在过去十年中，通过对几个模型系统的研究，确定了一些转录因子，这些转录因子在启动级联事件中起着关键作用，导致谱系特异性基因的激活，并最终将前体细胞转化为功能特异性细胞。与此过程相结合的是增殖的未分化细胞在G中的特定点从有丝分裂细胞周期中退出1期成为永久性阻滞的终末分化细胞。肌发生是一个复杂的多步骤过程，其中确定的肌肉前体细胞首先进入分化途径，然后经历表型分化，其特征是在融合形成多核肌管之前表达肌肉结构基因（参考文献综述23,32、和35). 肌细胞生成素诱导后，细胞周期发生不可逆的退出，肌肉特异性收缩蛋白的表达需要有丝分裂后状态的建立。基本螺旋-环-螺旋转录因子的MyoD家族调节肌肉前体细胞的测定和分化，并与MADS盒转录因子的MEF2家族一起激活肌肉结构基因。与对调控分化起始和谱系特异性基因随后表达的机制的理解进展相反，人们对细胞周期阻滞在终末分化期间是如何启动和维持的知之甚少。
真核细胞周期的主要控制是由一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族（CDKs）的活性提供的；参见参考文献中的两篇最新综述15和30). CDK的酶活性由多种机制调节，包括通过细胞周期蛋白的结合而积极调节，通过CDK抑制剂的结合而消极调节。在哺乳动物细胞中，至少存在两个不同的CDK抑制剂家族，以两个原型CDK抑制剂为代表p21基因和第16页(31,34).p21基因（也称为CIP1级,WAF1（加权平均1）,SDI1型、和CDKN1型)首次在正常人成纤维细胞中鉴定为四元细胞周期蛋白D-CDK复合物的组成部分，该复合物还含有增殖细胞核抗原，是多种细胞周期蛋白-CDK酶的有效抑制剂。这个p21基因该家族包含另外两个相关的CDK抑制剂基因p27基普1和第57页基普2.的表达式p21基因该基因可由多种细胞生长调节信号诱导，包括DNA损伤、抑癌基因p53、细胞衰老和抗增殖转化生长因子β。诱导p21基因mRNA在时间上也与培养的造血细胞和成肌细胞系的终末分化以及小鼠胚胎发育过程中相关(10,11,27). 这些观察结果表明，p21可能在导致和/或维持细胞分化过程中的细胞周期阻滞中发挥关键作用。第16页墨水4a代表另一个CDK抑制剂家族，包括三个额外分离的基因：p15墨水4b（也称为MTS2系统和第14页) (8,12,17)，第18页INK4c（墨水4c）(8)和第19页墨水4d(2,9,14). 的成员墨水4基因家族在序列和进化上是相关的，所有编码蛋白都由四个重复的锚蛋白基序组成，并在同一位置包含一个内含子，中断编码序列。与p21、p27和p57不同的是，p16抑制剂家族结合并抑制广谱CDK酶的活性，专门调节两种密切相关的CDK蛋白CDK4和CDK6。p16家族以pRb依赖的方式抑制细胞生长(8,18,22)建议这些成员实现这一目标的潜在机制；也就是说，抑制活性CDK6和CDK4激酶可以阻止pRb的磷酸化，从而使pRb保持其活性、生长抑制状态。
其抑制CDK活性的生化特性以及不同细胞生长抑制条件对其表达的诱导，表明CDK抑制剂是一组理想的分子，可将细胞周期机制与多种细胞生长调节途径（包括终末细胞分化）联系起来。支持这一假设的观察结果是，几个CDK抑制剂基因的表达具有明显的组织特异性(8,9,36). 为了探讨CDK抑制剂在细胞分化中的作用，我们最近使用两个模型系统，即肌肉，分析了CDK抑制剂的表达及其在终末分化过程中与靶CDK蛋白的相互作用(7)和脂肪细胞分化(第28页). 我们在G期间发现1在两种细胞系中都存在p18INK4c（墨水4c）蛋白质被显著诱导，在肌肉发生期间超过50倍，在脂肪形成期间超过12倍。在终末分化的C2C12肌管和3T3-L1脂肪细胞中，几乎所有CDK6和大部分CDK4都与p18复合。在成年小鼠的肌肉和脂肪组织中也发现了丰富的p18蛋白和p18-CDK4/6复合物。这些观察结果表明，p18在引起和/或维持与终末细胞分化相关的永久性细胞周期阻滞中起着重要作用。然而，调节p18蛋白诱导的机制尚不清楚。本研究针对这一问题。
