美国国家科学院院刊。2002年3月19日；99(6): 3764–3769.
人类细胞跨损伤复制的定量测量：复制DNA聚合酶绕过碱性位点的证据
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莎朗·阿夫金
部门†生物化学和‡以色列Rehovot 76100 Weizmann科学研究所分子细胞生物学
希拉·阿达尔
部门†生物化学和‡以色列Rehovot 76100 Weizmann科学研究所分子细胞生物学
吉尔·布兰德
部门†生物化学和‡分子细胞生物学，Weizmann科学研究所，Rehovot 76100，以色列
兹维·利夫尼
部门†生物化学和‡以色列Rehovot 76100 Weizmann科学研究所分子细胞生物学
部门†生物化学和‡以色列Rehovot 76100 Weizmann科学研究所分子细胞生物学
由加利福尼亚州斯坦福大学医学院I.Robert Lehman传达
收稿日期：2001年11月4日；2002年1月23日接受。
摘要
癌基因和抑癌基因的突变对癌症的发展至关重要。突变形成的主要途径是未修复DNA损伤的复制。为了更好地了解哺乳动物跨损伤复制（TLR）的机制，建立了培养细胞中TLR的定量分析方法。该检测是基于培养细胞与缺口质粒的瞬时转染，在缺口区域携带一个位点特异性损伤。在随后的生物测试中，通过从细胞中提取的质粒转化大肠杆菌指示应变。使用该方法发现，通过腺癌H1299、骨肉瘤Saos-2、前列腺癌PC3和肝癌Hep3B细胞系中的合成碱性位点，TLR发生的效率分别为92±6%、32±2%、72±4%和26±3%。DNA序列分析表明，H1299细胞中85%的旁路事件涉及dAMP在合成碱性位点对面的插入。添加蚜虫灵（一种DNA聚合酶α、δ和ɛ的抑制剂）对旁路的抑制作用是原来的4.4倍。对两个DNA聚合酶η缺陷的XP-V细胞系的分析显示，旁路率为89%，表明聚合酶τ对碱性位点的旁路并不必要。这些结果表明，在人类细胞中，绕过碱性位点并不需要绕过特异性DNA聚合酶η，但它确实需要至少一种复制性DNA聚合体α、δ或ɛ。TLR定量分析有望用于多种培养哺乳动物细胞损伤旁路的分子分析。
突变的形成是几个重要生物现象中的关键事件，尤其是癌症和进化。突变形成的一个主要机制是逃避DNA修复的DNA损伤的复制(1). 多年来，这一过程的分子机制，即跨病变复制（TLR）、跨病变合成或病变旁路，尚不清楚。最近发现，负责进行病变旁路的主要酶是一种新型DNA聚合酶，专门用于复制DNA中受损的位点。这种DNA聚合酶存在于从大肠杆菌（DNA聚合酶V；参考文献。2和三)（例如，DNA聚合酶η；参考文献。4和5). 这些新的DNA聚合酶构成了新的DNA聚合酶Y超家族(6). 值得注意的是，人类包含Y家族的四个成员：DNA聚合酶η(4,5), ι (7,8)和κ(9–12)和hREV1，具有dCMP转移酶活性(13,14). 此外，人类可能有一种额外的聚合酶参与TLR，聚合酶ζ第3版和h修订版7基因（参考。15和16; 有关审查，请参阅参考文献。17–23).
