当肿瘤细胞进入血流，与宿主血细胞相互作用，最终定植于远处组织时，就会发生血源性转移。许多证据表明，血液传播的肿瘤细胞与血小板和白细胞相互作用，形成微栓子，促进其在血管系统中的阻滞(1–4). 虽然血小板在转移中的作用已在一些实验中得到证实(1,2,5–10)白细胞参与肿瘤微栓塞的机制和意义尚不清楚。
细胞表面糖基化改变是肿瘤细胞的一个显著特征(11–15). 特别是唾液酸化岩藻糖基聚糖如唾液酸化Lewis的表达x/年与肿瘤进展和高转移率导致的不良预后相关（例如，见参考文献。16–18). 选择素是识别特定唾液酸路易斯的血管细胞粘附分子x/年正常白细胞和内皮细胞携带粘蛋白型糖蛋白(11,19–23). 携带唾液酸Lewis的癌细胞表面分子x/年也可以被所有三个选择素识别(11–15,17,24–27)，介导肿瘤细胞与血小板、白细胞和内皮细胞的相互作用在体外(10,25,27,28). 根据这些数据体内已经提出E-和P-选择素在转移扩散中的作用。活化内皮上的E-选择素可能促进癌细胞种植的假说(14,29)E-选择素在小鼠肝脏中的转基因过表达支持了这一观点，从而将转移转移到该器官(30)以及通过转染岩藻糖基转移酶提高唾液酸化岩藻糖聚糖肿瘤细胞表达的系统(31). 表达E-选择素配体的癌细胞株在细胞因子预处理的小鼠中也显示出更强的转移能力(32). 然而，E-选择素并没有组成性表达体内但必须被某些刺激物转录激活。我们之前已经证明血小板主要通过P-选择素粘附在一些人类癌细胞上，并且抑制这种相互作用会导致转移减弱体内(7,9). 此外，血小板与肿瘤细胞的粘附在物理上干扰了白细胞进入肿瘤细胞，这表明可能存在屏蔽作用(8,9).
L-选择素在所有中性粒细胞和单核细胞以及血源性T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞亚群上组成性表达(19,22,23,33,34)众所周知，促进白细胞沿着血管壁滚动是细胞对炎症刺激或组织损伤最早的反应之一(19,22,23,35,36). L-选择素也是正常淋巴细胞有效再循环进入淋巴结所必需的。自发性小鼠肿瘤模型中L-选择素的转基因异位表达促进淋巴结转移(37). 然而，B细胞淋巴瘤细胞系上天然存在的L-选择素与淋巴结转移增强无关(38). 无论如何，与P-和E-选择素相比，还没有文献证明正常白细胞L-选择素在促进腺癌转移中的作用。
大多数生理性L-选择素和P-选择素配体是粘蛋白上的唾液酸化岩藻糖基聚糖，需要对酪氨酸残基或乳糖胺单元进行硫酸化(20–22). L-选择素和P-选择素也能与硫酸盐结合（3-O-硫酸化半乳糖神经酰胺；参考文献。39–43). 糖胺聚糖肝素，临床上用作抗凝剂，已知可抑制肿瘤生长和转移(44–48). 肝素也是P-和L-选择素的有效抑制剂(49,50). 事实上，肿瘤细胞前注射一次肝素可显著减少转移，至少部分是通过抑制P-选择素介导的血小板与肿瘤细胞的相互作用(9). 在这里，我们暗示L-选择素促进转移，表明它与P-选择素具有协同作用，并探讨肝素对这两种选择素贡献的相对影响。
材料和方法
免疫缺陷小鼠模型。
抹布2−/−免疫缺陷小鼠129S6系列遗传背景（129S6/SvEvTac-拉格牌手表2原肌球蛋白1)来自塔科尼农场。L-选择素缺乏小鼠（以下简称L−/−)在中B6129S型背景（B6；129S-出售tm1Hyn公司)最初由我们其中一人（R.O.H.）存放在杰克逊实验室。L-选择素：Rag2双零小鼠和Rag2−/−窝友控制（L+/+)Rag2突变体的PCR基因分型如前所述(7); 用L-sel-729 GGGAGCCCAACAGAAG和L-sel-730 ACACTGACACATCGACTGACTG引物对L-sel野生型（wt）等位基因进行PCR筛选；用引物L-sel-730和NeoB CACGAGACTAGTGACGTG在59℃退火条件下进行PCR反应，筛选L-sel突变等位基因。