材料和方法
细胞培养和转染。
先前描述了小鼠C2C12成肌细胞的培养和肌原性诱导（ATCC CRL 1772；马里兰州罗克维尔美国型培养物收藏馆）(7)并进行形态学评估，诱导后4至5天内肌管可见，并通过Northern分析监测肌生成素基因，肌肉发生的遗传标记（图。A） ●●●●。为了转染C2C12细胞，将细胞以低密度放置在p100培养皿中，并使其生长到50%的汇合点（接种后24至48小时），然后将12μg DNA与36μl脂质体胺（Gibco-BRL，马里兰州盖瑟斯堡）预混，总体积为6 ml Optimem-1培养基（Gibco-BRL）转染细胞按照制造商的说明。用12μg pcDNA3或8μg所示p18表达质粒转染细胞（见图。A） ●●●●。用pcDNA3将转染的DNA总量调整为12μg。在用DNA-脂质混合物培养5小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，然后用生长培养基补充。转染24小时后通过胰蛋白酶法获取细胞，然后将其分为两等份进行Northern和Western印迹分析。
C2C12细胞分化过程中p18 mRNA的差异表达。（A） 总RNA是从生长培养基（通道1）或分化培养基中培养的增殖C2C12细胞中制备的，培养时间为每个通道（通道2至9）上方所示的时间。将10微克的每个RNA样品在1%琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶上解析，转移到硝化纤维过滤器中，并与源自小鼠p18 cDNA编码区的探针杂交（顶部）。同样的印迹被剥离，并用来自小鼠肌生成素基因的探针重新杂交，以监测肌生成的进展（中）。通过溴化乙锭染色测定，大约等量的RNA被加载（底部）。（B） C2C12细胞分化过程中p18外显子1的表达。将在生长培养基（第1道）或分化培养基中培养的C2C12细胞在上述各道（第2道至第9道）上所示时间制备的10微克总RNA，在1%琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶上溶解，转移到硝化纤维过滤器中，并与来自NIH 3T3 cDNA克隆T9第1外显子的探针杂交（上图）。通过溴化乙锭染色测定，大约等量的RNA被加载（底部）。
5′UTR对p18 mRNA的翻译调控。（A） pcDNA3-p18（L）和pcDNA3-p18（S）质粒的相关区域图。将与NIH 3T3细胞分离的p18（L）cDNA对应的1840 bp DNA片段和与小鼠骨骼肌组织分离的p19（S）cDNA相对应的845 bp DNA片段插入异源CMV和噬菌体T7启动子下游的pcDNA3表达载体中。5′UTR用灰色方框表示，3′UTR由白色方框表示，p18编码序列用黑色方框表示。指出了翻译起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA）的位置。（B） 两个p18 cDNA的体外转录。使用pcDNA3-p18（L）和pcDNA3-p18（S）（各0.1 pmol）作为模板，使用噬菌体T7 RNA聚合酶体外转录5′端mRNA。通过将0.1（通道1和4）、0.25（通道2和5）或0.5（通道3和6）μl每种反应混合物加载到1%琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶上，并通过分光光度法进行定量（通道1至6分别包含180、450、900、160、400和800 ng），验证RNA产物。如凝胶左侧所示，每次反应都会产生与相应克隆cDNA片段大小一致的离散RNA转录物。（C） 两个p18 cDNA的体外翻译。体外转录的p18mRNA（每种0.1或0.5pmol）在存在[35S] 蛋氨酸。用p18抗血清免疫沉淀每种翻译反应混合物的10微升，并通过SDS-PAGE进行解析。用所示的p18表达质粒或亲本pcDNA3质粒瞬时转染（D和E）C2C12细胞。