尽管TLR机制在理解突变在癌症中的作用方面很重要，尽管Y家族DNA聚合酶的发现取得了进展，但对哺乳动物细胞损伤旁路机制知之甚少。这在一定程度上是因为缺乏细胞水平的适当分析。在这里，我们描述了培养细胞定量TLR分析的发展，以及它在通过基本位点的旁路分析中的应用。
材料和方法
材料。
限制性核酸酶、T4 DNA连接酶和T4多核苷酸激酶来自新英格兰生物实验室。RPMI 1640培养基、不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco PBS、含厄尔盐和必需和非必需氨基酸的MEM、FBS和蚜虫灵均来自Sigma。用于细胞培养的DMEM和青霉素和链霉素混合物来自GIBCO/BRL。
DNA。
所有寡核苷酸均由魏茨曼科学研究所生物服务部合成部门合成和纯化。以dSpacer CE磷酰胺岩（弗吉尼亚州斯特林Glen Research）为构建块，类似地合成了含有碱性位点类似物的寡核苷酸(24). gap-lesion质粒GP21和GP31以及gap-plasma GP20的构建（无损伤；图。)已描述(25–27). 质粒FGP21和FGP20分别与GP21和GP20相似，只是它们是全双链的。它们的制备与GP21和GP20类似，只是插入的寡核苷酸不包含间隙（图。). FGP21/T型-放大器和FGP21/C-放大器分别是FGP21/T和FGP21/C的氨苄青霉素耐药、卡那霉素敏感衍生物，是用GP21进行TLR实验获得的完整质粒分离物。FGP21/T包含一个与基本位点相对应的T，而FGP21/C在该位点包含一个C。此外，FGP21/C含有一个特定的标记，即删除了一个GC碱基对，该碱基对位于原始碱基位点下游的六个碱基（图。). 每个质粒都用Hin公司dIII和Xho公司一、 从中删除520-bp片段坎基因，然后将质粒连接到一个945 bp的片段上，该片段携带PCR生成的末端Xho公司我和Hin公司dIII站点，以及布拉质粒pUC18的基因,产生氨苄西林耐药性。质粒pSA26（长3356 bp；cm对)是生态RV–Hin公司来自质粒pACYC184的cII片段（长2712 bp）和Hin公司cII–Bgl公司来自质粒pOC2的I片段（644bp长）(28).
gap-lesion质粒的结构和相关结构。(上部)gap-lesion质粒的示意图。如图所示，病变附近的不同结构序列不同(下部)每个质粒。黑色矩形(上部)和X(下部)代表合成碱性位点。
细胞培养。
本研究中使用的人类细胞系为H1299，来源于大细胞肺癌(29); Saos-2，一种骨肉瘤衍生细胞系(30); 前列腺癌衍生细胞系PC3(31); 肝癌细胞系Hep3B(32); 和GM03617（XP30RO）(33)和GM03618（XP6DU）(34)XP-V患者的成纤维细胞系。H1299细胞在RPMI 1640培养基中培养，而GM03618和GM03617细胞系在MEM中用厄尔盐和必需氨基酸和非必需氨基酸培养。其他细胞系的细胞保存在DMEM中。每种培养基均添加10%的FBS（GM03618细胞除外，其添加20%的FBS）、10单位/ml的青霉素和10μg/ml的链霉素。细胞在37°C和5%CO中培养2大气。除了从新泽西州卡姆登Coriell cell Repositories购买的XP-V细胞系GM03617和GM03618外，这些细胞系均来自魏茨曼科学研究所的M.Oren。
在体内TLR分析。
TLR分析包括以下步骤：(我)用含有gap-lesion质粒（GP21或GP31；kan）的质粒混合物转染人类细胞对)，内对照质粒pSA26（cm对)和载体质粒pUC18。(ii（ii）)从人类细胞中提取质粒。(三)转换大肠杆菌带有质粒混合物的指示菌株。(iv（四）)从转化子数量中扣除病变旁路修复范围。用定量琼脂糖凝胶电泳法对gapped质粒和质粒pSA26进行了高度纯化。协议如下。用磷酸钙法将含有200 ng gapped质粒、200 ng内控质粒pSA26和10μg载体质粒pUC18的DNA混合物与人细胞共转染(35). 细胞在37°C或32°C、5%CO的适当培养基中培养20小时2大气。在培养结束时，收集细胞，并通过使用基于碱性裂解的质粒纯化试剂盒（Promega）提取其质粒含量。为了进一步纯化，用乙醇沉淀DNA，并将其重新溶解在20μl的10mM Tris·HCl、1mM EDTA、pH 7.5中。