8周龄小鼠静脉注射3–4×105LS180人肿瘤细胞。6周后，通过组织学和PCR扩增人类Alu序列检测到肺转移，与之前描述的完全一样(7,9). 简而言之，扩增的Alu序列被印迹，用与一致的Alu顺序相对应的寡核苷酸进行探测（与原始PCR引物不重叠），并用荧光成像仪（分子动力学）进行量化。
MC-38细胞的流式细胞术分析。
小鼠结肠腺癌细胞系MC-38是马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所J.Schlom赠送的一种礼物。将小鼠选择素（P-、L-和E-）嵌合到人类IgG的Fc区（J.B.Lowe赠送的礼物），用于探测肿瘤细胞的选择素配体。在37°C下用含有2 mM EDTA的PBS培养5分钟，然后用Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤三次，然后用0.5%的BSA封闭HBSS中的非特异性位点，从而将细胞从平板上分离出来。将小鼠选择素嵌合物与羊抗人IgG抗体与PE结合，在室温（rt）下预孵育1小时，然后将混合物与肿瘤细胞孵育。在4°C下培养2小时后，用HBSS/BSA和HBSS清洗细胞，然后用2%（wt/vol）多聚甲醛在HBSS中固定。再次用HBSS冲洗细胞，并将其重新悬浮在HBSS/BSA中进行流式细胞术。对照组在5 mM EDTA（钙螯合）的存在下染色，在P-选择素的情况下，也使用30 mM EDTA染色(49). 在某些情况下，在探测选择素配体之前对肿瘤细胞表面进行预处理。通过使用O（运行）-唾液糖苷酶（雪松实验室）在37°C的HBSS中放置1小时，偶尔混合。唾液酸的去除是通过使用节杆菌唾液酸酶（Sigma）在37°C的Hepes缓冲液（pH 6.9）中放置1小时。在37°C的HBSS缓冲液中用乙酰肝素酶II和软骨素酶ABC（Sigma）的混合物处理1 h，去除糖胺聚糖。
MC-38细胞脂质的ELISA分析。
电池（2×108)在EDTA存在下通过胰蛋白酶处理分离，并用PBS洗涤三次。细胞颗粒在氯仿：甲醇混合物1:1中再次悬浮，并超声三次，持续1分钟。不溶性蛋白质在4°C下经过两轮离心分离得到。将含有油脂的上清液干燥并储存在4°C下。用于脂质ELISA(51)，将提取物重悬于甲醇中，并将20μl涂布到ELISA板的孔上（Nunc，目录号269620）。作为对照，使用200 ng牛磺胺嘧啶（Matreya，Pleasant Gap，PA）。蒸发和脂肪吸收后，在37°C的pH值为5.0的醋酸盐缓冲液中，用来自Limpets的5单位V型芳基硫酸酯酶（Sigma，目录号S8629）处理一些微孔90分钟，偶尔摇晃。用HBSS/0.5%BSA封闭平板30分钟。小鼠选择素嵌合物与次级山羊抗人IgG抗体结合碱性磷酸酶（Bio-Rad）在rt时预孵育1小时。在rt时，将预孵的选择素添加到平板中，并在没有或存在5 mM EDTA的情况下孵育2小时，然后用HBSS清洗三次。最后一次清洗后，第页-添加硝基苯磷酸盐液体底物（Sigma）并在rt下孵育5min，在405nm处测量吸光度。
MC-38-绿色荧光蛋白（GFP）细胞的制备。
按照制造商的说明，使用脂质体转染线性化pEGFP-N1（CLONTECH）的MC-38小鼠结肠腺癌细胞，然后使用G418（1 mg/ml）进行筛选。细胞进行了两轮GFP荧光批量分选（每轮1000个细胞），然后对10个细胞/池进行最终分选。扩大了几个10细胞池，并分析了GFP荧光和选择素配体的存在（数据未显示）。一个具有高GFP荧光且选择素配体水平不变的池（设计为A2）用于所有后续实验。
