotechnology Inc.）亲和纯化抗B17.2L抗体。然后将纯化的抗体（70μg）与20 mg蛋白质A sepharose 4B fastflow（Sigma-Aldrich）在4℃下结合过夜。将抗体与蛋白A交联，在pH 9.0的0.2 M硼酸钠中加入25 mM二甲基蒎酰亚胺（DMP）（室温下30分钟）。用0.2 M乙醇胺终止交联，pH值8.0（室温下3小时）。在20 mM Tris HCl、pH 7.5和1 mM EDTA中平衡珠子。人类心脏线粒体（1 mg）在20 mM Tris-HCl、pH 7.5和1 mM EDTA中用完整蛋白酶抑制剂重新悬浮（10 mg/ml蛋白质）（罗氏诊断公司）。添加等体积的2%十二烷基麦芽糖苷（DDM）于20 mM Tris HCl、pH 7.5和1 mM EDTA中，线粒体在4°C下溶解30分钟。不溶性材料通过185000离心成丸克.在室温下，将上清液与裸蛋白A琼脂糖珠预分离1小时，然后与B17.2L蛋白A琼脂在4°C下培养过夜。用pH 8.0、0.05%DDM的PBS洗涤后，用0.1 M甘氨酸、pH 2.5和0.05%DDM.从珠子中洗脱结合蛋白。使用Microcon YM-10（Millipore）进行洗脱液浓度和缓冲液交换（PBS，pH 8.0，0.05%DDM）。
致谢
我们非常感谢这个家庭参与这项研究。我们感谢为这位患者的护理做出贡献的许多医生，特别是苏珊·温特、尼尔·R.M.·布伊斯特、加马尔·布特罗斯、多里特·巴丁、罗文娜·科洛布金、萨库拜·奈杜、安德烈亚·格罗普曼和雷蒙德·科尔曼；我们还感谢Douglas Kerr测量丙酮酸脱氢酶活性，Beth Lee测量呼吸链活性，Gregory Ward帮助使用基因组减法软件，以及Mary G.Ripple解释神经病理学。我们还感谢阿里尔·阿布拉莫夫对本研究的宝贵贡献。这项研究得到了二角硬币出生缺陷协会向E.a.Shoubridge提供的资助。E.A.Shoubridge是加拿大卫生研究院的资深科学家，霍华德·休斯医学研究所的国际学者。
脚注
参见第页开始的相关评论2689.
使用的非标准缩写：BN-PAGE，蓝色原生PAGE；复合物I，NADH：泛醌氧化还原酶；DDM，十二烷基麦芽糖苷；肌电图；神经传导速度。
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
工具书类
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