在转染后24小时收集细胞，并将其分为两等份进行RNA（D）和蛋白质（E）分析。将来自转染C2C12细胞的10微克总RNA溶解在1%琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶上，转移到尼龙膜上，并与来自小鼠p18 cDNA编码区的探针杂交（顶部）。通过用人β-肌动蛋白探针剥离和重制相同的印迹来测定，加载了大约等量的RNA（下图）。（E） 用SDS-PAGE将转染的C2C12细胞的50微克总蛋白裂解物溶解，转移到硝化纤维过滤器中，并用p18（顶部）或CDK2（底部）蛋白的特异性抗体进行印迹，以验证蛋白质载量是否相等。
转染前24小时，将NIH 3T3细胞（ATCC CRL 1658）以170000/孔的密度镀在六孔板上。对于每次转染，将1μg所示的p18荧光素酶质粒或相应的无启动子荧光素酶质粒pGL2-Basic（Promega，Madison，Wis.）和1μg CMV-LacZ（转染效率的内部控制）与6μl脂质体胺预混合，总体积为1 ml Optimem-1。与DNA-脂质混合物孵育5 h后，用PBS清洗细胞，补充新鲜培养基，然后在转染后24 h收获用于荧光素酶和β-半乳糖苷酶分析。所有转染均一式三份。
荧光素酶分析。
转染后24小时，细胞在PBS中清洗，并在250μl 1×Reporter裂解缓冲液（Promega）中刮取。将细胞在4℃下旋转溶解10 min，并在4℃的微型离心机中以最大速度离心5 min以澄清细胞。如前所述，对10微升澄清细胞裂解液进行荧光素酶活性分析(20). 对于β-半乳糖苷酶分析，75μl澄清的裂解液与500μl Z缓冲液（21 mM Na）在37°C下培养2高性能操作4，40 mM NaH2人事军官4，10 mM KCl，1 mM MgSO4，40 mMβ-巯基乙醇[pH7.0]），含氯酚红-β-d日-最终浓度为0.1mg/ml的吡喃半乳糖苷（Boehringer Mannheim，Indianapolis，Ind.）。通过加入Na停止反应2一氧化碳三至260 mM，并测定595 nm处的光密度。将每个样本的荧光素酶活性标准化为β-半乳糖苷酶活性，以控制转染效率。pGL2-Basic质粒的标准化荧光素酶活性设置为1。
基因组和cDNA结构分析。
为了确定终末分化小鼠肌管中表达的1.2-kb p18 mRNA的结构，利用人类p18 cDNA的编码区作为探针筛选了小鼠骨骼肌cDNA文库（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，Calif.）(8)降低浓度（在52°C下，在0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]–1×SSC[0.15 M氯化钠+0.015 M柠檬酸钠]中进行最终清洗）。为了确定增殖细胞中表达的2.4-kb p18 mRNA的结构，通过使用1.1-kb小鼠骨骼肌p18 cDNA克隆作为探针在高严格性下（在68°C下在0.1%SDS-1×SSC中最终洗涤）筛选来源于增殖NIH 3T3细胞的lambda cDNA文库。分离含有小鼠的基因组克隆第18页使用相同的1.1-kb cDNA片段作为探针，筛选由129/SV小鼠基因组DNA构建的λFIXII文库（Stratagene，La Jolla，Calif.）。骨骼肌文库M1（1040 bp）中1.1-kb cDNA克隆的完整序列；从NIH 3T3文库中分离的cDNA克隆，T9（1840 bp）；基因组区域（包括所有三个外显子、外显子-内显子连接和部分内含子）由北卡罗来纳大学DNA测序设施使用自动测序系统（ABI-373A；Perkin-Elmer）确定。在小鼠骨骼肌克隆M1的基因组和cDNA序列之间检测到两个单核苷酸多态性（图中用星号表示）。A） ●●●●。
