胸腺生成和体内平衡驱动的不同贡献增殖对原始和记忆T细胞的重建隔间

收养转让。

淋巴结细胞（3-4×10⁶)来自2C/RAG将小鼠静脉注射到RAG中^−/−,辐照RAG^−/−，辐照B6，以及辐照和胸腺切除B6受体。CD8（CD8）⁺CD44型^−/低2C细胞通过细胞分选和变速箱控制⁻CD11c公司⁻CD11b型⁻首先通过消耗淋巴结细胞来纯化淋巴结细胞CD11c公司⁺和CD11b⁺单元格依据使用磁珠（Miltenyi Biotech，加利福尼亚州奥本），然后使用FACSTCR排序⁻细胞（>98%）。CD8（CD8）⁺CD44型^−/lo(2 ×10⁶)和变速箱控制⁻CD11c公司⁻CD11b型⁻(1 × 10⁶)细胞被转移。

抗体、细胞内染色和流式细胞术。

CD8、CD44、IL-2Rβ、Ly-6C和IFN-γ抗体结合到荧光颜料来自PharMinen。1B2抗体（针对2C TCR）与生物素偶联。脾脏和淋巴结细胞首先用未结合的抗FcR抗体封闭，在PBS中染色含0.5%BSA和0.1%NaN_三，然后在FACScaliber上进行分析，收集10000–1000000个活细胞（PI⁻)每个样品。检测细胞内IFN-γ刺激细胞在体外带PMA（25纳克/毫升）和离子霉素（500纳克/毫克）在37°C下放置4小时。两小时收获前，培养基中添加了brefeldin A。收获的细胞在固定前进行2C TCR、CD8和CD44的表面染色并进行IFN-γ染色。BrdUrd脉冲的脾脏和淋巴结细胞对小鼠进行2C TCR和CD8或CD44的表面染色，然后固定并用抗BrdUrd抗体（PharMinen）染色。

扩散分析。

为了评估增殖情况，2C/RAG小鼠的淋巴结细胞用羧基荧光素二乙酸丁二酰酯（CFSE）标记然后转移到不同的接收人。扩散淋巴结和脾脏中转移的T细胞在转移后第5天和第14天。或者，给小鼠注射一次腹腔注射5溴-2′-脱氧尿苷（BrdUrd，每只小鼠1毫克），然后喂食含BrdUrd的水（0.8 mg/ml）3或7天指示的时间点。

记忆表型2C细胞在RAG1号机组^−/−和辐照的B6宿主。

为了测定持续性T细胞的细胞增殖率，2C用CFSE标记细胞并转移到RAG公司^−/−和辐照B6受体5和14天。2C细胞在两种宿主中的增殖速度相似转移后14天内（图。​（图22A类). 测量单元格在移植后的后期增殖，受者受到刺激BrdUrd作用3天，2C细胞的百分比对合并的BrdUrd进行分析。与CFSE概况一致，≈35%的2C细胞掺入BrdUrdRAG公司^−/−和辐照B6宿主（图。​（图22B类). 然而，从第30天到第120天BrdUrd阳性2C细胞显著减少，表明减少在两种宿主的2C细胞增殖中。第60天和第120天，≈12%RAG中2C细胞BrdUrd-阳性^−/−而在照射过的B6宿主中只有≈3%呈阳性。

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图2

转移后不同时间点2C细胞的增殖进入RAG^−/−和辐照B6受体。(A类)2C/RAG小鼠CFSE标记的淋巴结细胞转入RAG^−/−并照射B6收件人。收集受体淋巴结细胞5和转移后14天，检测2C TCR、CD8和CFSE。CFSE公司CD8的配置文件⁺显示2C电池。(B类)将来自2C/RAG小鼠的淋巴结细胞过继性转移至RAG公司^−/−(左侧)和辐照B6受体(赖特). 给小鼠服用BrdUrd 3天。淋巴池检测单个受体的淋巴结和脾细胞使用抗BrdUrd抗体（粗体线）或同种型对照（阴影区域）。显示的BrdUrd强度为CD8（CD8）⁺1B2类⁺，CD44^你好1B2类⁺,或CD44^−/lo1B2类⁺第14、30、60天的2C细胞，从一个代表收款人处转账后120。分析每组每个时间点用三只小鼠做两次。数字表示所有人BrdUrd-阳性细胞百分比的平均值六只小鼠±SD.*，P（P）学生T测试的价值为0.58。(C类)与中的相同B类，除在转移的第60天之前，给小鼠服用BrdUrd 7天。*,P（P）学生T测试值为0.26。

