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美国国家科学院院刊。2005年9月27日；102(39): 13944–13949.
2005年9月15日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0506654102
预防性维修识别码：项目经理1236577
PMID：16166262

miR-15型和miR-16型靶向BCL2诱导细胞凋亡

阿米莉亚·西米诺,*† 乔治·阿德里安·卡林,*† 穆勒·法布里,* 玛丽莲娜·伊奥里奥,* 曼纽拉·费拉辛,‡ 清水Masayoshi Shimizu,* 西尔维娅·沃伊西克,* 拉米·阿奎兰,* 西蒙娜·祖波,§ 玛丽埃拉·多诺,§ 劳拉·拉塞蒂, Hansjuerg Alder公司,* 斯特凡诺·沃利尼亚,* 刘长工,* 托马斯·基普斯, 马西莫·内格里尼,*‡和卡洛·克罗斯*∥
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补充资料

摘要

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是最常见的人类白血病，其特征是非分裂恶性B细胞过度表达抗凋亡B细胞淋巴瘤2（Bcl2）蛋白。miR-15a型和miR-16-1型在大多数CLL中被删除或下调。在这里，我们证明miR-15a型和miR-16-1型在CLL中的表达与Bcl2的表达呈负相关，并且这两种微RNA在转录后水平上对Bcl2进行负调控。在白血病细胞系模型中，这些小RNA对BCL2的阻遏可诱导凋亡。因此，miR-15型和miR-16型是天然的反义Bcl2相互作用物，可用于治疗Bcl2过度表达的肿瘤。

关键词：微RNA，翻译，白血病

B细胞淋巴瘤2（BCL2）是真核细胞遗传程序中的一个核心角色，通过抑制细胞死亡来促进生存(1). 据报道，Bcl2蛋白在多种人类癌症中过度表达，包括白血病、淋巴瘤和癌症(2). 在滤泡淋巴瘤和部分弥漫性BCL中，发现BCL2激活的机制是易位t（14，18）（q32；q21），它将BCL2基因置于Ig重链增强子的控制之下，导致该基因的表达失控(三,4). B细胞慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的成人白血病(5)CLL的恶性B细胞（大多为非分裂性）过度表达Bcl2(6). 然而，除了<5%的BCL2基因与Ig位点并列的情况外(7)目前还没有发现任何机制可以解释CLL中BCL2的放松管制。

我们和其他人以前曾报道过microRNAs（miRNAs）是一类参与人类肿瘤发生的基因（参考文献。8–15并在参考文献中进行了审查。16和17). 在动物中，单链miRNA通过与靶mRNA（主要是3′UTR）不完全互补的序列结合特定mRNA。结合的mRNA保持未翻译状态，导致相应蛋白质水平降低或可降解，导致相应mRNA水平降低(18,19). 涉及两个miRNAs的缺失和易位，miR-15a型和miR-16-1型位于13q14.3的簇中，在≈65%的B细胞CLL患者中发现其下调(8). 中的生殖系突变miR-16-1型/miR-15a型初级前体位于3′末端后7bpmiR-16-1型导致miRNA表达水平低在体外和体内并且与正常等位基因的缺失有关(20). 致病性突变的存在miR-15a型/miR-16-1型表明这些基因参与CLL，并且至少一些miRNAs可以作为肿瘤抑制基因发挥作用。要破译miR-15a型和miR-16-1参与CLL，我们致力于识别对人类肿瘤发生具有重要意义的主要靶点。

在这里，我们报告了一种调控造血癌细胞BCL2表达的机制的鉴定，该机制包括通过转录后下调miR-15型和miR-16型这种相互作用具有重要的功能后果：激活固有的凋亡途径。