小鼠基因组和cDNA结构第18页基因。（A） p18 cDNA 5′UTRs与p18基因组序列的比较。将小鼠p18基因组片段的5′UTR的核苷酸序列与从增殖NIH 3T3细胞[cDNA T9，p18（L）]和成熟骨骼肌细胞[cDNA M1，p18。剪接供体和受体位点用粗体表示并加下划线。p18的ATG翻译起始密码子为粗体，编码cDNA T9的5′UTR（uORF）中短ORF的其他ATG密码子为斜体并加下划线。基因组和骨骼肌序列之间的两个单核苷酸多态性用星号表示。用于引物延伸实验的反义寡核苷酸引物L在编码链上作了强调。（B） 小鼠p18基因组和cDNA结构的示意图。p18（L）和p18（S）转录本的5′UTR分别用细条纹框和厚条纹框表示，3′UTR用灰色框表示，内含子用白色框表示，编码区用黑色框表示。拼接事件由桥接线表示。
质粒。
pcDNA3-p18（L）表达质粒是通过亚克隆1840-bp生态从NIH 3T3细胞中分离的p18 cDNA克隆T9的RI限制性片段进入噬菌体T7下游的表达质粒pcDNA3（Invitrogen，San Diego，Calif.）和巨细胞病毒（CMV）启动子。通过PCR（sense引物；5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；反义引物，5′-ATGGGCCCAACCACCATCCCAGTCTCTCTTG-3′）获得与骨骼肌p18 cDNA克隆M1相对应的DNA片段。消化后阿帕我和Afl公司III并填充T7 DNA聚合酶，将钝端DNA片段亚克隆到生态pcDNA3的RV位置生成pcDNA3-p18（S）。两个p18克隆包含相同的编码序列和3′非翻译区（UTR），但其5′UTR的长度不同（见图。A） ●●●●。
荧光素酶构建物是通过将小鼠p18基因组片段亚克隆到缺乏真核启动子和增强子序列的pGL2-Basic荧光素酶报告质粒中生成的。对于荧光素酶结构体（参见图。)，位于ATG密码子内的A核苷酸被任意定义为+1，使得这些构建体的编号表示与该核苷酸的距离5′。Luc3是303-bp囊二-Xba公司I片段跨越核苷酸（nt）1879至2182，Luc4为370-bpSpe公司我-囊I片段跨越nt 147至517，Luc5为876 bpNru公司我-Xba公司I片段跨越nt 1306至2182，Luc8为1371-bpSpe公司我-铝I片段，横跨nt 147至1518，Luc10为1407bp霍克我-铝I片段跨越nt 111至1518，Luc11为1163 bp欣dIII型-铝I片段跨越nt 355至1518，Luc12为1001-bp囊我-铝I片段跨越nt517到1518，Luc13是359 bp不是我-铝I片段跨越nt 1159至1518，Luc17为499 bp欣dIII型-Sma公司I片段跨越nt 355到854，Luc18是162-bp欣dIII型-囊I片段跨越nt 355至517。
小鼠p18基因包含两个启动子。将含有小鼠p18基因组序列的DNA片段亚克隆到缺乏真核启动子和增强子序列的pGL2-Basic荧光素酶报告质粒中。指出了构建这些质粒时使用的限制性位点。ATG密码子中的A核苷酸被任意设置为1。瞬时转染增殖的NIH 3T3细胞24小时后，通过测量每个构建物的荧光素酶活性来测定每个构建体的启动子活性。通过加入CMV-LacZ表达质粒，使转染效率标准化。相对荧光素酶活性归一化为β-半乳糖苷酶活性，无启动子pGL2-Basic质粒的归一化荧光素酶活性设置为1。数据是三个独立实验的平均值。p18（S）转录物的转录起始位点，通过启动子活性测定定位于Sma公司I（nt 854）和欣dIII（nt 355）限制位点（以虚线突出显示）尚未精确确定。（A） 小鼠第二个p18启动子的定位；（B） 两种启动子强度的比较。
RNA分析和引物延伸。