接下来，将获得的15μl DNA溶液添加到150μl大肠杆菌JM109型记录A活性细胞。在冰上孵育1分钟后，将混合物转移到冷的0.2厘米电穿孔细胞（Bio-Rad）中，施加一个12.5 kV/cm的脉冲，时间常数为3.5–6毫秒。然后将细胞在37°C的1 ml SOC培养基中培养1 h。将细胞平行放置在含有卡那霉素（50μg/ml）或氯霉素（30μg/ml。对于每次转染，通过除以GP21*或GP20*转化子的数量（卡那霉素平板上的菌落数量；星号表示从哺乳动物细胞中回收后的指示质粒）计算回收质粒的相对标准化数量通过内部标准质粒pSA26*的相应转化子数量（氯霉素平板上的菌落数量）。通过将GP21*（带损伤的间隙质粒）的相对标准化量除以GP20*（无损伤的间隙质体）的相对规范化量，计算损伤旁路修复的百分比。如果需要，从kan中提取质粒对Weizmann科学研究所生物服务部的自动DNA测序分析确定了与病变相对的序列。
结果
TLR分析概述。
定量测量特定DNA损伤旁路范围和特异性的试验体内基于培养细胞与缺口质粒的瞬时转染，在单链DNA区域携带一个位点特异性损伤（图。). 这种结构不能在没有同源DNA拷贝的情况下通过重组修复修复，也不能在没有互补DNA链的情况下进行切除修复。因此，质粒在细胞中修复的唯一已知机制是通过TLR填充缝隙。实验大纲包括用gap-lesion质粒转染培养细胞，然后培养一段时间以允许TLR。TLR的分析在随后的步骤中完成，方法是从哺乳动物细胞中分离质粒，并将其导入大肠杆菌指示应变（图。). 哺乳动物细胞中TLR的效率由大肠杆菌转化者。所使用的质粒既不包含哺乳动物也不包含病毒复制来源，因此不能在哺乳动物细胞中复制。作出这一选择是为了使从细胞中解救出来的质粒DNA数量与TLR修复的质粒分子数量之间直接定量关联。
为了定量测量病变旁路，gapped质粒（kan对)与另外两个质粒共转染：(我)一个完整的质粒，作为内部标准（cm对)、和(ii（ii）)载体质粒（amp对)，以实现最佳转染效率。为了在没有损伤的情况下从细胞中恢复间隙质粒以使其正常化，我们并行进行了成对的转染：一个转染带有间隙质粒，另一个转印带有类似的间隙质粒，但没有损伤。每个转染混合物还包含内部标准质粒和载体质粒。
TLR测定的对照实验。
TLR分析可靠性的关键要求是哺乳动物细胞中未修复的gap-lesion质粒不能在指示剂中存活大肠杆菌应变。这种情况是通过使用碱性裂解程序从细胞中提取质粒来实现的。在这个过程中，间隙或缺口质粒变性，而共价闭合质粒（即间隙完全填充的质粒）保持完整。为了评估碱性裂解方法在选择性降低间隙质粒转化能力方面的有效性，进行了以下实验。用对照质粒pSA26和载体质粒pUC18转染H1299细胞，但没有间隙质粒。提取细胞的质粒含量，在碱性变性步骤之前，添加有缺口的质粒GP20或GP21。然后用质粒混合物转化大肠杆菌指示应变。如表所示（实验1），kan的比率对菌落（源自缺口质粒GP20或GP21）至厘米对菌落（来源于共价封闭质粒pSA26）非常低（5.7×10−5至1.02×10−3)表明大多数缺口质粒在提取过程中无法存活。当使用未经任何处理的GP20和GP21来转换大肠杆菌应变时，其转化率分别为0.80和0.0048（表，实验2）。这一发现表明，碱性处理的间隙质粒的转化效率比未变性的间隙质粒低500到1000倍。请注意，GP21将大肠杆菌应变效率比GP20低得多，因为指示应变为记录-有缺陷，因此无法绕过基本位点。当质粒之前没有通过人类细胞时，病变旁路平均达到0.6%（表)，与之前的结果一致(25,36). 这些结果表明，哺乳动物细胞中未进行间隙填充的质粒转化指示菌株的能力极低，它们对旁路实验中观察到的转化子数量的贡献可以忽略不计（见下文）。
表1
| 支出。 | 检测质粒 | 治疗 | 转化体
| Kan转化率对/厘米对 | 旁路水平 |
|---|
| 菅直人对 | 厘米对 |
|---|
| 1 | 通用条款21 | 碱性 | 2 | 35,000 | 5.7E-05年 |
| 通用条款20 | 碱性 | 21 | 20,500 | 1.02E-03号机组 | 纳 |
| 2 | 通用条款21 | — | 26 | 5,420 | 0.0048 |
| 通用条款20 | — | 4200 | 5,250 | 0.80 | 0.60 |
| 三 | FGP21号机组 | — | 4320 | 4,450 | 0.97 |