方法

患者样本。在表达研究中，我们使用了26份CLL样本，这些样本是在CLL研究联盟机构诊断为CLL的患者知情同意后获得的。简单地说，从CLL患者中获取血液，通过Ficoll/Hypaque梯度离心分离单核细胞（Amersham Pharmacia Biotech），并根据所述方案进行RNA提取。两个正常池，每个包含CD5+来自两个不同正常个体的细胞作为正常对照。CD5（CD5）+B细胞由扁桃体淋巴细胞制备而成。简单地说，扁桃体是在知情同意后，从接受常规扁桃体切除术的儿童年龄组患者中获得的。用神经氨酸酶处理过的绵羊红细胞将单个核细胞的T细胞玫瑰花结制成纯化的B细胞。获取CD5+B细胞、纯化的B细胞与抗CD5单克隆抗体孵育，然后与磁性微球结合的山羊抗鼠Ig孵育。CD5（CD5）+通过Mini-MACS系统（加利福尼亚州奥本市Miltenyi Biotec）收集保留在磁性柱MS上的细胞，阳性选择B细胞。通过流式细胞术评估，细胞制剂的纯化程度>95%。

BCL2的Westen Blottings。Bcl2蛋白水平通过使用小鼠单克隆抗Bcl2抗体（DakoCytomation，Carpindia，CA）进行量化，并通过使用从Santa Cruz Biotechnology购买的小鼠单克隆抗体（使用标准的Western blotting程序）进行确认。用小鼠单克隆抗肌动蛋白抗体（Sigma）进行归一化。带强度用图像定量（非线性动力学，北卡罗来纳州达勒姆）。

RNA提取、Northern Blots和miRNACHIP实验。按照说明执行程序(8,11,21). 简单地说，来自5μg总RNA的标记靶点用于在每个miRNACHIP微阵列芯片上进行杂交，该芯片包含368个探针，一式三份，对应于245个人类和小鼠miRNA基因。原始数据在基因弹簧软件，7.2版（Silicon Genetics，加利福尼亚州红木市）。通过同时使用基因弹簧标准化选项或全局中值标准化生物导体包装(www.bioconductor.org)没有任何实质性差异。对这两种方法进行了统计比较基因弹簧方差分析工具和山姆软件（微阵列的显著性分析，网址：wwwstat.stanford.edu/～tibs/SAM/index.html). 通过Northern blottings对微阵列数据进行了确认mir-16-1型和mir-15a如报告所示(11).

DNA构建。 mir-16-1型/mir-15a表达质粒由832-bp的基因组序列构建，包括mir-16-1型和mir-15a一个WT（mir-16-1-WT）和另一个包含+7（CtoT）替代物（mir-161-1-MUT），方法是将顺时针方向的相关序列连接到哺乳动物表达载体pSR-GFP-Neo（OligoEngine，西雅图）。根据制造商的方案（Invitrogen），使用Lipofectamine 2000在293T细胞中转染所有序列构建物。如前所述，通过Northern blots评估两种结构的表达。GFP水平的Western blotting用于显示与pRS-neo-GFP构建物转染的同等效率。

为了进行荧光素酶报告实验，通过PCR从人类基因组DNA中扩增出BCL2基因3′UTR的546 bp的3′UTR-片段，并将其插入pGL3控制载体（Promega）中，使用荧光素酶终止密码子下游的XbaI位点。使用以下引物集生成特定片段：BCL2-UTRF2，5′-CTAGTCTAG公司AGCCTCAGGAAACAGAATGCAG-3′和BCL2-UTRR2，5′-CTAGTCTAG公司AAAGCGTCACGTTCATTG3′。我们还使用QuikChange XL位点定向突变试剂盒（Stratagene）从完全互补位点分别生成了两个缺失9bp（3′M1）和5bp（3’M2）的插入物。测序证实WT和突变插入物。

转染试验。人巨核细胞系MEG-01在RPMI培养基1640中的10%FBS中生长，并在37°C、5%CO的腐殖化气氛中添加1×非必需氨基酸和1 mmol丙酮酸钠2根据制造商的协议，使用siPORT neoFX（Ambion，Austin，TX）在12孔板中与0.4μg萤火虫荧光素酶报告载体和0.08μg含有Renilla荧光素酶pRL-TK（Promega）的对照载体共转染细胞。对于每口井，使用了10 nM mir-16-1-sense和mir-15a-sense（Dharmacon Research，Lafayette，CO）以及抗mir-16-1和抗mir-15a前体miRNA抑制剂（Ambion）。转染24 h后，采用双荧光素酶测定法（Promega）连续测定萤火虫和Renilla荧光素酶活性。

