细胞生长、增殖和死亡的协调序列对组织维持和体内平衡至关重要。影响细胞生理学的因素包括生长因子、营养素和压力信号。细胞内信号网络集成多个有时相互冲突的信号来协调响应。FKBP12-雷帕霉素相关蛋白（FRAP）在该网络中起着重要作用，部分通过调节p70S6激酶（p70S6K）磷酸酶，确保细胞在最佳条件下生长(1). 雷帕霉素是FRAP的特异性调节剂，用雷帕霉素处理细胞可通过形成FKBP12-雷帕霉素FRAP三元复合物使p70S6K快速脱磷(2).
p70S6K活性对多种输入信号敏感，包括血清、营养素、沃特曼蛋白（磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂）和渗透应激(三). 有丝分裂原和生长因子主要通过上游激酶如磷脂酰肌醇3-激酶、磷脂酰肌苷依赖性激酶和Akt调节p70S6K。这种依赖激酶的磷酸化与未识别的“从属”磷酸酶相平衡，因此当细胞被剥夺血清时，这些从属磷酸酶会去磷酸化并使p70S6K失活。除了激酶定向调节外，p70S6K还受一种“显性”FRAP调节的磷酸酶调节，该磷酸酶与p70S6K构成相关(4). 即使在有丝分裂原存在的情况下，这种PP2A型磷酸酶的激活也会导致p70S6K的快速去磷酸化，这表明这种机制在激酶定向信号传导中占主导地位。雷帕霉素通过激活p70S6K磷酸酶以FRAP依赖的方式去磷酸化p70S6K(4).
通过截断其N和C末端而产生的p70S6K雷帕霉素抗性等位基因（NTCT-p70S6K）已被证明是分离p70S6K调节信号的一种有价值的试剂(5). NTCT-p70S6K对有丝分裂原和生长因子启动的激酶定向信号敏感，但对通过FRAP调节的磷酸酶的信号不敏感。NTCT-p70S6K不能与该磷酸酶相互作用。因此，NTCT-p70S6K对沃特曼（磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂）敏感，但对雷帕霉素不敏感。氨基酸缺乏产生的信号(6)和高渗(7)不影响NTCT-p70S6K活性，表明它们由FRAP介导，而不是由生长因子活化激酶介导。尽管使用NTCT-p70S6K进行的实验具有令人信服的性质，但不能排除NTCT-p70 S6K对冲击p70S6K的未知FRAP无关信号也不敏感的可能性。
最近，NTCT-p70S6K的相关应用已扩展到线粒体功能的研究。线粒体毒素耗尽线粒体质子梯度并降低细胞内ATP浓度，导致p70S6K失活(8,9). p70S6K的一个NTCT样等位基因对线粒体毒物具有抗性，表明FRAP对线粒体功能敏感。尽管线粒体对细胞生长和死亡具有中心作用，但我们对线粒体活性和生长调节信号之间的串扰性质知之甚少。
材料和方法
细胞系和试剂。
Jurkat和3T3细胞系是从美国类型培养物收集中心获得的，并按照建议进行维护。Kit-225细胞是Doreen Cantrell（Lincoln’s Inn Fields Laboratories，London）赠送的实物，并保存在补充有10%FBS和20单位/ml重组IL-2的RPMI中。抗FRAP单克隆抗体（抗-hTOR，目录号33–8100）和小鼠单克隆抗体-Bcl公司II（目录号13-8800）购自Zymed，小鼠单克隆抗calnexin抗体（克隆AF18，目录号MA3-027）来自Affinity Biogents（Golden，CO），兔多克隆抗p70S6K（目录号sc-230）来自Santa Cruz Biotechnology。