| FGP20公司 | — | 5280 | 5,400 | 0.98 | 纳 |
| 4 | FGP20公司 | — | 390 | 403 | 0.96 | 纳 |
TLR不能从DNA中消除碱基位点。另一方面，填充质粒转化大肠杆菌取决于通过基底切除修复消除基底部位。为了测试TLR产物转化指示菌株的能力，构建了一个类似于GP21的质粒，但它是完全双链的。该结构称为FGP21，模拟TLR产物。此外，构建了一个无损伤的对照质粒，称为FPG20。研究发现，两种结构都以相似的归一化效率转换了指示应变（表，实验3），表明在大肠杆菌这一发现表明，填充在哺乳动物细胞中的间隙质粒分子能够转化大肠杆菌指示菌株，无论哺乳动物细胞中的碱基位点被移除。控制实验表明大肠杆菌转化子忠实地表示TLR填充的间隙塑性体的数量。
高效旁路人肺腺癌细胞株H1299中的合成Abasic位点。
该试验用于确定人肺腺癌H1299细胞系的病变旁路范围。实验重复六次，并计算每个实验的病变旁路百分比。如表所示病变旁路范围很广，平均有效率为92%。在不同实验中获得的转化子的绝对数量有很大差异（表中的第3列和第4列)反映了转染、提取和转化方面的差异。然而，最终病变旁路水平具有显著的可重复性：六个实验的变异系数仅为6.5%。这一结果表明，拥有适当的对照质粒和内部标准质粒确实能够可靠地确定哺乳动物细胞中损伤旁路的程度。
表2
| 出口编号 | 缺口质粒 | 转化体
| 菅直人对/抄送对 | 旁路电平，% |
|---|
| 菅直人对 | 厘米对 |
|---|
| 1 | 通用条款21 | 110 | 795 | 0.138 |
| 通用条款20 | 55 | 400 | 0.138 | 100 |
| 2 | 通用条款21 | 200 | 1860年 | 0.108 |
| 通用条款20 | 185 | 1650年 | 0.112 | 96 |
| 三 | 通用条款21 | 80 | 1,135 | 0.070 |
| 通用条款20 | 70 | 860 | 0.081 | 86 |
| 4 | 通用条款21 | 150 | 1,160 | 0.129 |
| 通用条款20 | 265 | 1,905 | 0.139 | 93 |
| 5 | 通用条款21 | 185 | 1,825 | 0.101 |
| 通用条款20 | 220 | 1,845 | 0.119 | 85 |
| 6 | 通用条款21 | 50 | 380 | 0.132 |
| 通用条款20 | 80 | 540 | 0.148 | 89 |
| | | | | 平均92±6 |
表表明对照质粒（cm）的转化子数量对)比gapped质粒（kan）的转化子数量高一个数量级对). 因为质粒FGP20（完全修复的GP20的模拟物）和pSA26在整个分析步骤中显示出相似的存活率（表实验4），GP20或GP21转化子的数量较低可能是由于哺乳动物细胞中有缺口的质粒存活率较低所致。
TLR发生的速度有多快？为了回答这个问题，在不同的时间点从细胞中提取DNA，并确定病变旁路的范围。结果发现，转染后8小时旁路达到60%，26小时后继续上升到94%。
不同细胞系Abasic位点的旁路。
在H1299细胞系中获得的高程度的旁路以及检查该方法对不同细胞系的适用性的愿望促使我们在其他三种人类细胞系中测定病变旁路。其中包括成骨肉瘤细胞系Saos-2、前列腺癌细胞系PC3和肝癌细胞系Hep3B。如表所示尽管旁路有很大差异：Saos-2细胞为32%，PC3细胞为72%，Hep3B细胞为26%。该检测具有高度的重复性，这表明在对每个细胞系进行的多次实验中变异很小。这一发现表明，该分析是稳健的，适用于多种细胞系。
表3
| 细胞系 | 缺口质粒 | Kan转化率对/抄送对 | 旁路水平，% |
|---|
| H1299型 | 通用条款21 | 0.113 |
| 通用条款20 | 0.123 | 92% ± 6 |
| Saos-2号机组 | 通用条款21 | 0.058 |
| 通用条款20 | 0.180 | 32% ± 2 |
| PC3公司 | 通用条款21 | 0.060 |
| 通用条款20 | 0.083 | 72% ± 4 |
| Hep 3B型 | 通用条款21 | 0.014 |
| 通用条款20 | 0.054 | 26% ± 3 |
