蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A（PP2A）控制参与细胞信号传导的许多蛋白质的磷酸化，是细胞生长的重要调节器(1,2). PP2A是包含PP4、PP5和PP6的PP2A类磷酸酶子集的原型。PP2A全酶是一种异源三聚体，由核心二聚体组成，由支架（a）和与多种调节亚基相关的催化亚基（C）组成。PP2A调节亚基的三个家族（R2/B、R3/PR72和R5/B56）已被鉴定(1,2). 调节亚基具有不同的特性，并产生多种PP2A全酶。目前的PP2A调控模型表明，含有不同调控亚单位的异源三聚体具有不同的功能体内。此模型仅提供有限的支持。遗传分析表明酿酒酵母将PP2A直接用于不同的细胞功能(三). 含有不同调节亚基的PP2A全烯同名物也具有不同的性质在体外(4). 高等真核生物个体调节亚基的功能尚不清楚。
PP2A的一个特征性功能是调节Ras-Raf活化蛋白（MAP）激酶信号通路。PP2A对这些依赖于细胞类型的途径有积极和消极影响。PP2A能使MAP/ERK激酶（MEK）和细胞外信号调节激酶（ERK）家族激酶去磷酸化和失活在体外(5——7). 用PP2A选择性抑制剂冈田酸处理细胞可激活MEK和ERK(8,9). 猴病毒40小肿瘤抗原掺入PP2A复合物抑制PP2A介导的MEK和ERK去磷酸化在体外并导致完整细胞中两种激酶的激活(10). 猴病毒40小肿瘤抗原激活MEK和ERK与R2/B亚单位的丢失相关。这些数据都表明PP2A是MAP激酶信号的负调控因子。PP2A可以与Raf结合，并且PP2A选择性浓度的冈田酸抑制哺乳动物巨噬细胞系中Raf的激活(11). R2/B亚基突变秀丽隐杆线虫导致Ras介导的外阴诱导减少(12). 之后的两个观察结果表明，PP2A可以作为Raf激活的积极调节器。在Ras介导的光感受器发育途径中果蝇属，PP2A对Raf上游有负面影响，但对Raf下游有正面影响(13). PP2A对MAP激酶信号的多重作用很可能由不同的全酶介导。
间接证据支持PP2A通过抑制凋亡促进细胞存活。冈田酸治疗可激活多种细胞类型的凋亡(14——20). 尽管这些观察结果表明PP2A在防止细胞凋亡中发挥作用，但它们并不是决定性的，因为其他磷酸酶，包括PP1、PP4、PP5和PP6，也受到冈田酸的抑制。PP2A与包括Bcl-2在内的多种参与凋亡的蛋白质相关(21,22)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(23)和腺病毒E4orf4蛋白(24——27). 腺病毒E4orf4蛋白诱导的细胞凋亡与含有R2/B-和R5/B56调节亚基的PP2A亚型有关。目前尚不清楚PP2A是否直接参与其他形式的细胞凋亡，或者抗细胞凋亡活性是否由特定的调节亚基介导。
双标记RNA（dsRNA）介导的RNA干扰（RNAi）已被证明是一种有效的“敲除”表达于秀丽线虫和黑腹果蝇(28——32). 与哺乳动物和酵母相比，果蝇属每个PP2A a都有一个编码基因(33)，C(34)和R2/B亚单位(35)，两个基因编码R5/B56亚单位同源物的不同亚型(36)和R3/PR72同源物的单个基因。有限数量的磷酸酶亚型使果蝇属一种对PP2A基因敲除研究有吸引力的生物。果蝇属还有一个编码PP4的基因(37)和PP5(38). 我们使用RNAi消融PP2A、PP4和PP5果蝇属Schneider 2（S2）细胞检测这些蛋白在细胞信号传导中的作用。我们还使用RNAi消融单个PP2A调节亚单位，以测试它们是否具有独特的功能。单个PP2A亚基的消融揭示了一种通过蛋白质稳定性控制PP2A低聚物组装的机制。数据表明，PP2A在S2细胞MAP激酶通路的调节中起着负作用。PP2A的缺失也会导致细胞凋亡，表明这种磷酸酶对细胞生存至关重要。与调节亚单位将PP2A靶向不同功能的模型一致，我们表明MAP激酶信号的调节和PP2A的抗凋亡作用是由不同的调节亚单位介导的。