S6激酶检测试剂盒购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY），并描述了兔多克隆抗FRAP抗体（RTP-302）(10). 共聚焦显微镜中使用的小鼠单克隆抗细胞色素氧化酶亚单位I（COX-1）（目录号A-6403）、线粒体电位探针JC-1、Mitotracker红（MTR）和Alexa-conjugated二级抗体购自Molecular Probes。除非另有说明，否则所有其他试剂均从Sigma购买。
质谱鉴定SDS/PAGE溶解蛋白。
Jurkat细胞在4°C的裂解缓冲液A（50 mM Tris●HCL，pH 7.4/150 mM NaCl/1%Triton X-100/3.3%甘油/1 mM DTT/蛋白酶抑制剂混合物）中裂解30分钟，并使用多克隆抗FRAP抗体（RTP302）从该细胞提取物中分离FRAP免疫复合物。通过银染或考马斯胶体染色观察SDS/PAGE溶解的免疫复合物。切除考马斯染色条带，在50%乙腈/水中清洗，并进行微序列测定。在Finnigan（加州圣何塞）LCQ四极离子阱质谱仪上，通过微柱反相高效液相色谱-纳米电喷雾串联质谱在哈佛微化学设施进行序列分析。
亚细胞分离和相关生物化学。
Jurkat细胞通过600℃离心收集克持续7分钟，将颗粒重新悬浮在裂解缓冲液B中（20 mM Hepes-KOH，pH 7.5/10 mM KCl/1.5 mM MgCl2/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1 mM-DTT/蛋白酶抑制剂混合物）补充250 mM蔗糖。添加250 mM蔗糖的缓冲液B称为缓冲液C。将悬浮液置于冰上并定期混合30分钟。然后对细胞进行双重发酵，并使用相控显微镜监测裂解的质量。离心匀浆（750克/在4°C下10分钟）；收集产生的上清液A，用裂解缓冲液B将颗粒洗涤两次，洗涤后的颗粒作为核部分保存。上清液A离心（12500克/4°C下15分钟），并保存产生的上清液B。用缓冲液C清洗一次颗粒，并将其保存为重膜颗粒。上清液B被超速离心（100000克/4°C下45分钟），所得上清液C为细胞溶质S/100分数。颗粒被标记为血管部分。将重膜颗粒重新悬浮在缓冲液C中，并在4000克持续15分钟，获得重线粒体颗粒，以进一步富集线粒体。所有亚细胞组分在−80°C下保存，直到进一步分析。对于SDS/PAGE分析，将组分溶解在0.125%SDS和0.012 M NaOH中，调整为1 mg/ml蛋白质（Bradford），并装载等量蛋白质进行免疫印迹。
蔗糖梯度梯度法纯化线粒体。
将重线粒体颗粒覆盖在蔗糖梯度上[在10 mM Tris●HCl（pH 7.5）和1 mM EDTA中1.0 M蔗糖和1.5 M蔗糖]。该制剂在60000下进行超速离心克在4°C下保持20分钟。将颗粒在缓冲液C中洗涤两次，并在−80°C下冷冻以进行进一步分析。
共焦显微镜。
将生长在盖玻片上的活性生长的3T3细胞用250 ng/ml MTR染色45分钟。随后用4%多聚甲醛固定细胞20分钟，并用冰镇丙酮渗透10分钟。然后用缓冲液D（2%正常山羊血清/3%牛血清白蛋白PBS）封闭细胞20分钟。在0.5%吐温中进行一级抗体染色，在0.1%吐温中使用Alexa-conjugated二级抗体（Alexa-fluor-488）。用缓冲液D清洗制剂两次，安装在蔡司LSM410共焦显微镜上，用氪/氩激光进行观察。