细胞凋亡检测。用miR-15a/miR-16-1载体或特异性寡核苷酸RNA对转染的MEG-01细胞进行重复实验，进行细胞凋亡检测。我们使用了凋亡DNA梯形试剂盒（罗氏诊断公司）。根据标准方案进行免疫印迹分析(22)与兔多克隆抗caspase-8（Chemicon International，Temecula，CA）、兔多克隆抗caspase-9（Santa Cruz Biotecnology）、兔多克隆抗凋亡蛋白酶激活因子1（APAF-1）（Pharmingen）和小鼠多克隆抗多聚体（ADP-核糖）聚合酶（PARP）。对于TUNEL分析就地细胞死亡检测试剂盒，TMR红色，按照制造商的描述使用（罗氏诊断公司）。

结果

miR-15a和miR-16-1水平与CLL细胞BCL2蛋白表达呈负相关。通过分析这两个miRNA与BCL2 mRNA序列的同源性，我们发现两个miRNAs 5′端的前9个核苷酸与BCL2 cDNA的3287–3279碱基互补（克隆纳米_000633,图1A类). 这种互补性也被鉴定为来自染色体3q26的第二个簇miR-15b/miR-16-2的成员，并且在Bcl2:：miR-15和Bcl2:：miR-16中保持不变小家鼠假定的交互者。为了评估这种假定的相互作用，我们首先检查了miR-15a型和miR-16-1型CLL细胞和正常CD5中Bcl2蛋白水平+淋巴细胞。在正常CD5中+染色体13q14的B淋巴细胞簇高度表达，而miR-15b型和miR-16-2型Northern blots几乎检测不到前体(8). 通过miRNA-CHIP和Western blottings，我们分析了一组30个样本，包括26个CLL样本和正常CD5+来自四个不同正常人扁桃体的淋巴细胞。而在正常CD5中+在大多数白血病细胞中，这两种miRNAs的水平都很高，而Bcl2蛋白的表达水平都很低miR-15a型和miR-16-1型低水平表达，Bcl2过度表达(图1B类). 此外，在所有白血病样本中，我们发现miRNAs和Bcl2水平之间存在高度一致的负相关(图1C). 因此，在CLL病例中，我们观察到一种一致的下调miR-15a型和miR-16-1型Bcl2蛋白的过度表达。

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Bcl2蛋白表达与miR-15a型和miR-16-1型CLL患者中miRNAs的表达。(A类)互补性miR:：mRNA的独特位点在人类和小鼠中是保守的，并且对于该家族的所有四个人类成员都是相同的。指出了目标突变位点（3′M1和3′M2）。(B类)在CLL患者中，Bcl2蛋白水平与miR-15a型和miR-16-1型表达式。本文介绍了五种不同的慢性淋巴细胞白血病病例，正常细胞为CD5池+B淋巴细胞。使用T细胞白血病Jurkat作为Bcl2蛋白表达的对照。对于标准化，我们使用了β-肌动蛋白。这些数字表示miRNACHIP上的规范化表达。ND，未确定。(C)对于这两种情况，全套26个样本的相关系数≈95%miR-15a型和miR-16-1型。规范化的Bcl2表达式位于横坐标vs。miR-15a型(左侧)和miR-16-1型(赖特)miRNA芯片在纵坐标上的水平。ACT，β-肌动蛋白。

BCL2是miR-15和miR-16转录后抑制的靶点然后，我们研究了全簇转染的效果miR-15a型/miR-16-1型Bcl2表达。我们使用了一种Bcl2水平高且不表达这些miRNAs的细胞系。由于缺乏来自CLL患者的细胞系，我们选择了MEG-01，这是一种白血病衍生细胞系，其中一个等位基因缺失，另一个基因改变miR-15a型/16-1基因座和无表达miR-15a型和miR-16-1型基因。我们通过插入包含两个miRNAs（pSR-miR-15/16-WT）的832-bp基因组序列构建了pSR-GFP-Neo表达载体。将载体瞬时转染到MEG-01细胞中。与WT MEG-01细胞或转染空载体的细胞（显示出类似的Bcl2水平）相比，Bcl2的水平显著降低（约为7%的标准化表达）(图2A类). 为了进一步证实这种作用，我们转染了在家族性CLL病例中检测到的含有+7（CtoT）种系替代物（pSR-miR-15/16-MUT）的相同表达载体(20)这强烈降低了两种miRNAs的表达。正如预期的那样，Bcl2水平与WT细胞或空白载体转染细胞中的水平相当（75%的正常表达）(图2A类).