同基因小鼠的实验性转移。
P-选择素缺乏小鼠（P−/−)在C57BL6背景和对照组中，从Jackson实验室获得C57BL 6小鼠。L-选择素缺乏小鼠（L−/−)从杰克逊实验室回交到C57BL6背景中至少7代。PL选择素双重缺陷（PL−/−)老鼠(52)也被回交到C57BL6背景中至少7代。来自同一回交的选择wt窝友作为对照进行L−/−和PL−/−老鼠。静脉注射3×10周龄小鼠5MC-38-GFP肿瘤细胞经尾静脉。在肿瘤细胞注射前10分钟，一些小鼠还注射了100单位的肝素[来自伊利诺伊州迪尔菲尔德Fujisawa的肝素钠20000USP单位/ml（批号382173）]或PBS。22天后，用美托芬麻醉小鼠并灌注PBS。拍摄解剖的肺部照片，并通过GFP荧光检测对肺部进行进一步处理以定量转移。使用Polytron（Brinkhan）将灌流的肺在2 ml低渗缓冲液（20 mM Tris●Cl，pH 7.0）中均质化。将Triton X-100添加到0.5%的最终浓度。在冰上放置30分钟后，不溶性碎片被旋转下来（10000×克10μl上清液用Tris●Cl缓冲液（20 mM，pH 7.0）稀释至最终体积100μl，并转移至石英ELISA板。荧光在Cytofluor II微板阅读器上读取，Ex=485，Em=508。在未注射GFP标记细胞的小鼠肺部上测定减法的背景水平。
结果
L-选择素缺乏可减轻转移。
我们首先研究了免疫缺陷（Rag2）患者肿瘤细胞的实验性转移−/−)L-选择素缺乏（L−/−)小鼠，我们之前用于研究P-选择素缺乏症的方法(7,9). 先前显示表达功能性L-选择素配体的人类结肠腺癌LS180细胞（美国型培养收集，CL187）(25,27)6周后对小鼠进行静脉注射。尽管在对照小鼠中在组织学上观察到转移灶（L+/+)，在L中未检测到−/−小鼠（数据未显示）。为了更敏感和准确地量化转移，我们使用了人类特异性PCR扩增铝从每个解剖肺的剩余一半中分离出的基因组DNA序列(7,53). 图。显示了两个独立实验的组合，显示L−/−老鼠。在10 L中的6 L中观察到了检测级别的信号−/−老鼠。相反，所有对照小鼠（L+/+)有可测量的转移水平。因为Rag2−/−小鼠缺乏T和B淋巴细胞，这些结果表明，内源性中性粒细胞、单核细胞或NK细胞表达的L-选择素在促进该系统转移中起着重要作用。
L-选择素缺乏可减轻免疫缺陷小鼠体内人类腺癌细胞的转移。小鼠静脉注射3–4×105LS180细胞，6周后进行研究。对从解剖肺中分离的基因组DNA进行人特异性Alu-PCR，并按材料和方法。每组研究的动物数量为9-10只。统计显著性由学生的t吨测试。
小鼠结肠腺癌细胞系MC-38表达L-和P-选择素配体。
我们之前曾报道过P的转移减弱−/−使用上述异种系统的小鼠(7,9). 为了排除我们的结果是所用系统的伪影的可能性，并进一步研究L-选择素和P-选择素在转移中的作用，我们接下来建立了一个同基因免疫活性小鼠模型系统。小鼠结肠腺癌细胞系MC-38，与C57BL6小鼠株同基因(54)，用于L−/−或P−/−C57BL6背景中的小鼠。此外，肿瘤细胞被标记为增强的GFP，便于检测和量化转移。首先，我们评估这些细胞是否表达选择素配体，是否适合我们的研究。使用重组小鼠选择素探针通过流式细胞术分析细胞表面。如图所示。 A类–C类P-和L-选择素探针与MC-38细胞结合，但未检测到E-选择素结合。L-选择素结合是钙依赖性的（被EDTA阻断），而P-选择素结合仅被部分抑制，即使EDTA浓度较高。这是P-选择素与一些硫酸化配体的典型相互作用(49).