免疫电子显微镜。
通过使用无菌的5mM EDTA/PBS溶液收获活性生长的3T3细胞，并通过与等体积的2×固定剂（在0.2M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛，pH 7.4）混合来固定细胞悬浮液。将细胞制成颗粒，并在室温下用防腐剂溶液（2.3 M蔗糖，0.15 M甘氨酸，PBS）渗透15–30分钟。将颗粒装入液氮中并冷冻。用冷冻刀在−120°C下进行切片，用环浸在2.3 M蔗糖和2%甲基纤维素的1:1混合物中的刀从中取出切片，并转移到formvar/碳涂层铜网格上。网格放置在2%明胶上，直到免疫金标记。为了进行免疫金标记，将网格加热到37°C以融化明胶并在PBS中清洗。然后用1%BSA在PBS中将其封闭15分钟，用小鼠单克隆抗hTOR抗体（Zymed）在1%BSA/PBS中染色30分钟，用四滴PBS洗涤，最后用蛋白A-金在1%BSA中染色20分钟。在几滴PBS中洗涤后，通过将格栅简单浮在2%甲基纤维素和3%乙酸铀酰的9:1混合物上进行对比程序。去除多余液体后，用透射电子显微镜检查免疫金标切片（使用JEOL 1200EX和JEOL 100CX）。
线粒体电位的测量。
Kit 225细胞培养至0.5–1.0×10的密度6细胞/ml。对于每种情况，用适当的试剂处理10 ml细胞，处理时间适当。用荧光电位染料JC-1（5,5′，6,6′，-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物）评估线粒体电位(11). 简单地说，细胞在450×克在室温下，重新悬浮在1ml染色溶液中（含有处理剂和5μg/ml JC-1的完整培养基）。细胞在37°C培养箱（5%CO）中染色15分钟2). 染色后，在室温下收集细胞，并在处理溶液中清洗一次，然后用PBS清洗一次。然后将细胞颗粒重新悬浮在PBS中（预热至37°C），并使用Gemini Spectramax XS荧光板阅读器在37°C下对JC-1荧光进行定量（分子器件）。JC-1单体的荧光在485-nm激发/530-nm发射下用530-nm截止滤波器测量。使用570-nm截止滤波器在535-nm激发/590-nm发射下测量JC-1聚集体的荧光。对于每个实验，将聚集体/单体比率标准化为未处理的条件（100%）；因此，报告的数值代表了未经处理的健康细胞中线粒体功能的百分比。
结果和讨论
FRAP对雷帕霉素敏感的人类T细胞系中的线粒体功能障碍作出反应。
用线粒体抑制剂处理Kit-225细胞后，p70S6K显著去磷酸化（图。一个)以及其激酶活性的丧失（图。B类)暴露后几分钟内。相比之下，NTCT-p70S6K对线粒体功能障碍的抵抗力显著增强（图。C类). 这一结果表明，功能失调的线粒体以FRAP依赖的方式向p70S6K发出信号。丹尼斯等。(9)他们认为这种效应是由FRAP激酶活性下降引起的，他们认为FRAP的激酶活性受ATP水平的调节。然而，当用对FRAP羧基末端的自磷酸化位点反应的多克隆抗体测量时，我们发现用线粒体抑制剂治疗后FRAP的固有激酶活性没有变化(10)（未显示数据）。这些数据表明，线粒体功能障碍通过FRAP发出信号，而没有调节FRAP的内在激酶活性。我们还使用线粒体电位敏感荧光探针JC-1测量了雷帕霉素治疗后线粒体质子梯度(11). 雷帕霉素治疗不会导致线粒体电位发生显著变化（图。 D类和E类)表明FRAP不控制线粒体活性。