乍一看，BrdUrd-阳性2C细胞百分比的差异移植后30天或更长时间表明2C细胞增殖较慢辐照B6中的含量比RAG中的含量高^−/−主机。然而，这种比较是有缺陷的，因为已知记忆细胞会增殖比原始细胞更快(5,18–20)，并在之后30天或更长时间内转移所有2C细胞显示记忆表型RAG公司^−/−主机，而大多数持续2C在受辐射的B6小鼠中，细胞具有幼稚表型。为了克服这一点问题是，在2C细胞中检测BrdUrd掺入CD44细胞^−/lo（天真）和CD44细胞^你好（记忆）分数转移到受照射的B6受体。如图所示。​图22B类，BrdUrd-阳性2C细胞在CD44细胞^你好记忆分数≈12%，在相同范围的BrdUrd阳性2C细胞RAG公司^−/−主机。当小鼠被给予BrdUrd 7次时天，≈31%的2C细胞将BrdUrd纳入RAG公司^−/−鼠标（图。​（图22C类)，类似于报告的级别(13). 尽管仅约占2C细胞总数的9%在辐照B6宿主中加入BrdUrd，≈29%CD44细胞^你好记忆2C细胞呈BrdUrd阳性，与31%无统计学差异(P（P）=0.26).

这些数据表明(我)存储器的2C单元两者的表型增殖率相似RAG公司^−/−以及辐照过的B6宿主和(ii（ii）)原始表型的2C细胞大多不分裂在转移后30天或更长时间内，在辐照的B6宿主体内。

胸腺和辐射对供体来源的幼稚T细胞。

研究胸腺在我们在3周前对B6小鼠进行了胸腺切除2C细胞的照射和转移。从转移后的第14天到第120天，照射和切除胸腺后2C细胞比例的增加（Id/Tx）B6小鼠表达高水平的CD44、IL-2Rβ和Ly-6C（图。​（图3三和数据未显示）。到第120天，几乎所有持续存在的2C细胞的CD44都一致高与照射B6受体中持续存在的2C细胞相比完整的胸腺。因为Id/Tx B6小鼠有残留内源性B和T细胞，但在胸腺，这些结果表明胸腺，不存在BT细胞（包括调节性T细胞）对辐照B6受体中原始2C细胞的积累。

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图3

转染后不同时间点2C细胞表型各种收件人。来自2C/RAG的汇集淋巴结和脾细胞将小鼠转移到未照射的RAG中^−/−,辐照B6，未辐照TCRβδ^−/−，已辐照RAG公司^−/−和Id/Tx B6收件人。淋巴结细胞来自在第14天对不同受体进行2C TCR、CD8和CD44分析，转移后30、60和120。每次分析三名受试者每组得分。CD8上的CD44表达⁺显示2C电池代表收件人。

确定辐射在给药或衍生的原始T细胞，我们将2C细胞转入亚致死状态辐照RAG^−/−老鼠。14天后转移，因为许多2C细胞的CD44、IL-2Rβ和Ly-6C含量较高（图。​（图3三和数据未显示），如辐照B6和Id/Tx B6收件人。然而，随着时间的推移，2C的比例越来越大细胞CD44、IL-2Rβ和Ly-6C水平降低或阴性，达到≈60%，120天。因此，辐照也促进了RAG中供体或衍生的原始T细胞^−/−收件人。