用流式细胞术鉴定MC-38小鼠腺癌细胞上的选择素配体。用重组小鼠选择素探测MC-38细胞，并用流式细胞术进行研究，如材料和方法。灰色区域表示仅带有次要Ab的控制配置文件。(A类--C类)粗体实线表示选择素染色细胞（选择素如图所示）；虚线表示存在5 mM EDTA时的选择素染色，细线表示存在30 mM EDTA时的选择蛋白染色。(天)术后细胞的L-和P-选择素染色哦-唾液糖苷酶处理如图所示。(E类和F类)粗体实线表示选择素染色细胞（选择素如图所示）；虚线表示肝素酶加软骨素酶处理后的选择素染色细胞，细实线表示唾液酸酶处理后选择素染色的细胞。
一些肿瘤细胞选择素配体不是粘液。
因为我们之前报道的肿瘤相关选择素配体是携带唾液酸化、岩藻糖基化表位的粘蛋白(27)，我们通过用O（运行）-唾液糖苷酶，一种专门分解唾液酸化粘蛋白的酶（图。天). 这种处理部分减少了L-选择素与细胞的结合，但P-选择素结合未受影响。唾液酸酶去除唾液酸降低了L-选择素的结合，但对P-选择素结合没有影响（图。E类). 唾液酸酶和O（运行）-唾液糖苷酶处理表明，L-选择素结合位点至少部分由唾液酸化粘蛋白呈现。由于P-选择素似乎没有粘蛋白型配体，我们检查了其他潜在的P-选择蛋白配体，如糖胺聚糖（例如硫酸乙酰肝素；参考文献。49和50)和硫酸盐（3-硫酸半乳糖神经酰胺；参考文献。39–41). 用糖胺聚糖剥离酶肝素酶和软骨素酶的混合物处理，P选择素结合没有减少。相反，L-选择素结合明显减少（图。 E类–F类). 为了检测是否存在硫酸酯，提取糖脂并通过ELISA检测选择素配体活性。如图所示。A类，P-选择素-Fc以EDTA依赖性的方式与肿瘤脂质部分强烈结合，表明糖脂配体是P-选择素结合的功能位点。牛磺胺嘧啶作为阳性对照。与之前的观察结果一致，E-选择素与硫苷的结合较差，肿瘤脂质提取物也是如此(41). 为了进一步检查脂质选择素配体是一种硫酸酯的可能性，我们使用芳基硫酸酯酶处理去除硫酸基（图。B类). 这将P-和L-选择素的结合减少了30%，而牛磺胺嘧啶的结合减少45%。在4°C下使用该酶的对照对选择素结合没有影响。即使在磺胺类药物控制中，也无法完全去除P-选择素结合，可能是因为酶对包衣ELISA板的作用有限。因此，与MC-38脂质提取物结合的部分减少表明，大多数或全部P-选择素配体活性由硫酸化糖脂组成，可能是硫酸酯。L-选择素-Fc也与肿瘤脂质提取物结合，这与之前的知识一致，即硫苷也可被L-选择素识别(42,55). 额外的硫酸化糖脂配体的存在也解释了以下两种方法都不能完全去除L-选择素配体O（运行）-唾液糖酶或肝素软骨素酶。总之，MC-38细胞上的P-选择素配体主要或全部由硫酸化糖脂（可能是硫酸酯类）组成，而L-选择素配体则由粘蛋白、糖胺聚糖和硫酸化糖脂类的混合物组成。
MC-38小鼠腺癌细胞脂质提取物中选择素配体的特征。将MC-38细胞和对照牛硫苷的总脂提取物涂布在ELISA板上，并用选择素进行检测，如材料和方法. (A类)选择素在无（黑条）或有（白条）5 mM EDTA的情况下培养。所示数据为三份的平均值±SD(B类)添加P-和L-选择素之前，用芳基硫酸酯酶处理脂质包衣ELISA，如材料和方法用牛硫酸盐化物包被的孔用作阳性对照。实心条仅代表selectin；白色条表示在37℃芳基硫酸酯酶处理后的选择素结合，灰色条表示在4℃芳基磺酸酯酶处理之后的选择素连接。给出了三个代表性实验之一的数据。