p70S6K磷酸化对线粒体功能障碍反应的分析。(一个)显示了p70S6K磷酸转移对未经处理、30%氨基酸可用性（30%aa）、氨基酸缺乏（0%aa）和雷帕霉素处理以及增加叠氮化物剂量（1 mM、2 mM、5 mM、10 mM）的响应。还包括对磷酸化Akt和Akt的类似分析。(B类)雷帕霉素和羰基氰化物对p70S6K活性的影响第页-三氟甲氧基苯腙（FCCP）治疗。(C类)ΔNTΔCT-p70S6K雷帕霉素抗性等位基因对氨基酸和血清存在、血清退出、氨基酸和血清退出、雷帕霉素处理和羰基氰化物的反应活性米-氯苯腙（CCCP）处理。(D类)通过JC-1分析，将雷帕霉素剂量引起的线粒体活性与CCCP处理的对照测量值进行比较。(E类)比较50 nM雷帕霉素治疗时间与CCCP处理的对照测量值的线粒体活性。
通过中间线粒体功能障碍向FRAP发送渗透应激和葡萄糖剥夺信号。
我们研究了氨基酸缺乏、葡萄糖缺乏和渗透应激信号是否通过中间线粒体功能障碍向FRAP发出信号。我们测量了线粒体功能对这些条件的反应。细胞暴露于山梨醇诱导的高渗压会在几分钟内导致线粒体质子梯度显著下降。渗透胁迫导致线粒体功能下降是时间依赖性、剂量依赖性的，并且几乎是完全可逆的（图。 一个和B类). 由于线粒体功能障碍导致快速FRAP依赖性p70S6K失活，结果表明，以FRAP依赖方式失活p70S6K的渗透调节信号的至少一部分通过中间线粒体功能障碍传递。同样，我们发现葡萄糖缺乏会导致线粒体活性可逆性下降（图。C类). 据报道，葡萄糖剥夺通过FRAP向p70S6K发出信号(12). 这些数据表明，FRAP通过线粒体活性监测葡萄糖的可用性。根据JC-1荧光测定，剥夺细胞30分钟的氨基酸不会导致线粒体质子梯度发生显著变化（数据未显示）。这一结果表明，氨基酸通过不依赖线粒体的方式向FRAP发出信号。
测量线粒体功能对高渗条件和葡萄糖缺乏的反应。(一个)将线粒体对暴露于渗透应激（600mM山梨醇处理）的时间的反应活性与CCCP处理进行比较。(B类)图中显示了线粒体对渗透胁迫水平（山梨醇%）的反应（黑色条）。在测量线粒体活性之前，用山梨醇处理Kit-225细胞30分钟。去除渗透压（山梨醇提取）20分钟后的线粒体活性显示为每个剂量的相邻条（灰色条）。(C类)葡萄糖缺乏引起的线粒体活动。Kit-225细胞暴露于指定条件下，并通过JC-1分析测定线粒体质子梯度。CM，完整媒体；GDM，葡萄糖缺乏培养基。
通过亚细胞分离研究分析FRAP免疫复合物和FRAP定位。(一个)FRAP免疫复合物中PDH复合物成分的鉴定。Jurkat细胞按照材料和方法用细胞裂解液通过抗FRAP多克隆抗体分离FRAP免疫复合物。考马斯染色凝胶显示使用模拟抗体（MOCK2）和FRAP免疫复合物（抗FRAP IP）获得的免疫复合物的分辨率。根据分子量标记了FRAP免疫复合物中富集但在模拟制剂中不存在的三条带。数字表示带的近似分子量。对标记为FIP70、FIP50和FIP36的条带进行微测序，以产生每个条带所示的肽序列。(B类)使用SDS/PAGE和FRAP和标记蛋白的免疫斑点对等量的指示组分进行解析。重膜颗粒中不存在HDAC1和p70S6K，表明该部分未被大量核蛋白或胞质蛋白污染。Calnexin主要是一种内质网（ER）驻留蛋白；它存在于重膜颗粒和囊泡部分中，这与重膜颗粒包含线粒体、溶酶体和ER滞留蛋白的事实一致。COX-1是一种线粒体标记物，因此主要出现在重膜颗粒中。FRAP存在于重膜颗粒和细胞溶质部分。(C类)分析未经处理和雷帕霉素处理的细胞的重膜颗粒（HMmbP）和细胞溶质（Cyt/S-100）组分的FRAP和标记蛋白水平的变化。分析中还包括一个额外的线粒体标记（Bcl-2）。(D类)使用蔗糖梯度（SG-MTCND）纯化的线粒体部分和未经处理和雷帕霉素处理的细胞的胞浆部分分析FRAP的存在。
丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物的成分存在于FRAP免疫复合物中。
为了研究FRAP的调节机制，我们鉴定了几个相互作用的蛋白质。我们从Jurkat细胞分离FRAP免疫复合物，通过SDS/PAGE解析洗脱的蛋白质，并将蛋白质带与使用三种模拟抗体（模拟1-3）获得的免疫复合物中的蛋白质带进行比较。该分析通过对凝胶进行镀银处理完成（数据未显示）。将FRAP免疫复合物中存在但模拟制剂中不存在的条带从胶体考马斯染色凝胶中切除，并使用MS对每一条的肽片段进行测序（图。一个). 在这些FRAP相互作用蛋白（FIP）中，三种蛋白（FIP70、FIP50和FIP36）被鉴定为线粒体PDH复合体的组成部分。FIP36、FIP50和FIP70条带分别被鉴定为PDH复合物的40-kDa E1β、45-kDa-E1α和70-kDa-E2亚单位。PDH复合物对糖酵解衍生的丙酮酸转化为乙酰辅酶A进行催化，然后辅酶A进入线粒体三羧酸循环(13).
FRAP与纯化线粒体共分馏。
用Jurkat细胞进行亚细胞分离。对由核蛋白、重膜蛋白、细胞溶质蛋白和囊泡蛋白组成的四个不同组分进行了标记蛋白和FRAP的检测。如图所示。B类这些数据表明FRAP与重膜颗粒和细胞溶质部分分离。我们使用蔗糖密度梯度超离心法从重膜颗粒中纯化线粒体。FRAP与纯化线粒体和雷帕霉素处理的共分馏对这种关联没有影响（图。 C类和D类).
共焦显微镜证实FRAP与线粒体的共聚焦。
用小鼠3T3细胞进行免疫荧光共聚焦显微镜观察。结果表明，FRAP的很大一部分与线粒体共定位（图。一个). 阳性对照（COX-1与线粒体共定位）和阴性对照（c-Myc与线粒体缺乏共定位）表明，所用条件能够区分这两种可能性。总之，这些数据表明至少存在两种不同的FRAP池，即胞质FRAP和线粒体FRAP（FRAPm）。
3T3细胞FRAP的免疫荧光共聚焦显微镜和免疫电子显微镜。(一个)共焦显微镜显示FRAP和线粒体的共聚焦。在固定和通透性之前，用MTR对线粒体进行染色。COX-1主要用抗COX-1单克隆抗体染色，FRAP主要用抗FRAP单克隆抗体着色，c-myc主要用抗c-myc单克隆抗体染。使用[Alexa-fluor-488]结合抗体作为二次染色。叠加框架中的黄色斑点表示colocolization。COX-1显示完全共定位（方法学阳性对照），而c-Myc不与线粒体共定位（法学阴性对照）。FRAP的很大一部分与线粒体共定位(B类免疫电镜显示FRAP的线粒体定位。使用链亲和素金的二次染色来检测初级抗FRAP mAb。箭头指向盒子内的电子密度二级探针。在C类长箭头指向典型的高频率膜近端定位。（放大倍数：×15000。）
FRAP与线粒体外膜（MOM）相关。