我们还量化了恢复的幼稚和记忆2C细胞的数量不同时间不同受体的脾脏和淋巴结转移后的分数。尽管CD44细胞^你好记忆2C细胞在不同类型的接收人在转账后14天和30天第60天和第120天的数量相似（1–2×10⁶; 见表1A类，这是作为支持信息发布在PNAS网站上，网址：www.pnas.org). 正如所料CD44型^−/lo原始2C细胞在RAG公司^−/−，TCRβδ^−/−,分析了所有时间点的Id/Tx B6受体，但增加了在辐照RAG中随时间缓慢变化^−/−鼠标（请参见表1B类). 在辐照B6受体中CD44细胞^−/lo原始2C细胞从第14-120天，总计≈10×10⁶每收件人。同样亚致死剂量照射后第14天到第30天的宿主T细胞B6小鼠（见表1C类). 与内存2C单元一样CD44的^你好宿主来源的记忆CD8 T细胞是照射30天后也相对稳定。

受照小鼠胸腺供体源性T细胞的发育收件人。

胸腺和辐射都是辐射受者体内的供体或衍生的原始T细胞表明这些细胞是胸腺中新生成的。要对此进行检查我们分析了不同受体胸腺中的T细胞细胞移植后30天和60天。在未经辐射的胸腺中RAG公司^−/−受体中只有0.5%的细胞是2C电池（图。​（图44A类左侧). 这些2C细胞为CD8单阳性（SP），CD44细胞^你好和HSA^洛，并且做到了在为期3天的标签中没有加入太多的BrdUrd（图。​（图44B类)表明它们是循环的记忆2C细胞通过胸腺。

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图4

从头开始辐照小鼠胸腺中2C细胞的发育RAG公司^−/−和B6接收人。(A类0六十天转移2C/RAG小鼠的淋巴结细胞后RAG公司^−/−(左侧)和辐照B6(赖特)对受体进行2C TCR、CD4和CD8(上部)全胸腺细胞表达2C-TCR；(下部)通过1B2表达CD4和CD8⁺或1B2类⁻胸腺细胞。1B2⁻胸腺细胞RAG公司^−/−小鼠为CD4⁻CD8（CD8）⁻（不是如图所示）。每组六个收件人中的一个的代表性数据是展示。(B类)胸腺细胞与A类检测2C TCR、CD8、CD4以及CD44、HSA或BrdUrd公司。CD44、HSA和BrdUrd的染色强度1B2类⁺CD8（CD8）⁺CD4细胞⁻显示胸腺细胞。粗体线，反BrdUrd；阴影区，同种型对照。(C类)将原始2C细胞从胸腺输出到辐照B6受体的外围。收养后60天转移，照射B6受体胸腺内注射FITC或PBS。两天后，胸腺细胞和混合淋巴结和对脾细胞进行2C-TCR、CD8和CD44染色。FITC与CD44显示了CD8的配置文件⁺2C电池。(D类和E类)造血干细胞存在于转移淋巴结的人群。总细胞，纯化CD8（CD8）⁺CD44细胞^−/lo2C细胞（>98%），或纯化变速箱控制⁻CD11b型⁻CD11c公司⁻细胞（>98%）从2C/RAG小鼠的淋巴结转移到照射过的B6小鼠。30天后，收集淋巴结和脾细胞对单个受体进行2C TCR、CD8和CD44染色IL-2Rβ。所示数据来自每四位收件人中的一位代表组。数字表示CD8的平均百分比⁺2C细胞±SD(D类)显示存在的点位CD8的⁺外围2C细胞。(E类)CD44，IL-2Rβ和细胞内IFN-γ的表达1B2类⁺CD8（CD8）⁺2C电池。粗线条，抗干扰素-γ；阴影区，同型控制。