L-和P-选择素缺乏可减轻MC-38细胞的转移。
我们将GFP标记的MC-38细胞静脉注射到L−/−和P−/−或wt C57BL小鼠，22天后处死，并分析转移程度。对解剖的肺部进行拍照（图。A类)通过测定肺匀浆中的GFP荧光定量转移。图。给出了两个独立实验的数据。对照组wt小鼠的肺部几乎完全被转移所取代（图。A类)，并获得相应的高荧光测量值（图。B类). 观察到L显著减少−/−小鼠，以及P−/−老鼠。后者与我们之前发表的结果一致，显示血小板P-选择素参与转移进展(7,9). 这些数据也表明肿瘤细胞上的非粘蛋白P-选择素配体在转移中起作用。组织学评估显示，在P-选择素缺乏的情况下，肿瘤细胞血小板聚集体减少，但在L-选择素缺乏的情况下没有（数据未显示）。
选择素缺乏对MC-38小鼠腺癌细胞转移进程的影响。小鼠静脉注射2–3×10522天后检测MC-38-GFP细胞。对肺部进行解剖、拍照和均质，并对匀浆进行稀释以获得荧光读数。(A类)每种小鼠基因型的肺解剖示例。(B类)通过GFP荧光定量转移。所有小鼠均为同基因C57BL6背景。研究的动物数量为每组6至8只。通过Bonferonni多重比较试验确定统计显著性。
L-和P-选择素协同作用。
为了确定P-和L-选择素的作用是否独立，我们还注射了PL−/−MC-38-GFP标记细胞的小鼠。联合缺乏进一步减弱了转移扩散，只观察到少数转移灶（图。A类). 对转移扩散的定量得出了8个测量值中的5个，仅在检测水平上，即3只小鼠没有检测到转移（图。B类). PL的转移显著减少−/−与在P−/−老鼠(P（P）<0.05）或L−/−老鼠(P（P）< 0.05). 因此，P-和L-选择素具有协同作用，它们的联合缺乏显著减少了这种侵袭性肿瘤的转移，这种肿瘤实际上取代了wt小鼠的肺部。
单剂量肝素主要通过P-选择素抑制来减轻转移。
我们之前的研究表明，单次100单位剂量的普通肝素（在小鼠循环中在1-2小时达到峰值，在6-8小时内完全消失）可以显著减少免疫缺陷小鼠体内人类肿瘤的转移(9). 因为众所周知，肝素是P-和L-选择素的有效抑制剂(49,50)，我们研究了肝素作为L-和P-选择素相互作用的阻滞剂在该同基因系统中的可能作用。将单剂量100单位的肝素注射到wt和选择素缺乏小鼠的尾静脉中，10分钟后注射MC-38-GFP细胞。对照组动物注射生理盐水代替肝素。22天后处死小鼠，并量化转移程度。如图所示。A类，肝素注射液使wt小鼠的转移降低到与P−/−小鼠，无论是否注射肝素。注射肝素的wt小鼠与注射P的wt鼠的转移水平无统计学差异−/−无论后者是否注射肝素。因此，P-选择素缺乏症和肝素可能通过一种共同的机制发挥作用。wt小鼠注射肝素后的组织学评估显示体内血小板-肿瘤细胞聚集物（数据未显示），表明肝素作用机制与我们在异种系统中报道的类似(9). 和以前一样，在PL中检测到极低的转移−/−而肝素无额外作用。相反，L−/−接受肝素治疗的小鼠的转移率进一步降低（图。B类,P（P）< 0.05). 总之，这些数据表明，单剂量肝素的抑制作用是通过L选择素抑制以外的机制发挥作用的，主要是P选择素抑制。因为单剂量的肝素只能阻断选择素相互作用数小时(9)L-selectin在促进转移中的作用可能在转移级联反应的后期起作用。