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BCL2是miR-15型和miR-16型.(A类)转基因miR-15a型/miR-16-1型MEG-01 BCL2中的集群+白血病细胞之后蛋白质水平显著降低。数据在重复实验中得到证实。pSR-mir15/16-WT转染细胞显示APAF-1（一种细胞色素c（c）相互作用物）、蛋白酶原9（内在途径）和PARP（各种凋亡途径的最终效应器）。(B类)分别或联合转染RNA寡核苷酸miR-15和miR-16可显著降低Bcl2蛋白水平。用β-肌动蛋白进行正常化。Northern blot（NB）显示miR-16义转染效率。其他三种寡聚物的结果相同（数据未显示）。显示了相同细胞中BCL2基因的mRNA水平，并根据β-肌动蛋白mRNA表达进行了标准化。WB、Western blot。(C)BCL2的3′UTR可实现miR-15/16调控。萤火虫荧光素酶表达的相对抑制被标准化为转染对照，即Renilla荧光素素酶。pGL-3（Promega）用作空载体。(左侧)miR-15-a型和miR-16-1型寡核苷酸（正、反义）用于转染。(赖特)使用pSR-mir15/16-WT。构建了两种不同类型的3′UTR突变体，一种没有9 bp的miRNA:：mRNA相互作用（3′M1），另一种在相同的互补区域（3′M2）中缺失了前5 bp。所有实验均进行了两次，共三次(n个= 6).

然后我们研究了这两种miRNAs是影响Bcl2蛋白表达还是仅限于其中一种。我们暂时转染了miR-15a型和miR-16-1型将正、反义寡核苷酸导入同一MEG-01细胞系。如所示图2B类分别转染miR-15a-sense和miR-16-1-sense后，BCL2表达完全消失，而反义RNA转染则没有。通过与两个正RNA或两个反义RNA的共转染获得了类似的数据，证实了这两种RNAmiR-15a型和miR-16-1型影响Bcl2蛋白表达。

影响BCL2基因的易位增加信使和蛋白质水平(4). 因为最近研究表明，miRNAs可以通过影响mRNA翻译或mRNA稳定性来下调特定靶点(19)，我们测试了miR15a/16-1相互作用下调BCL2的水平。我们通过扩增pSR-miR-15/16-WT转染细胞或特异性转染细胞的BCL2 cDNA来评估mRNA水平miR-15a型和miR-16-1型RNA寡核苷酸RT-PCR。在这些样品中的任何一个和对照细胞（未转染或用空载体转染）之间都没有观察到BCL2表达水平的差异(图2B类). 这一结果表明miR-15a型和miR-16-1型不影响mRNA的稳定性并在转录后水平调节Bcl2的表达。

Bcl2蛋白水平的下调可以通过直接效应（miRNA:：mRNA互补）或间接相互作用来解释。可以说miR-15a型和miR-16-1型与其他未知靶点相互作用，进而下调Bcl2水平。为了解决这个问题，我们将与两个miRNAs相互作用的人类BCL2的536 bp 3′UTR序列融合到荧光素酶报告基因。相互作用miRNA:：mRNA的存在会降低萤火虫荧光素酶的活性（归一化为转染控制质粒的Renilla荧光素酶活性）。中显示的数据图2C与对照载体相比，这两种miRNAs对荧光素酶活性具有显著的抑制作用。我们还对两种突变的靶mRNA序列进行了对照实验，这些序列缺乏BCL2 cDNA的全部九个（3′M1）或五个（3’M2）互补碱基。正如所料，这两个突变体完全消除了miR-15a型和miR-16-1型和BCL2的3′UTR(图2C). 这些数据表明，这两种miRNAs都直接与BCL2的3′UTR相互作用。