根据制造商（俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心有限公司）的说明，使用TRI-REAGENT制备总RNA。在1%琼脂糖-甲醛-吗啉丙基磺酸（MOPS）凝胶上分离10微克每种RNA样品，并转移到硝化纤维或尼龙过滤器中。对于硝化纤维过滤器，在含有5×Denhardt溶液、2×SSC、0.1%十二烷基硫酸钠、每毫升100μg变性鲑鱼精子DNA、25μM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）和10%硫酸右旋糖酐的溶液中，在60°C下进行16小时的杂交。对于尼龙膜，在68℃下在QuiKHyb（Stratagene）中进行杂交2 h，然后在2×SSC–0.1%十二烷基硫酸钠中进行两次洗涤，然后在0.2×SSC-0.1%十二烷基苯磺酸钠中进行二次洗涤，每次洗涤15 min，温度50℃。p18探针是从小鼠p18编码区获得的0.6kb cDNA片段（图。A；参见图。D） 或与p18外显子1相对应的1.1-kb cDNA片段（图。B） ●●●●。肌生成素探针是W.Wright善意提供的1.4kb小鼠肌生成素cDNA片段(33). 溴化乙锭染色用于证明RNA负载均匀（图。A和B），或者将膜剥离并用人β-肌动蛋白cDNA探针重新处理（见图。D） 。用密度计定量p18和β-肌动蛋白RNA水平（见图。D） ●●●●。
通过使用2.4-kb p18（L）转录物、引物L、，它对应于NIH 3T3 cDNA克隆（5′-TTGCCTGAGGTACTGTCG-3′）第1外显子中的nt 102至80；图中下划线。A） ●●●●。10个引物L的微粒体用T4多核苷酸激酶（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）5′末端标记，并通过G-25 Sephadex柱纯化。将放射性标记的引物与总RNA混合，然后用乙醇沉淀。将颗粒样品重新悬浮在由40 mM哌嗪组成的杂交缓冲液中-N个,N个′-双（2-乙磺酸）（PIPES；pH 6.4）、1 mM EDTA、400 mM NaCl和80%甲酰胺；在100°C下变性5分钟；并允许在42°C下杂交至少10 h。杂交后，用乙醇沉淀样品，然后在37°C下在含有50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、8 mM MgCl的20μl体积中反向转录2 h2、10 mM二硫苏糖醇、40 U核糖核酸酶抑制剂（Boehringer Mannheim）、1 mM脱氧核苷三磷酸和50 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶（新英格兰生物实验室）。通过添加1μl 0.5 M EDTA停止反应，然后添加1μl 10-mg/ml RNase A，并在37°C下培养混合物10分钟以消化RNA模板。添加80μl水和50μl 7.5 M醋酸铵后；样品用等体积的酚-氯仿萃取一次，用乙醇沉淀，再悬浮在8μl测序负载染料缓冲液中。将反转录产物在100°C下变性3分钟，并在7%的测序凝胶上通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行解析。将凝胶干燥并暴露于薄膜中。
原位杂交。
如前所述制备小鼠胚胎石蜡切片(19). 如前所述进行原位杂交(4; 另请参阅参考19详细信息）。通过体外转录，使用[33P] UTP公司。与编码序列对应的p18探针是一个0.6-kb的DNA片段，该片段来自从小鼠骨骼肌cDNA文库中分离的p18 cDNA克隆，并使用T7启动子通过体外转录制备。与外显子1的5′UTR相对应的p18探针是一个1.1-kb cDNA片段，该cDNA片段来源于从增殖小鼠NIH 3T3 cDNA文库中分离的p18 cDNA克隆[p18（L）；图。]并使用Sp6启动子通过体外转录制备。
结合体外转录和翻译。