材料和方法
双链RNA的生产。
果蝇属与PP2A亚单位PP4和PP5相对应的cDNA克隆购自Research Genetics（阿拉巴马州伯明翰）。cDNA克隆用作PCR反应的模板，其中正、反义引物在5′端均含有T7聚合酶结合位点。一个700-bp的区域果蝇属PP2A R3/PR72调节亚基是通过PCR从48小时胚胎cDNA文库（由德州大学西南医学中心的丹尼斯·麦凯林善意提供）中扩增出来的。PCR产物（≈500–700 bp）在Microcon自旋浓缩器（Millipore）中清洗，并在最终浓度为200 ng/μl的无菌水中再次悬浮。使用Novagen的大规模T7转录试剂盒，将每种PCR产物的一微克用于合成dsRNA。为了退火单链RNA，样品在65°C下培养30分钟并冷却至室温。以pEGFP-C3载体（CLONTECH）为模板，产生与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）相对应的对照dsRNA。
细胞培养和dsRNA处理。
无血清培养基适应施耐德S2细胞（D.Mel-2）和果蝇属无血清培养基购自Life Technologies（马里兰州罗克维尔）。S2细胞维持在果蝇属在28°C的T-75烧瓶中添加16.5 mM L-谷氨酰胺和46μg/ml庆大霉素的无血清培养基。对于dsRNA治疗，1 ml S2细胞悬浮液（1×106细胞/ml）英寸果蝇属将表达系统表达培养基（Invitrogen）与最终浓度为15μg/ml的指定dsRNA混合，并置于35-mm培养皿中。对于使用多个dsRNA处理的细胞，每个dsRNA的最终浓度为15μg/ml。在28°C下培养细胞3小时，然后添加2 ml果蝇属无血清培养基。dsRNA处理进行3天或如图图例所示。
细胞提取和Western印迹。
抽吸培养基，并在4°C的RIPA缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0/150 mM NaCl/1%Nonide P-40/0.5%脱氧胆酸盐/0.1%SDS/0.2 mM钒酸钠/10 mM氟化钠/0.4 mM EDTA/10%甘油）中对细胞进行10分钟的裂解。通过在微型离心机中以15000 rpm离心10 min来澄清裂解液，并根据双钦尼克酸蛋白质测定法（Pierce）测定的蛋白质浓度对样品进行标准化。通过SDS/PAGE解析总蛋白（30–60μg），并通过Western blotting检测单个蛋白。用0.1%抗PP2A A亚单位的F725抗血清检测免疫印迹(4); 0.1%C-20抗PP2A C亚单位抗血清（亲和生物试剂，新泽西州Neshanic站）；0.1%抗PP2A B56-1亚单位的M878抗血清(4); 0.1%PP5抗血清（由阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学Michael Chinkers善意提供）(39); 0.05%亲和纯化的抗PP4 c-int多克隆抗体（由田纳西州纳什维尔范德比尔特大学的Brian Wadzinski提供）(40); 0.02%MAPK-YT单克隆抗体抗活化ERK-1&2（Sigma）；或0.01%多克隆抗ERK 1和2（Sigma）。与氨基酸409–423对应的肽果蝇属R2/B亚单位被送往Capralogics（Hardwick，MA）生产R2/B（409-423）兔多克隆抗体，以0.1%的浓度用于检测免疫印迹。用适当的辣根过氧化物酶偶联二级抗体检测结合抗体，并通过增强化学发光进行可视化。
逆转录（RT）-PCR。
SUPERSCRIPT一步法铂RT-PCR塔克该试剂盒是从Invitrogen购买的。用dsRNA处理35-mm培养皿中的S2细胞72小时，并按照制造商的说明进行RT-PCR。用于RT-PCR的引物与用于dsRNA合成的PCR产物的引物相同。五微升（1/10）的反应在1%的琼脂糖凝胶上溶解。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶分析。