通过使用3T3细胞进行的免疫电子显微镜也揭示了FRAPm的存在（图。B类). 此外，在许多电子显微照片中，在线粒体边缘发现FRAPm，表明FRAPm以膜近端方式结合（图。C类). 纯化的线粒体部分用蛋白酶K处理20分钟，以确定FRAP是否暴露在线粒体表面。结果表明，与位于线粒体内膜（MIM）上的COX-1相比，线粒体FRAP对蛋白酶更敏感（图。一个). MOM积分蛋白Bcl-2也显示出类似的敏感性(14)（图。一个). 结果表明，FRAP与MOM结合并暴露在线粒体表面。碱敏感性试验结果表明，与Bcl-2不同，FRAP不是膜完整蛋白（图。B类). COX-1松散地附着在MIM上，对碱性处理也很敏感，并且在上清液中检测到（图。B类). 当纯化的线粒体部分用3M尿素处理10分钟时，与线粒体相关的FRAP数量减少，但Bcl-2的数量没有受到影响（数据未显示）。这些数据表明，与膜整合蛋白Bcl-2不同，FRAPm通过线粒体蛋白–FRAP相互作用与线粒体相关。由于PDH复合体位于线粒体基质中，FRAP与MOM相关，因此FRAP与PDH亚基的相互作用很可能是间接的。
FRAPm对蛋白酶处理和碱提取的敏感性。(一个)对有或无蛋白酶K处理（20分钟，室温）的线粒体制备进行解析，并对FRAP和线粒体标记物（COX-1和Bcl-2）进行免疫标记。COX-1与内膜相关，因此对蛋白酶K处理不敏感。Bcl-2与外膜相关并暴露在外，因此对蛋白酶处理敏感。FRAP对蛋白酶处理也很敏感。(B类)对线粒体制剂的等渗和碱性提取进行了分析。对这些提取物的不溶性颗粒（P）和上清液（S）进行了解析，并对FRAP和标记蛋白进行了探测。
线粒体和FRAP介导的生长调节模型。
该结果支持一个模型，即导致线粒体功能障碍的信号导致FRAPm介导的细胞生长调节（而基于氨基酸的信号可能通过胞浆FRAP）。我们怀疑对线粒体质子梯度敏感的外膜通道对这种感觉作用是必要的。初步实验证明，FRAP免疫复合物中存在线粒体通透性转换孔（PTP）的组成部分电压依赖性阴离子通道（VDAC），这一推测得到了支持（B.N.D.，未发表的工作）。FRAPm可以通过与通道（如PTP复合体）的物理关联来监测线粒体活性参数，PTP复合物由腺嘌呤核苷酸转运体（ANT）和VDAC组成（图。). 由于线粒体中生成的ATP分子通过ANT进入胞浆，因此FRAP也可能对线粒体ATP流量敏感，这符合最近的一项建议(9). 这项研究强调了FRAP在协调线粒体活性和生长调节方面的作用，这是一个具有广泛生物医学意义的细胞生物学领域。
说明FRAP在感知线粒体功能障碍和调节p70S6K中作用的模型。该模型强调了FRAP在通过中间线粒体功能障碍感应高渗和葡萄糖剥夺条件引发的信号中的作用。导致线粒体功能障碍的其他应激信号，如缺氧，也可能通过使用类似机制向FRAP发出信号。FRAP通过一种独立于线粒体的机制感知氨基酸剥夺。两种不同的途径协调p70S6K的调节：(我)由有丝分裂原或生长因子启动并与“次级磷酸酶”平衡的激酶导向途径(ii（ii）)FRAP介导的途径，涉及一种“显性磷酸酶”（PP2A亚型），通过p70S6K的N末端结构域（NTD）与wt-p70S6K构成关联。p70S6K的雷帕霉素抗性等位基因NTCT-p70S6K在NTD和C末端结构域（CTD）处被截短。显性磷酸酶不能与NTCT-p70S6K相关，因此FRAP介导的信号不会影响NTCT-p70 S6K。FRAP感知线粒体功能的潜在机制显示为“放大”(赖特). FRAP与线粒体PTP有关，PTP由VDAC和ANT组成。PDH复合体（位于线粒体基质中）与PTP非常接近，在PTP处可以接收糖酵解物衍生的丙酮酸，丙酮酸主要通过PTP进入线粒体。