miR-15a和miR-16-1抑制BCL2诱导MEG-01细胞凋亡。Bcl2是一种抗凋亡基因，参与对细胞凋亡和程序性细胞死亡至关重要的进化保守途径：Bcl2阻断细胞色素的线粒体释放c（c）并通过胞质支架蛋白Apaf-1抑制caspase 9的激活(23). 我们使用三种不同的分析来确定Bcl2阻遏的生物效应miR-15型和miR-16型首先，我们在转染的MEG-01细胞上显示了凋亡DNA片段。只有转染pSR-miR-15/16-WT的细胞和对照细胞（未转染WT细胞、pSR-Empty或pSR-miR-16-1-MUT转染细胞）均未显示典型的DNA梯形图(图2A类). 然后，为了了解激活的特定凋亡途径，我们使用免疫印迹分析。pSR-miR-15a/16-1-WT转染的MEG-01细胞显示，通过激活APAF-1–caspase9–PARP途径，可识别内在凋亡途径的激活。包括MUT转染细胞在内的对照组均未显示这些蛋白水平的变化(图2A类). 外源性途径（胱天蛋白酶8）未被激活（数据未显示）。同样的结果也在转染了寡核苷酸miR-15和miR-16的MEG-01细胞中重现（数据未显示）。最后，为了在单细胞水平上确认数据，我们使用了TUNEL分析(图3). 与pSR-neo-GFP细胞相比，MEG-01 pSR-15/16-WT转染细胞中发现了更多的凋亡细胞，具有统计学意义，但后者的凋亡水平与转染突变版本的细胞之间没有差异，后者诱导低水平表达miR-15a型/miR-16-1型成绩单。这些数据证实，BCL2通过miR-15基因和miR-16基因触发细胞凋亡，这两种miRNA的表达水平对这一机制很重要。

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通过比较TUNEL阳性凋亡细胞核和细胞总数来确定凋亡评估。将显示与数字计数对应的图像。对于每种类型的样品，三组不同的100个细胞的所有值均为平均值±SD。NS，不显著。上标1表示P（P）空向量和miR-15/16 WT之间的值。上标2表示P（P）空向量和miR-15/16之间的值发生突变。

讨论

在本研究中，我们确定了BCL2基因表达调控的机制，该机制可以充分解释BCL2蛋白表达与miRNAs之间的负相关miR-15a型和miR-16-1型在B细胞CLL细胞中。通过miRNAs过度表达Bcl2miR-15a型和miR-16-1型下调似乎是参与人类B细胞主要部分CLL发病机制的主要调节机制。因为下调miR-15a型和miR-16-1型在弥漫性大BCL病例中也有报道(15)我们可以推测，这种机制的意义可能扩展到其他人类恶性肿瘤。在人类基因组中，mir15/16家族有四个成员，它们都具有相同的9 bp Bcl2-互补序列。这种功能冗余表明存在一种非常精细的机制来调节Bcl2的表达。最近，一些目标预测软件程序，如目标扫描(24),皮卡星(25)、和米兰达(26)鉴定出22种不同的miRNAs，其假定靶点为BCL2mir15/镜子16在最高等级中（表1，发布为支持信息在PNAS网站上）。这些数据表明，其他miRNAs可能参与调节各种细胞类型中Bcl2蛋白的表达，并支持拟议的组合miRNA靶调控，即不同的miRNA组合在不同的细胞类型中表达，并可能协调调节细胞特异性靶基因(25). 更重要的是，这种相互作用在包括小鼠、大鼠、狗和鸡在内的几个物种中都是保守的，这证实了Bcl2调节机制在生殖进化中的重要性。

迄今为止，只有少数miRNA:：mRNA相互作用被证明对癌症发病机制具有重要意义(27). 它优雅地证明了第7列miRNA家族调节RAS癌基因let-7肺肿瘤的表达低于正常肺组织，而RAS蛋白的表达与正常肺组织相反(14). 此外，在小鼠BCL模型中，来自染色体13q32-33的miR-17-92簇与c-myc的强制表达加速了肿瘤的发展(28). 来自同一簇的两个miRNAs，miR-17-5p和miR-20a型，负调控E2F1转录因子(29)，一种基因在一些实验系统中被证明具有抑癌作用(30). 将这些数据与我们的发现结合起来，我们可以扩展早期提出的miRNA作为癌症参与者的模型(10). 事实上，如果特定细胞类型的主要靶点是致癌基因，那么位于特定人类癌症中缺失区域或下调的miRNA（“抑癌”miRNA）可能具有致癌效应。事实上，如果特定细胞类型的主要靶点是肿瘤抑制因子，那么位于扩增区域或在特定人类癌症中过度表达的miRNA（“癌基因”miRNA）可能具有类似肿瘤抑制因子的作用(图4).