ApoAlert Caspase-3和Caspase-8分析试剂盒购自CLONTECH。用dsRNA处理35-mm培养皿中的S2细胞72小时，收获细胞，并按照制造商的描述检测caspase活性。通过在96 well平板读取器中读取405 nm处的吸光度，并根据每个样品的蛋白质浓度进行调整，从而测定Caspase-3样和Caspase-8样活性。将结果归一化为EGFP对照样品。所示值代表四个实验的平均值±SE。
显微镜。
细胞通过使用相位控制光学系统以32倍放大率、蔡司Axiover 35显微镜和ONCOR图像软件进行拍摄。将图像导入ADOBE PHOTOSHOP，手动计数细胞数和凋亡（气泡）细胞数。
结果和讨论
用RNAi选择性消融PP2A、PP4和PP5。
尽管冈田酸和其他抑制剂的研究表明PP2A参与了多种信号通路，但很难为这种磷酸酶指定特定功能。冈田酸在较高浓度下也抑制PP1，PP4、PP5和PP6被阻断PP2A活性的相同浓度所抑制(41). 为了剖析单个磷酸酶在细胞信号传导中的作用，我们使用RNAi选择性地删除PP2A、PP4和PP5(42——44).果蝇属用靶向单个PP2A亚单位、PP4或PP5的dsRNA处理S2细胞，并通过Western blotting测定其对蛋白质水平的影响（图。A类). 用A或C亚单位dsRNA处理细胞72小时后，相应的亚单位减少到几乎无法检测的水平。单独用A-或C-亚单位dsRNA处理导致所有PP2A亚单位的损失。用PP4或PP5 dsRNA处理降低了相应蛋白质的水平，但对其他磷酸酶或PP2A的水平没有影响。当用靶向R2/B、R3/PR72、R5/B56-1或R5/B56–2亚单位的单个dsRNA处理细胞时，每个靶向蛋白质都被清除，但对其他调节亚单位的影响很小。一般来说，单个调节亚基的消融对A和C亚基的水平几乎没有影响。例外是R5/B56–1和-2双敲除，其中观察到a和C亚单位显著减少。所有四个调节亚单位的消融导致A和C亚单位的丢失。用靶向EGFP的对照dsRNA处理S2细胞对任何PP2A亚单位、PP4或PP5的水平没有影响。
中PP2A、PP4和PP5的RNAi敲除果蝇属S2电池.(A类)果蝇属S2细胞在对应于EGFP的dsRNA或顶部指示的磷酸酶亚基的存在下孵育。72小时后，细胞在含有0.2 mM Na的RIPA缓冲液中溶解2VO（旁白）4和10 mM氟化钠2，通过离心澄清裂解产物。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白质（30-60μg），并用右侧所示的蛋白质抗体进行Western blotting检测。(B类)果蝇属S2细胞在没有或存在与EGFP或顶部指示的磷酸酶亚基对应的dsRNA的情况下培养。72小时后，按照以下说明进行RT-PCR材料和方法，带有针对磷酸酶亚基的引物，如右图所示。个别反应（最终反应混合物的5μl）在1%琼脂糖凝胶上分解，并用溴化乙锭染色检测。所示结果代表了三到七个实验。
因为抗果蝇属R5/B56–2和R3/PR72亚单位不可用，通过RT-PCR评估靶向这些亚单位的dsRNA的有效性。图。B类显示用R5/B56–2和R3/PR72 dsRNA处理S2细胞导致这些亚单位的mRNA显著减少。用C亚单位dsRNA处理细胞会导致可检测到的C亚单位mRNA完全丢失，但对其他PP2A亚单位mRNAs没有影响。dsRNA处理细胞中C亚单位mRNA的丢失与C亚单位蛋白水平的显著降低一致（图。A类). 用EGFP-dsRNA处理细胞对PP2A亚单位mRNA水平没有影响。