肝素对选择素缺乏小鼠MC-38细胞转移进程的影响。小鼠在注射2–3×10前10分钟静脉注射100单位肝素或生理盐水5表达GFP的MC-38细胞，22天后进行研究；对肺进行解剖、匀浆和稀释，以通过GFP荧光定量转移。(A类)wt=C57BL6 wt小鼠；P（P）−/−C57BL6背景和PL的小鼠−/−C57BL6背景的小鼠。研究的动物数量为每组5-8只。通过Bonferonni多重比较试验确定统计显著性。(B类)wt=C57BL wt小鼠和L−/−C57BL背景的小鼠。研究的动物数量为每组8-10只。统计显著性由Student’st吨测试。
讨论
众所周知，肿瘤细胞-血小板-白细胞微栓子的形成促进了血源性转移。然而，这些相互作用所涉及的分子机制仍然缺乏了解。血管选择素识别低聚糖结构的发现，如SLex个和SLe一，对肿瘤细胞在体外提示这些内源性凝集素可能与癌细胞相互作用体内鉴于血小板和内皮细胞在转移过程中的预期作用，之前已经研究过E-和P-选择素在转移中的潜在作用。E-选择素的过度表达(30)或E-选择素配体增加(31)导致转移加剧。我们已经证明，P-选择素缺乏可以减轻免疫缺陷小鼠体内人类癌细胞的转移，我们的数据特别表明血小板P-选择蛋白参与了这一过程(7,9,10).
在这里，我们提供了第一个证据，即白细胞内生表达的L-选择素也可以影响体内肿瘤细胞的行为。我们发现，L-选择素缺乏通过一些未知机制减弱转移，这些机制似乎在血小板P-选择素增强转移扩散的时间点之后发挥作用。L-选择素缺乏可通过免疫活性动物减弱免疫缺陷小鼠异种系统和同基因系统的转移。PL的转移进一步减少−/−小鼠，表明P-和L-选择素的协同作用。因此，每个选择素在转移中都有不同的作用。对肺血管中肿瘤细胞的分析显示，L−/−小鼠（数据未显示），这表明L-选择素对血小板与肿瘤细胞的初始粘附不需要。
因为免疫缺陷Rag2−/−所用的小鼠没有成熟的T和B细胞，其他L-选择素表达细胞（中性粒细胞、单核细胞和/或NK细胞亚群）必须参与支持转移扩散。L-选择素在炎症部位中性粒细胞和单核细胞的积聚和激活中起关键作用(22,23,56,57). 滚动中性粒细胞的激活伴随着可溶性L-选择素的脱落，其调节中性粒细胞与内皮细胞相互作用的程度(58–60). L-选择素胞内结构域的部分缺失可在不影响配体识别的情况下阻止白细胞滚动，这意味着L-选择素与其配体的结合不足以使白细胞滚动(61). 除了细胞粘附外，L-选择素也是一种跨膜分子(62,63). 一些报告表明，通过配体结合或交联触发L-选择素可激活Ras通路，诱导呼吸爆发和O2−生成(62,64). 中性粒细胞上L-选择素的交联导致p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，从而影响中性粒细胞的形状变化、整合素活化和分泌颗粒的释放(65). 