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miRNAs作为致癌基因和/或抑癌基因：相同基因的两种不同外观。事实上，如果特定细胞类型的主要靶点是癌基因，那么位于特定人类癌症中缺失区域或下调的miRNA（肿瘤抑制miRNA）可能具有致癌效应。miRNA的缺失将导致致癌靶点的过度表达，与靶点扩增或激活的效果相同（已证明let-7肺癌患者的RAS）。相同的miRNA，但在不同的细胞类型中，可以以肿瘤抑制因子为主要靶点，因此其缺失将增加抑制蛋白的水平，实际上可以防止恶性转化。事实上，如果特定细胞类型的主要靶点是肿瘤抑制物，那么位于扩增区域或在特定人类癌症中过度表达的miRNA（癌基因miRNA）可能具有类似肿瘤抑制的作用。miRNA的丰度将导致抑制靶基因的下调，这与杂合性丢失直接影响靶基因的效果相同。相同的miRNA，但在不同的细胞类型中，可以将癌基因作为主要靶点，因此其过度表达将降低致癌蛋白的水平，实际上保护细胞免受恶性转化。为了完全定义这个谜团，必须考虑到，根据细胞类型，相同的miRNAs（如已证明的miR-17-5型和miR-20a型)可以表现为致癌基因（如参考文献所示。28)或肿瘤抑制物（如参考文献所示。29). 此外，每个miRNA有多个靶点，每个靶点在特定细胞类型中有多个相互作用的miRNA，形成一个非常复杂的调控网络。miRNA基因以蓝色显示，相应的启动子以橙色显示。为了简单起见，只显示了一个等位基因，并且只显示了一些mRNA–miRNA相互作用。

本研究中提供的数据具有相当大的治疗意义，因为miR-15型和miR-16型是天然的反义Bcl2相互作用物，可用于治疗Bcl2过度表达的肿瘤。在转染pSR-miR-15/16-WT的MEG-01细胞中，我们观察到细胞凋亡以及蛋白酶原9和PARP的裂解，这意味着miRNAs降低Bcl2蛋白水平足以启动凋亡过程。鉴于反义Bcl2作为癌症治疗的化学增敏剂的治疗潜力，这些结果令人鼓舞(31).

总之，我们的结果表明mir15/16家族负调控BCL2表达并促进凋亡。miR-15a基因和miR-16-1通过上调Bcl2导致恶性转化，这与滤泡淋巴瘤中发生的情况类似，但机制不同。

补充材料

支持表格：

致谢

这项工作得到了国家癌症研究所的项目拨款P01CA76259、P01CA81534和P30CA56036（发给C.M.C.和T.J.K.）、Kimmel学者奖（发给G.a.C.）、意大利公共卫生部的拨款（发给M.N.和S.V.）、意大利大学研究部的拨款，意大利癌症研究协会（发给M.N.和S.V.）和Fondo per gli Investimenti della Ricerca di Base grant RBNE01N4Z9_004（发给S.Z.）的拨款。

笔记

作者贡献：C.M.C.设计的研究；A.C.、G.A.C.、M.Fabbri和M.V.I.进行了研究；M.S.、S.E.W.、R.A.、S.Z.、M.D.、L.R.、H.A.、C.-g.L.、T.J.K.和M.N.贡献了新的试剂/分析工具；M.Ferracin和S.V.分析了数据。

缩写：CLL，慢性淋巴细胞白血病；miRNA，microRNA；BCL2，B细胞淋巴瘤2；凋亡蛋白酶激活因子1；PARP，聚ADP-核糖聚合酶。

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院