图中的数据。A类结果表明，敲除PP2A的A或C亚基会导致其他所有PP2A亚基的丢失。为了确定dsRNA处理细胞中亚单位的丢失是否是由于稳定性降低所致，用放线菌酮处理细胞以阻止新的蛋白质合成，并用Western blotting监测PP2A亚单位水平的下降。dsRNA处理的S2细胞中的蛋白质损失通常在3天后达到最大值（28；我们的观察结果）。为了检查蛋白质稳定性，在添加环己酰亚胺之前，用dsRNA处理细胞48小时，以确保蛋白质水平没有下降到检测极限以下。在用EGFP-dsRNA处理的对照细胞中，添加环己酰亚胺后，A-和C-亚单位蛋白的水平在8小时内保持稳定（图。，EGFP）。当细胞被A亚单位dsRNA处理时，添加放线菌酮后，C亚单位和R5/B56-1蛋白水平出现时间依赖性下降。用C亚单位dsRNA处理细胞时，A亚单位和R5/B56-1蛋白也出现了时间依赖性下降。用A或C亚单位dsRNA处理细胞48小时后，R2/B亚单位蛋白水平仅略有下降，并且在放线菌酮存在下R2/B子单位的损失比其他亚单位慢得多，这表明R2/B亚基比A、C或R5/B56-1亚基更稳定。在用C-亚单位dsRNA处理的细胞中，C-亚单位蛋白的稳定性显著降低。在这些条件下C亚单位蛋白快速丢失的原因尚不清楚。在用C亚单位dsRNA处理的细胞中，添加环己酰亚胺之前出现的C亚单位水平要低得多。C亚单位的水平可能接近抗体的检测极限，任何进一步的降低都会被放大。
PP2A全酶的缺失会破坏单个PP2A亚基的稳定性。果蝇属S2细胞在EGFP、A或C亚单位dsRNA存在下孵育48小时(赖特). 然后用500μM环己酰亚胺处理细胞，达到指定的时间，并在含有0.2 mM Na的RIPA缓冲液中进行裂解2VO（旁白）4和10 mM氟化钠2用离心法澄清裂解产物，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质（50μg），并用A、C、R2/B或R5/B56-1亚单位抗体进行Western blotting检测，如每行右侧所示。所示结果代表了三个实验。
图中的数据。和表明RNAi是敲除蛋白质磷酸酶的有效方法果蝇属S2电池。这些数据为控制PP2A全酶分布的机制提供了新的见解。除了翻译水平上C亚单位的潜在自动调节外(45)，我们的结果表明PP2A在翻译后水平上是自动调节的，以控制游离亚基的数量。结果如图所示。A类和与单个PP2A亚基具有低固有稳定性的模型最为一致。将亚基组装成异源三聚体复合物可提高单个蛋白质的稳定性。自由亚基的快速降解可能是保护细胞免受未调节形式PP2A有害影响的机制。在哺乳动物细胞中过度表达PP2A催化亚单位的尝试基本上没有成功。虽然这种失败可能部分是由于翻译抑制(45)我们的数据表明，限制表达的一个主要因素是自由亚基的快速降解。耗尽所有四个PP2A调节亚基导致A和C亚基的丢失（图。A类)这表明当AC二聚体与其中一个调节亚单位无关时是不稳定的。通过对细胞提取物的分析表明存在大量游离AC二聚体(46,47). 相反，我们的数据表明几乎没有游离二聚体存在体内虽然可能存在游离AC二聚体的短暂群体，但这种形式不太可能累积到显著水平。存在大量AC二聚体在体外可能在细胞裂解过程中通过PP2A全酶的解离产生。
PP2A是S2细胞MAP激酶信号的负调控因子。
RNAi用于检测PP2A调节亚单位在调节MAP激酶活化中的作用果蝇属S2电池。刺激果蝇属胰岛素受体以Ras和Raf依赖的方式激活S2细胞中的MAP激酶(28,48). 向未经处理的S2细胞中添加胰岛素导致MAP激酶活性短暂激活，在5分钟达到峰值，15分钟后恢复到控制值（图。). 使用A或C亚单位dsRNA耗尽PP2A导致MAP激酶的激活增强，尤其是在5至15分钟的时间点（图。A类). 相反，PP4或PP5的缺失对胰岛素刺激的MAP激酶激活几乎没有影响（图。E类). 为了测试PP2A对S2细胞MAP激酶信号的作用是否依赖于一个特定的调节亚单位，用RNAi敲除单个亚单位。R2/B亚单位的缺失导致MAP激酶激活增强，类似于A或C亚单位敲除所观察到的情况（图。B类). 相反，任何其他调节亚基的消融对胰岛素刺激的MAP激酶激活几乎没有影响（图。 B类——D类).