将pcDNA3-p18（L）和pcDNA3-p18（S）（各0.1 pmol）线性化为Xho公司I，并用作模板，在Cap Scribe缓冲液（Boehringer Mannheim）中使用T7 RNA聚合酶体外转录两种5′端的p18mRNA。用无RNase DNase I消化DNA模板后，用乙醇沉淀RNAs，在水中重新悬浮，用分光光度法定量，并在用溴化乙锭染色的1%琼脂糖-甲醛-MOPS凝胶上观察。在含有[35S] 蛋氨酸（Promega）。用p18特异性抗体免疫沉淀10微升每种体外翻译反应混合物(7)并通过SDS-PAGE进行解析。将凝胶干燥，并使用PhosphorImager和ImageQuant软件（Molecular Dynamics，Sunnyvale，Calif.）对放射性标记的蛋白质进行定量。
蛋白质印迹分析。
细胞在PBS中洗涤，在Nonidet P-40裂解缓冲液中裂解，并如前所述进行免疫印迹(16). 细胞裂解物的蛋白质浓度通过Bradford试验（加州Hercules Bio-Rad）测定，50μg细胞总裂解物通过SDS-PAGE分离。通过Ponceau染色和用1:2500稀释的CDK2蛋白特异性抗体对膜的上半部分进行印迹，验证了负载相等(7). 用1:2500稀释的p18特异性抗体对膜的下半部分进行印迹(7). 使用ECL检测试剂盒（Amersham）对抗体进行可视化，并使用密度计进行定量。
结果
终末肌肉分化期间p18 mRNA的差异表达。
为了确定在终末细胞分化过程中调节p18蛋白表达的机制，我们分析了培养C2C12成肌细胞肌发生过程中的p18 mRNA。在诱导分化的一段时间内，从C2C12细胞中分离出总RNA，并使用小鼠p18 cDNA编码序列作为探针，通过Northern blot分析测定p18 mRNA的稳态水平（图。A） ●●●●。使用该探针检测到两个p18转录本，长型称为p18（L），短型称为p18（S）。C2C12成肌细胞的分化通过剥离并用肌生成素（一种肌生成的遗传标记）重制相同的印迹来监测（图。A）(33)，以及通过形态学变化的显微镜检查（数据未显示）。在增殖的C2C12成肌细胞（1区）中，检测到单个2.4-kb转录物[p18（L）]。在诱导肌发生后，p18（L）立即出现短暂增加（第3和第4通道）。诱导后20小时，p18（L）mRNA的稳态水平开始下降（第5道），诱导后5天（第9道）降至几乎无法检测到的水平。相反，在诱导后12至24小时，增殖成肌细胞（第1通道）中未出现的较短的1.2kb转录物[p18（S）]可被检测到，并在分化过程中稳步增加（第4通道至第9通道）。从C2C12细胞分化早期（24至48小时）分离出的较短的p18转录物的流动性比后期（3至5天；将通道5和6与通道7至9进行比较）慢，表明poly（A）的可能性与短p18转录物相关的尾部延长可能有助于在最初退出细胞周期的细胞中更积极地合成p18蛋白。在增殖的小鼠巨噬细胞中，p18 mRNA周期性表达，最低水平为G1在S阶段达到最高水平(14). 因此，虽然G的富集1分化引起的细胞群体可以解释观察到的p18（L）水平下降，它认为p18（S）转录物的积累是一个调节事件。数据还表明，尽管在C2C12细胞分化过程中p18蛋白的诱导作用超过50倍，但分化细胞（第9通道）中p18（S）转录物的稳态水平与增殖细胞（第1通道）中的p18（L）转录物相似或略低(7). 总之，这些结果表明，在终末肌肉分化过程中，存在从长p18（L）转录到短p18（S）转录的优先转换，并且在肌肉发生过程中p18蛋白的诱导可能涉及转录和转录后调节。
鼠标的结构第18页基因。
我们试图通过分离相应的cDNA克隆来确定这两个p18转录物的结构。对小鼠骨骼肌文库的筛选产生了1.1-kb cDNA克隆（M1），鉴于其大小和来源，该克隆很可能对应于分化C2C12细胞中积累的1.2-kb p18（S）转录物（图。A） ●●●●。为了鉴定与2.4-kb p18（L）转录物相对应的cDNA克隆，我们筛选了一个来源于增殖NIH 3T3成纤维细胞的小鼠cDNA文库，基于此观察，此较长的转录物优先在增殖的未分化成肌细胞中表达（图。A） ●●●●。从3T3文库中分离出几个独立的p18 cDNA克隆。NIH 3T3克隆中最长的T9（1840 bp）已完全测序。T9的序列包含504bp的开放阅读框和明显截短的221bp的3′UTR，其与由较短的1.1-kb p18（S）M1 cDNA编码的那些相同（数据未显示）。然而，T9包含一个1115 bp的5′UTR，它与骨骼肌cDNA克隆的5′UTR完全不同，除了ATG起始密码子上游的11 bp序列（图。A） ●●●●。