在H1299细胞中，dAMP主要插入到合成Abasic位点的对面。
为了检测旁路的特异性，从kan中提取质粒对并在病变附近进行DNA序列分析。这一过程是针对缺口质粒GP21和GP31进行的。除了碱基位点附近的DNA序列外，这些质粒是相同的（图。). 总共测定了73个突变体的DNA序列。如表所示当GP21或GP31通过H1299细胞时，绝大多数突变体包含碱基替换突变（36/37；97%）。碱基替换检测表明，dAMP优先插入合成碱基位点的对面，包括GP21的14/15突变（93%）和GP31的16/22突变（73%）。从GP21E产生的突变体中获得了类似的图片，GP21E是GP21的衍生物，具有约350 nt的较大间隙（GP21E的TLR与GP21相似；数据未显示）。在这种情况下，16个突变体中有15个涉及dAMP在病变对面的插入（表). 在45/53个突变体（85%）中，dAMP被插入到合成碱基位点的对面。作为对照，我们测定了未通过H1299细胞的相同gap-lesion质粒的DNA序列。如表所示在这些条件下，33/36（92%）的突变体包含与abasic位点相反的小缺失，主要是减去一个缺失。这一发现与已发表的合成碱性位点的特异性相似大肠杆菌recA菌株(25). 此外，它提供了强有力的证据，证明在当前的试验中，旁路及其相关突变确实发生在H1299细胞中。
表4
| 突变类型 | 缝隙质粒GP21
| 缺口质粒GP31
| 缺口质粒GP21E
|
|---|
| H1299型 | — | H1299型 | — | H1299型 |
|---|
| 基础替代 |
| A类 | 14 | — | 16 | — | 15 |
| 克 | — | 1 | 2 | — | — |
| T型 | — | 1 | 2 | — | — |
| C类 | — | 1 | 2 | — | — |
| 总碱替代 | 14 (93%) | 3 (19%) | 22 (100%) | — (0%) | 15 (94%) |
| 删除 |
| −1 | 1 | 12 | — | 18 | — |
| −2 | — | — | — | — | 1 |
| −三 | — | 1 | — | 2 | — |
| 删除总数 | 1 (7%) | 13（81%） | -（0%） | 20 (100%) | 1 (6%) |
| 分析的突变体总数 | 15 | 16 | 22 | 20 | 16 |
重组修复对Gap-损伤质粒的填充没有显著作用。
基础部位旁路的高效性促使我们考虑重组修复是否至少对某些间隙填充事件负责。如上所述，只有TLR才能填充哺乳动物细胞中的缝隙。然而，一旦细胞内的一些质粒分子被TLR填充，它们可以提供同源的完全双链质粒拷贝，用于重组修复额外的gap-lesion质粒。这可能会通过添加重组修复组件而导致对TLR效率的过高估计。为了检验这种可能性，我们将gap-lesion质粒与pFGP/T质粒共转染-放大器，它模拟了一个修复后的填充gap-lesion质粒。该质粒没有间隙，它包含一个AT碱基对而不是病变（模板链上有A，即对应病变部位）。此外，质粒含有布拉该基因取代了卡那霉素基因的一部分，因此产生氨苄西林耐药性。如果使用同源共转染质粒通过重组填补缺口，则至少部分恢复的kan对质粒应该有一个T，与对应于碱基位点的位置相反，就像同源伴侣质粒一样。17只填充kan的DNA序列分析对GP21衍生的突变体显示，15个携带与碱基位点对应的位置相反的A，一个携带T，一个携带C。这意味着通过重组修复获得最多6%（1/17）的突变体。这很可能是一个过高估计，因为TLR也可能导致在如此低的频率下，在基本位置对面并入T（见表). 用pFGP/C进行了类似的实验-放大器作为GP21的同源合作伙伴。在这种情况下，如果发生重组，预期C与碱性位点对应的位置相反，并且修复的质粒预计也具有pFGP/C的-1缺失标记-放大器22个填充kan的DNA序列对突变体显示，16个携带与基本位点相对应的A，2个携带T，3个携带C，1个携带大量缺失。pFGP/C中没有携带附近缺失一个缺失标记的质粒-放大器这表明带有C的突变体是通过TLR获得的，而不是通过重组获得的。综上所述，这些结果表明，在这个系统中，绝大多数gap-lesion质粒都是通过TLR修复的，如果有重组修复，其贡献很低（<5%）。这一发现与之前的研究一致，之前的研究表明，培养细胞中的同源重组水平非常低(37,38).