PP2A负调节胰岛素依赖性ERK激活。果蝇属S2细胞在含有靶向EGFP或特定磷酸酶亚基的dsRNA的情况下孵育A类——E类72小时后，用10μg/ml胰岛素处理细胞，处理时间为A类——E类并在含有0.2 mM Na的RIPA缓冲液中溶解2VO（旁白）4和10 mM氟化钠2.通过离心澄清裂解液，并通过SDS/PAGE解析等量的蛋白质（50μg）。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并用抗PP2A-A、-C、-R2/B、-R5/B56-1、PP4或PP5的抗体进行蛋白质印迹，如每行右侧所示。MAP激酶活化通过用ERK-1和-2磷酸化形式（P-ERK）特异性抗体进行印迹检测。通过用识别ERK-1和ERK-2的磷酸化和非磷酸化形式的抗体印迹来测定每个样品中MAP激酶的量。显示的结果代表了每个dsRNA处理的三到五个实验。
在缺乏PP2A的细胞中增强ERK激活表明PP2A是MAP激酶途径的负调控因子果蝇属S2电池。PP2A在中的作用果蝇属Ras介导的信号通路与以前关于光感受器发育的研究一致(11). A predominant role of the果蝇属Ras依赖信号中的R2/B亚单位得到了一项研究的支持，该研究表明R2/B子单位水平降低会导致光感受器发育缺陷(49). PP2A在Ras介导的信号转导中可发挥积极和消极作用(11). PP2A在同一途径中的多重作用可能是由于不同的PP2A全酶在不同的步骤中起作用。虽然我们不能排除PP2A的积极作用，但我们的数据表明，PP2A在S2细胞中胰岛素介导的MAP激酶激活中的主要作用是作为一种负调控因子。PP2A也是哺乳动物CV-1细胞中表皮生长因子受体启动的MAP激酶信号的负调控因子(8). 与S2细胞一样，PP2A在CV-1细胞中的作用似乎由R2/B亚单位介导。
胰岛素刺激途径中PP2A的几个潜在靶点导致ERK激活。PP2A或R2/B缺陷细胞中ERK的长时间激活可能是由于上游信号刺激增强或ERK去磷酸化速率降低所致。PP2A脱磷并灭活ERK在体外(50)负责ERK失活的快速阶段(7). S2细胞ERK的胰岛素依赖性激活依赖于果蝇属MEK同源物DSOR1(27)，PP2A也能去磷酸化MEK并使其失活在体外(51). PP2A耗竭的作用与MEK或ERK直接去磷酸化的作用一致秀丽线虫遗传分析表明，在外阴诱导途径中，R2/B作用于Ras下游，而Raf上游(12). PP2A可以与Raf结合，并且PP2A选择性浓度的冈田酸抑制哺乳动物巨噬细胞系中Raf的激活(9). 相反，PP2A在果蝇属感光细胞发育(11). 如果果蝇属Raf是PP2A的靶点，我们的数据表明它对Raf活性具有负调节作用。最后，PP2A对ERK激活的影响可以通过替代途径介导。猿猴病毒40小肿瘤抗原通过使用磷脂酰肌醇-3-激酶和非典型蛋白激酶C亚型的途径激活哺乳动物细胞中的MEK(52). S2细胞中可能存在类似的途径，因为胰岛素也刺激S2细胞的磷脂酰肌醇-3-激酶(27).
PP2A的R5/B56亚单位的缺失诱导细胞凋亡。
我们注意到在一些RNAi处理的细胞中S2细胞活力显著下降。用A-、C-或R5/B56亚单位dsRNAs处理细胞3天，细胞数量减少了65-70%（图。 A类和B类). PP5的RNAi缺失对细胞数量没有影响，而PP4的缺失使细胞生长减少20%。dsRNA处理细胞的活性急剧下降的一个解释是诱导凋亡。鉴定凋亡S2细胞的一种常见方法是发生在凋亡后期的特征性膜泡(53). 在经历主动凋亡的异步细胞中，在任何给定的时间，大约15%的细胞会出现膜起泡、DNA断裂和染色体凝聚等特征(54). 用A-或C-亚单位dsRNA处理S2细胞会导致剩余细胞中15-20%的细胞膜起泡（图。 A类和C类). 在用EGFP控制的dsRNA或对应于PP4或PP5的dsRNA处理的S2细胞中，未观察到气泡细胞的显著增加。与未经处理或EGFP-dsRNA-处理的细胞相比，PP2A-depleted细胞中气泡细胞数量的增加非常显著。