相反，在受辐射的B6受体的胸腺中，31%的T细胞来源于供体（图。​（图44A类赖特). 主机衍生（1B2⁻)胸腺细胞，88%CD4细胞⁺CD8（CD8）⁺，8%是CD4细胞⁺，3%为CD8⁺.在捐赠者衍生（1B2⁺)胸腺细胞，约59%为CD8⁺值得注意的是，35%是CD4⁺CD8（CD8）⁺。它也是值得注意的是，与CD8不同⁺胸腺中的2C细胞未辐照RAG的^−/−收件人CD8（CD8）⁺辐照B6胸腺中的2C细胞受体为CD44^洛和HSA公司^你好和大部分细胞在3天的标记期内加入BrdUrd（图。​（图44B类). 因此，CD8⁺2C电池B6受照者的胸腺具有特征性特征发育不成熟的胸腺细胞。

确定胸腺中新生成的原始2C细胞受照射的B6宿主中有一半被输出到外周淋巴器官，FITC注射到受照射B6受体的胸腺中60天转让后。48小时后，约80%的2C胸腺细胞受试者被FITC标记（图。​（图44C类)和中的淋巴结和脾脏约0.4%的2C细胞为FITC-阳性。这些外周FITC-阳性2C细胞CD44细胞^−/lo，正如对原始单元格的预期。

总之，这些结果表明原始2C T细胞持续存在在受照射的B6受体的胸腺中产生移民是捐赠者来源的幼稚逐渐积累的原因外周T细胞。类似的事件也会发生，尽管较小程度，RAG^−/−收件人，如果他们已被辐照。

移植人群中存在造血干细胞。

在我们的研究和其他人以前的研究中，总淋巴结TCR转基因小鼠的细胞和偶尔的总脾细胞RAG公司^−/−背景被用作源供体T细胞的数量。从头开始供体来源T的分化受照者胸腺中的细胞暗示造血功能干细胞存在于转移的细胞群中。收件人地址这个问题，细胞总数，纯化CD8（CD8）⁺CD44细胞^−/lo2C电池，或净化的变速箱控制⁻CD11c公司⁻CD11b型⁻（1B2）⁻)2C/RAG小鼠淋巴结细胞转移到受照射的B6受体。三十天后净化后的转移CD8（CD8）⁺CD44细胞^−/lo2C电池大部分CD8⁺周围2C细胞辐照B6宿主表达特征记忆T细胞标记和功能（图。​（图44 D类和E类). 引人注目的是，CD8（CD8）⁺2C T细胞也在给予纯化的B6受照者的外围1B2类⁻淋巴结细胞（TCR）⁻CD11c细胞⁻CD11b型⁻,图。​图44D类)表明造血干细胞转移。此外，这些受体中产生的2C细胞表达幼稚表型CD44细胞^−/loIL-2Rβ^洛赖氨酸-6C^洛,刺激4h后未产生IFN-γ（图。​（图44E类),表明它们在胸腺中是新分化的收件人。

为了进一步证实造血干细胞在转移的细胞群，来自未辐照的骨髓细胞RAG公司^−/−、辐照B6和Id/Tx B6接受过总淋巴结移植的受体（主要受体）120天前，来自2C/RAG供体细胞的2C TCR被耗尽2CTCR细胞，然后转移到致命照射的B6宿主（第二收件人）。二次转移后四周，2C T仅在第二受体的外围检测到细胞如果他们接受了来自辐照B6和Id/Tx B6主要接受者，但如果他们收到此类细胞，则不会来自未辐照RAG^−/−收件人（数据不如图所示）。这些结果表明骨髓的再生转移的干细胞发生在受照射但不发生在未受照射的情况下接受者；因此，积累需要辐照在B6和RAG公司^−/−收件人。