合成Abasic位点的旁路不需要聚合酶η，并且对Aphidicolin敏感。
TLR领域的一个基本问题是，绕过特定DNA损伤的DNA聚合酶的身份是什么。研究这个问题的一个方便方法是使用特定DNA聚合酶发生突变的细胞系或使用特定抑制剂。为了检测聚合酶η是否参与人类细胞碱性位点的旁路，我们检测了两个聚合酶τ缺陷的XP-V细胞系中的TLR。有说服力体内和在体外聚合酶η绕过紫外线诱导的环丁基嘧啶二聚体的证据（参考文献。39); 然而，其参与人体碱性部位旁路的作用尚不清楚(40,41). 如表所示，XP-V细胞系的旁路率较高，达到88-89%，与H1299细胞的旁路率相似。这一发现表明聚合酶η对碱性位点的旁路不是必需的。
表5
| 细胞系 | 治疗 | 缺口质粒 | Kan转化率对/抄送对 | 旁路水平，% |
|---|
| H1299型 | — | 通用条款21 | 0.142 |
| | 通用条款20 | 0.155 | 91 ± 3 |
| GM03618号文件(XP-V型) | — | 通用条款21 | 0.020 |
| | 通用条款20 | 0.022 | 89 ± 5 |
| GMO3617号(XP-V型) | — | 通用条款21 | 0.024 |
| | 通用条款20 | 0.027 | 88 ± 4 |
| H1299型 | — | 通用条款21 | 0.173 |
| | 通用条款20 | 0.188 | 92 ± 4 |
| H1299美元 | 蚜虫苷*二甲基亚砜/乙醇† | 通用条款21 | 0.034 |
| 通用条款20 | 0.191 | 18 ± 2 |
| H1299型 | 二甲基亚砜/乙醇溶液† | 通用条款21 | 0.186 |
| 通用条款20 | 0.235 | 79 ± 3 |
Aphidicolin是DNA聚合酶α、ɛ和δ的抑制剂，但不是Y家族DNA聚合酶类的抑制剂(7,12,42)而不是酵母聚合酶ζ(43); 人类聚合酶ζ尚未纯化。我们检测了在蚜虫双唑啉存在下H1299细胞合成碱性位点的旁路。如表所示在没有蚜虫灵的对照培养皿中，如预期的那样，旁路率为92%。当对照细胞在二甲基亚砜/乙醇的存在下生长时，这种高旁路略微降低到79%，二甲基亚磺酸盐/乙醇是溶解蚜虫精的溶剂。当在阿非迪戈林存在下进行测定时，旁路仅为18%，代表4.4倍的抑制作用（表). 这一发现表明，人类细胞中至少需要一种复制聚合酶α、ɛ或δ来绕过碱性位点。
讨论
本研究描述了哺乳动物细胞TLR定量分析的发展。该检测包括用缺口质粒瞬时转染培养细胞，该缺口质粒在缺口区域含有合成的碱性位点。该分析系统的优点是：(我)使用哺乳动物细胞中无法复制的质粒，可以使从细胞中救出的DNA数量与TLR修复的gap-lesion质粒分子数量直接相关。(ii（ii）)TLR分析与复制分离，提供了一个更简单的模型系统。(三)该检测可应用于多种细胞系，而不限于允许进行外显子复制的特殊细胞系。该系统的局限性在于研究了染色体外DNA，这意味着染色体TLR的一些元素丢失。此外，缝隙填充DNA合成过程中的病变旁路可能与复制过程中的损伤旁路不同。然而，使用间隙损伤质粒系统进行的详细分子分析有望揭示哺乳动物TLR的一些基本特性。
对几种细胞系中病变旁路的分析显示，合成基底部位在26-92%的水平上被旁路。不同细胞系之间的旁路差异，很可能是由于病变旁路聚合酶表达或调节的差异。不同细胞系之间的变异很常见，通常是因为这些癌细胞经历了各种遗传变化（例如，参考文献。44). 我们在一些细胞系中观察到的碱性部位的低旁路可能通过增加这些损伤的精确修复来补偿，例如通过增加修复酶的表达；然而，这种可能性尚未得到检验。合成碱基部位是碱基部位的模型病变，是最常见的自发性病变之一(45). 这种损伤具有高度的诱变性，并对DNA聚合酶构成强烈障碍(46). 例如，在大肠杆菌即使在诱导SOS系统时，也会绕过基本位置体内仅达到≈5%(25,36). 我们的数据表明，在哺乳动物细胞中，碱基位点被绕过的水平是大肠杆菌这表明TLR在哺乳动物细胞中起着更重要的作用。
H1299细胞中的大多数TLR事件（85%）涉及dAMP在合成碱性位点对面的插入（表). 这一结果与之前在COS细胞中进行的研究一致，其中一个构建体携带类似的损伤，但也携带猿病毒40复制源(47). 使用不能或能够自主复制的载体获得的类似结果加强了基于非复制质粒瞬时转染的检测系统与哺乳动物细胞TLR研究的生理相关性。值得一提的是，在另外两项基于穿梭载体的研究中，每个穿梭载体在特定位置携带一个碱性损伤，对碱性位置相反的特定核苷酸没有明显的偏好(48,49). 不同研究之间存在差异的原因尚不清楚。它们可能是由于所使用的系统和基板的差异造成的。
体外对纯化哺乳动物DNA聚合酶的旁路研究表明，至少在某些条件下，大多数聚合酶可以绕过碱性位点(11,24,50–55). 这强调了体内TLR数据用于确定特定DNA聚合酶在特定病变旁路中的生理作用。有趣的是，在在体外聚合酶η绕过碱性位点的能力(40,41). 这里展示的XP-V细胞系缺乏聚合酶η的实验清楚地表明，聚合酶τ对人类细胞系中碱性位点的旁路是不需要的。这一结果与阿西德洛林抑制旁路的发现一致，阿西德洛林抑制DNA聚合酶α、δ和Ş，但不抑制η。两种聚合酶α(24)和聚合酶δ(52,53)包含相反的碱基位点，而聚合酶的TLR特性未知。因此，在基本位点对面插入的序列特异性不能精确定位病变旁路所需的聚合酶体内有趣的是，有人建议酿酒酵母绕过基本位点需要聚合酶δ和ζ(56). 此外，可以认为是聚合酶δ在复制过程中遇到损伤。因此，基于其生化特性和与酵母系统的类比，聚合酶δ很可能是复制碱性位点所需的DNA聚合酶体内然而，此时不能排除聚合酶α和/或聚合酶ɛ的参与。无论如何，这项研究强调了这样一个概念，即病变旁路并不局限于专门的DNA聚合酶。