耗尽PP2A R2/B56调节亚单位减少果蝇属S2细胞数量和激活凋亡。(A类——C类)果蝇属S2细胞在没有（对照组）或存在靶向EGFP或底部显示的特定磷酸酶亚基的dsRNA的情况下培养A类——C类72小时后，用相位控制光学系统对细胞进行拍照。（放大倍数×32。）(A类)耗尽PP2A-A或-C亚单位会减少细胞数量并增加膜泡.显示了用靶向EGFP或PP2A A或C亚单位的dsRNA处理的细胞的代表性照片。（巴=10μm）(B类)耗尽PP2A-A、-C亚基或R2/B56调节亚基会降低果蝇属S2电池编号.对来自×32倍放大视野的dsRNA处理细胞进行计数，数值表示使用两个不同批次的dsRNA进行处理的四个实验的平均±SE，其中每个处理的至少三个视野进行了评分。(C类)耗尽PP2A-A、-C亚基或R2/B56两个调节亚基可诱导细胞膜起泡果蝇属S2电池.对放大倍数×32的dsRNA处理细胞的总细胞和凋亡（膜泡状）细胞进行评分，%凋亡值表示用两个不同批次的dsRNA进行处理的三个实验的平均值±SE，其中每个处理的至少三个区域进行了评分。(D类)耗尽PP2A-A、-C亚单位或R2/B56调节亚单位刺激caspase-3样活性。果蝇属S2细胞在没有或存在500μM环己酰亚胺（CX）的情况下培养3小时，或以EGFP或底部显示的特定磷酸酶亚基为靶点的dsRNA培养3天。半胱氨酸天冬氨酸酶分析如下所述材料和方法值表示四个实验的平均caspase-3活性±SE.Caspase活性根据蛋白质浓度进行标准化，并以EGFP-dsRNA处理细胞的百分比表示。
为了进一步证明PP2A的耗竭导致细胞凋亡，测定了caspase活性。S2细胞用靶向单个磷酸酶的dsRNA处理，3天后收获。细胞裂解物用于通过比色法测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，该比色法可测量第页-来自caspase-3特异性肽底物的硝基安替比林。对照细胞也用环己酰亚胺（一种特性良好的凋亡诱导剂）处理4小时。用A或C亚单位dsRNA耗尽PP2A导致caspase-3样活性增加2至3倍（图。D类). PP2A缺失细胞中caspase-3样活性水平与环己酰亚胺处理的细胞相当。相反，PP4或PP5的耗竭并未导致caspase-3样活性显著增加。当用胱天蛋白酶-8特异性底物测定细胞裂解物时，任何dsRNA或环己酰亚胺对活性几乎没有影响（数据未显示）。
用RNAi敲除单个PP2A调节亚基，以确定果蝇属亚单位参与凋亡反应。用靶向R2/Bα、R5/B56–1、R5/B56–2或R3/PR72亚基的dsRNA处理S2细胞3天，对存活率、膜泡或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性没有影响（图。 B类——D类). 当R5/B56–1和-2亚单位被RNAi敲除时，细胞数量减少，气泡细胞的百分比增加到与A和C亚单位敲除相同的水平（图。 B类和C类). 在R5/B56双敲除细胞中，半胱天冬酶-3样活性增加到与PP2A缺失或环己肟处理细胞相当的水平（图。D类). 这些结果表明，R5/B56亚单位，而不是其他PP2A调节亚单位，在防止凋亡方面具有特殊功能。结果还表明，R5/B56–1和R5/B56-2的抗凋亡功能是多余的，因为任何一种亚单位的单独存在都足以阻止细胞凋亡。
丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂作为强有力的凋亡诱导剂的活性已在多种细胞类型中被证明(20,55,56). 因为引起细胞凋亡的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂同时作用于PP1-和PP2A-样酶，所以很难确定涉及哪种磷酸酶。尽管其他磷酸酶也可能发挥作用，但我们的数据表明，S2细胞中PP2A调节亚基单个家族的缺失足以诱导细胞凋亡。这一结果表明PP2A活性对细胞生存至关重要，并表明丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂的凋亡作用是由于PP2A的抑制。丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂快速诱导哺乳动物细胞凋亡与蛋白质磷酸化增加有关，并依赖于caspase-3的激活(55). PP2A的dsRNA敲除诱导的细胞凋亡与蛋白酶活性对caspase-3底物肽的激活相关。果蝇属包含三种与哺乳动物caspase-3高度同源的caspase（DRICE、DCP-1和DECAY）(57). 每一种苍蝇半胱天冬酶都能裂解半胱蛋白酶-3底物。尽管我们的分析无法区分这些酶，但DRICE在S2细胞凋亡中的重要作用(58)表明PP2A或其R5/B56亚单位的缺失导致DRICE的激活。这些结果确立了PP2A在细胞存活中的关键作用。还需要进行更多的研究，以确定含有R5/B56的PP2A形式靶向的凋亡机制的信号通路和成分。