最近的研究(59)表明，如果内皮细胞上存在其他共刺激因子（如趋化因子），L-选择素介导的信号传导可激活白细胞滚动并促进其停止。基于这些知识，可以设想L-选择素参与转移的某些可能性。由于癌细胞与血小板密切相互作用，这些栓子被困在微血管中，所以携带L-选择素的白细胞与肿瘤细胞的直接相互作用似乎不太可能发生(7–9). 因此，很容易推测，正是L-选择素介导的信号转导，伴随着白细胞的激活，介导了该分子在促进转移中的作用。事实上，中性粒细胞L-选择素的参与可以诱导TNF-α和IL-8的表达增加(55). 也有人提出L-选择素在肿瘤细胞激活单核细胞中的作用(66). 肿瘤栓子微环境中细胞因子的释放可能对肿瘤细胞的存活至关重要，并且/或者是肿瘤细胞随后渗入组织的一个促成因素。此外，最近在体内急性炎症模型表明，L-选择素可以调节白细胞滚动和粘附下游的事件(67)可能促进肿瘤细胞外渗。一种相关的可能性是，与内皮细胞相互作用的L-选择素阳性白细胞可能同时与血小板肿瘤细胞栓子的外部区域相互作用（通过血小板P-选择素和白细胞PSGL-1），从而“引导”肿瘤细胞通过内皮屏障。在这种情况下，与内皮细胞上的内源性L-选择素配体有关。这需要L-选择素配体出现在内皮细胞上，而不是淋巴器官上。事实上，众所周知，在慢性炎症过程中，L-选择素配体可以在内皮上被诱导(23,68). 在这方面，最近的数据表明，血行转移的外渗期可能只发生在肿瘤细胞血管内增殖一段时间后(69). 这可以为拟议的内源性L-选择素配体的出现提供足够的时间。
肝素是P-和L-选择素的有效抑制剂(49). 我们之前已经证明，在肿瘤细胞之前注射一次普通肝素可以显著降低免疫缺陷小鼠体内人类肿瘤的转移(9,10). 在这里，我们使用MC-38同系物系统来证明肝素注射液可以将转移降低到与P相似的水平−/−老鼠。联合使用P-选择素缺乏和肝素不能进一步减少转移，这表明这两种治疗在转移级联中影响相同的步骤。相比之下，这种单剂量的肝素可进一步减少淋巴结转移−/−老鼠(P（P）< 0.05). 因此，L-选择素的作用似乎独立于P-选择素，并且明显发生在单剂量肝素作用的时间范围之外。需要进一步研究来确定L-选择素在支持肿瘤转移中的确切作用时间和模式。
虽然大多数天然选择素配体都是粘蛋白相关的唾液酸Lewis X表位，但已知磺胺酸也是P-和L-选择素的潜在配体(39,41–43). 硫酸酯类是3-硫酸化半乳糖神经酰胺，能够通过P-或L-选择素结合触发生物反应(39,41,43). MC-38细胞上表达的L-选择素配体的异常组成包括粘蛋白样结构、糖胺聚糖结构和硫酸化糖脂（可能是硫酸酯）。相反，P-选择素配体的大部分或全部活性可能由磺酸盐表示（图。和). 对肺血管中MC-38-GFP细胞的分析显示，肿瘤细胞周围的血小板聚集（数据未显示）与之前人类结肠腺癌细胞的血小板聚集非常相似。这与早期的结果一致，表明P-选择素介导的相互作用和血小板可能的保护功能(7–9). 因此，我们在这里提供了体内硫酸化糖脂可能是转移扩散中的功能性选择素配体的证据。