致谢
我们感谢Moshe Oren的帮助和宝贵的建议。这项研究得到了以色列科学基金会（Grant 78/00）和慕尼黑Minerva基金会的资助。Z.L.是生物医学研究领域Maxwell Ellis教授主席的现任主席。
工具书类
1Friedberg E C、Walker G C、Siede W。DNA修复和突变。华盛顿特区：美国微生物学会。出版社；1995[谷歌学者] 2Tang M、Shen X、Frank E G、O’Donnell M、Woodgate R、Goodman M F。美国国家科学院程序。1999;96:8919–8924. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。鲁文N B、阿拉德G、毛尔绍沙尼A、利夫内赫Z。生物化学杂志。1999;274:31763–31766.[公共医学][谷歌学者] 4Masutai C、Kusumoto R、Yamada A、Dohmae N、Yokoi M、Yuasa M、Araki M、Iwai S、Takio K、Hanaoka F。自然（伦敦）1999;399:700–704.[公共医学][谷歌学者] 5Johnson R E、Kondratick C M、Prakash S、Praka L。科学。1999;285:263–265.[公共医学][谷歌学者] 6Ohmori H、Friedberg E C、Fuchs R P P、Goodman M F、Hanaoka F、Hinkle D、Kunkel T A、Lawrence C W、Livneh Z、Nohmi T等。分子细胞。2001;8:7–8.[公共医学][谷歌学者] 7Tissier A、McDonald J P、Frank E G、Woodgate R。基因发育。2000;14:1642–1650. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Ohashi E、Ogi T、Kusumoto R、Iwai S、Masutai C、Hanaoka F、Ohmori H。基因发育。2000;14:1589–1594. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11张毅，袁凤，吴旭，王明，李奇博利特O，泰勒J S，吉亚辛托夫N E，王忠。核酸研究。2000;28:4138–4146. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Gerlach V L、Feaver W J、Fischhaber P L、Friedberg E C。生物化学杂志。2001;276:92–98.[公共医学][谷歌学者] 14Gibbs P E、Wang X D、Li Z、McManus T P、McGregor W G、Lawrence C W、Maher V M。美国国家科学院程序。2000;97：4186–4191。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Gibbs P E、McGregor W G、Maher V M、Nisson P、Lawrence C W。美国国家科学院程序。1998;95:6876–6880. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Murakumo Y、Roth T、Ishii H、Rasio D、Numata S、Croce C M、Fishel R。生物化学杂志。2000;275:4391–4397.[公共医学][谷歌学者] 17Johnson R E、Washington M T、Prakash S、Praka L。美国国家科学院程序。1999;96:12224–12226. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18伍德盖特R。基因发育。1999;13:2191–2195.[公共医学][谷歌学者] 19古德曼·M·F。生物化学科学趋势。2000;25:189–195.[公共医学][谷歌学者] 20Friedberg E C、Feaver W J、Gerlach V L。美国国家科学院程序。2000;97:5681–5683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Baynton K，Fuchs R P P。生物化学科学趋势。2000;25:74–79.[公共医学][谷歌学者] 22Livneh Z.公司。生物化学杂志。2001;276:25639–25642.[公共医学][谷歌学者] 24Takeshita M、Chang C-N、Johnson F、Will S、Grollman A P。生物化学杂志。1987;262:10171–10179.[公共医学][谷歌学者] 25Reuven N B、Tomer G、Livneh Z。分子细胞。1998;2:191–199.[公共医学][谷歌学者] 26Tomer G、Reuven N B、Livneh Z。美国国家科学院程序。1998;95:14106–14111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Tomer G，Livneh Z。生物化学。1999;38:5948–5958.[公共医学][谷歌学者] 29Brower M、Carney D N、Oie H K、Gazdar A F、Minna J D。癌症研究。