供体源性幼稚T细胞的积累判定元件诺沃胸腺中的T细胞发育。

什么是导致观察到的RAG中的供体T细胞^−/−和辐照B6收件人？我们的研究表明，幼稚的积累供体T细胞取决于三个条件：第一，存在胸腺完整至关重要；没有供体来源的原始T细胞如果B6小鼠胸腺切除，则在照射后的B6小鼠中产生（图。​（图3）。三). 大量CD4细胞⁺CD8（CD8）⁺而且还不成熟CD8（CD8）⁺发现表达2C TCR的胸腺细胞在受照B6受体的胸腺中（图。​（图4）。4). 第二，辐照需要个收件人（共个）。幼稚的2C细胞在经辐照但未经辐照的RAG^−/−收件人（图。​（图3）。三). 因此，RAG^−/−主机，如果受到辐射，表现得像B6宿主。第三，幼稚2C的积累受照B6受体的细胞也需要转移总淋巴结细胞或纯化的细胞亚群（TCR⁻CD11c公司⁻CD11b型⁻;1B2类⁻)含有干细胞（图。​（图4）。4). 换乘高度纯化的CD8（CD8）⁺CD44细胞^洛2C电池，英寸哪些干细胞可能被移除，但没有导致辐照B6受体中原始2C细胞的积累。一直以来，未观察到原始供体T细胞积聚150将纯化的P14 T细胞转移到亚致死剂量照射后的第天B6接收人(14).

据估计，多达10⁵成人血液中每天都有造血干细胞循环鼠标(24). 我们的研究结果表明，干细胞确实可以重新填充受体骨髓，因为原始2C细胞是在二级B6受体在接受2C后受到致命辐射（1B2）⁺)-耗尽的骨髓细胞来自初级照射B6受体，但当他们接受类似照射时未经辐照的骨髓细胞RAG公司^−/−收件人。DP和未成熟2C细胞直到2周才在照射B6小鼠的胸腺中检测到在他们接受淋巴结细胞后。相应地，外观周围的原始2C细胞在3岁左右开始变得明显首次移交后数周，按照将骨髓干细胞转移到致命辐照宿主(25).

总之，这些发现清楚地说明了donor-derived naive T受照受者体内细胞在转移后累积脾或淋巴结细胞：接种物中存在干细胞重新填充受照者的骨髓并产生进一步分化为胸腺中的单阳性（SP）T细胞。新出口胸腺分化的T细胞导致在外周积聚供体或衍生的原始T细胞。

稳态记忆T细胞不能恢复纯真表型。

我们发现从头开始T细胞分化转移的干细胞导致干细胞或干细胞衍生物的积累辐照B6受体中的原始T细胞强烈表明稳态记忆T细胞不会恢复到原始表型。此视图其他几项研究结果进一步支持了这一观点。首先稳态记忆2C T细胞在RAG公司^−/−和Id/Tx B6接收人（图。​（图3）。同样，三).同样，来源于纯化的原始供体细胞（93%），其中干细胞可能来自消除在辐照B6中稳定维持150天收件人(14). 第二，稳态记忆2C细胞在两种RAG中的比率相似^−/−和辐照B6收件人（图。​（图2），2)，表明donor衍生的积累辐照B6宿主中的原始T细胞RAG公司^−/−主机不能是由于稳态记忆细胞增殖。最后，如果表型逆转发生时，RAG中存在2C细胞^−/−受试者接受了2周的治疗，并且正在获取记忆当再转移到未经照射的B6小鼠中。相反再次转染的2C细胞表现出与抗原刺激的2C细胞（图。​（图5），5)表明体内平衡原始CD8 T细胞的增殖触发了一个不可逆转的程序记忆T细胞分化，就像抗原刺激记忆一样细胞分化(26).

我们感谢Wojciech Swat医生进行胸腺切除术；塔拉·希姆特技术援助；格伦·帕拉迪斯细胞分类；David博士Kranz对2C/RAG小鼠的作用；Ananda Goldrath博士和Luk Van Parijs讨论和审查手稿；以及陈和艾森实验室进行有益的讨论。这项工作得到了部分由美国国立卫生研究院拨款AI44478和AI50631（至J.C.），以及AI44477和CA60686（至H.N.E.）；和癌症中心核心格兰特（对理查德·海恩斯说）。Q.G.部分由Anna Fuller支持博士后奖学金。