1986年；46:798–806.[公共医学][谷歌学者] 30Rodan S B、Imai Y、Thiede M A、Wesolowski G、Thompson D、Bar-Shavit Z、Shull S、Mann K、Rodan G A。癌症研究。1987;47:4961–4966.[公共医学][谷歌学者] 31Lindgren J、Blaszczyk M、Atkinson B、Steplewski Z、Koprowski H。癌症免疫疗法。1986年；22:1–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Bressac B、Galvin K M、Liang T J、Isselbacher K J、Wands J R、Ozturk M。美国国家科学院程序。1990;87:1973–1977. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Lehman A R、Kirk-Bell S、Arlett C F、Paterson M C、Lohman P H、de Weerd-Kastelein E A、Bootsma D。美国国家科学院程序。1975;72:219–223. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Cleaver J E、Greene A E、Coriell L L、Mulivor R A。细胞遗传学细胞遗传学。1981;31:188–192.[公共医学][谷歌学者] 35Graham F L、van der Eb A J。病毒学。1973;52:456–467.[公共医学][谷歌学者] 36Lawrence C W、Borden A、Banerjee S K、LeClerc J E。核酸研究。1990;18:2153–2157. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Cordonnier A M，Fuchs R P。突变研究。1999;435:111–119.[公共医学][谷歌学者] 40Masutai C、Kusumoto R、Iwai S、Hanaoka F。EMBO J。2000;19:3100–3109. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Haracska L、Washington M T、Prakash S、Praka L。生物化学杂志。2001;276:6861–6866.[公共医学][谷歌学者] 42Masutai C、Araki M、Yamada A、Kusumoto R、Nogimori T、Maekawa T、Iwai S、Hanaoka F。EMBO J。1999;18:3491–3501. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Nelson J R、Lawrence C W、Hinkle D C。科学。1996;272：1646年至1649年。[公共医学][谷歌学者] 44Srivastava D K、Husain I、Arteaga C L、Wilson S H。致癌。1999;20:1049–1054.[公共医学][谷歌学者] 45林达尔·T。自然（伦敦）1993;362:709–715.[公共医学][谷歌学者] 46勒布·L·A、普雷斯顿·B·D。年度版次Genet。1986年；20:201–230.[公共医学][谷歌学者] 48Gentil A、Cabral-Neto J B、Mariage-Samson R、Margot A、Imbach J L、Rayner B、Sarasin A。分子生物学杂志。1992;227:981–984.[公共医学][谷歌学者] 49Cabral Neto J B、Cabral R E、Margot A、Le Page F、Sarasin A、Gentil A。分子生物学杂志。1994;240:416–420.[公共医学][谷歌学者] 50Kunkel TA、Schaaper R M、Loeb L A。生物化学。1983;22:2378–2384.[公共医学][谷歌学者] 51Efrati E、Tocco G、Eritja R、Wilson S H、Goodman M F。生物化学杂志。1997;272:2559–2569.[公共医学][谷歌学者] 52Mozzherin D J、Shibutani S、Tan C K、Downey K M、Fisher P A。美国国家科学院程序。1997;94:6126–6131. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53Daube S S、Arad G、Livneh Z。生物化学。2000;39:397–405.[公共医学][谷歌学者] 54Daube S S、Tomer G、Livneh Z。生物化学。2000;39:348–355.[公共医学][谷歌学者] 55Johnson R E、Washington M T、Haracska L、Prakash S、Praka L。自然（伦敦）2000;406:1015–1019.[公共医学][谷歌学者] 56Haracska L、Unk I、Johnson R E、Johansson E、Burgers P M、Prakash S、Praka L。基因发育。2001;15:945–954. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