为了确定这两种不同转录物的来源，我们分离了一个包含第18页基因。在基因组克隆中鉴定了两个p18 cDNA的完整序列。cDNA和基因组序列的比较显示第18页基因只包含一个内含子，该内含子位于p16中与内含子1相对应的位置墨水4a基因（in第18页，在氨基酸残基43和44之间）。这与p16基因不同，p16基因的编码序列包含第二个内含子，该内含子在最后五个氨基酸残基之前中断编码序列(17). 除了由两个p18 cDNA共享的两个编码外显子（外显子2和外显子3）外，较长的p18（L）cDNA还包含一个非编码外显基因（外显基因1），该外显基因由一个343 bp的内含子与外显基因2分离（图。A和B）。另一个小鼠p18 cDNA克隆，先前从增殖性T淋巴瘤细胞中分离(14)包含一个78-bp 5′UTR，其中包括p18（S）和p18（L）转录物共有的11-bp序列，以及一个53 bp的序列，该序列对应于删除相同的343-bp内含子后在cDNA克隆T9的5′UTR-中发现的序列。
为了证实从NIH 3T3细胞分离的cDNA克隆对应于2.4-kb p18（L）转录物，其丰度在C2C12细胞分化过程中减少，使用克隆T9的外显子1作为探针，对肌肉发生过程中p18 mRNA稳态水平进行Northern分析。该探针仅检测到2.4-kb的p18（L）转录本（图。B） ●●●●。外显子1特异性探针检测到的p18（L）转录物稳态水平的模式与编码探针检测的模式相同（图。A） ●●●●。这些结果表明，这两个p18转录本在5′UTR中主要不同（如果不仅仅如此），并且这两个转录本，一个包含非编码外显子1，另一个缺少外显子2，在肌源性分化过程中差异表达。
这个第18页该基因包含两个不同的启动子。
这两个p18转录物可以通过选择性剪接或启动子切换产生。考虑到外显子1探针没有与p18（S）转录本杂交，1.2-kb p18（L）转录本在2.4-kb转录本的同一位点启动，随后发生添加小外显子的选择性剪接事件的可能性似乎小于从单独启动子启动的可能性（图。B） 通过选择性剪接产生两个转录本需要在同一转录本上有两个单独的剪接供体和受体位点。将p18（L）cDNA与p18基因组序列进行比较，确定了完美的剪接供体和受体位点（图。). 对于p18（S），从骨骼肌文库中分离出的p18 cDNA克隆的大小[1040 bp，没有poly（A）tail]非常接近通过Northern杂交检测到的p18转录本的大小，我们估计为1.2 kb（图。)其他人则为1.1 kb(14). 因此，我们分离的骨骼肌cDNA克隆可能仅在其5′端缺失一个非常小的序列。我们检查了基因组序列，发现在骨骼肌p18（S）cDNA克隆5′端上游的300-bp内含子区域内没有一个序列与剪接受体位点足够相似。为了确定产生两个p18转录物的机制，我们绘制了第18页通过引物延伸在增殖和分化的C2C12细胞中的转录起始位点。一个针对较长p18（L）转录物的23聚体反义寡核苷酸引物（引物L[图中带下划线的序列。A] ），与NIH 3T3 p18 cDNA克隆T9的核苷酸102至80相对应，生成了约100 nt长的引物延伸产物（图。). 这表明克隆T9在其5′端看起来是全长。增殖的C2C12细胞中p18延伸产物的水平远高于分化的C2C11细胞，这与其在增殖的成肌细胞中的优先表达一致（图。A和). 为了确认小鼠p18基因这个区域中存在启动子序列Xba公司我-Nru公司跨越该起始位点的I基因组DNA片段被插入pGL2-Basic荧光素酶报告质粒，该质粒缺乏真核启动子和增强子序列（图。B、 Luc5）。当将所得质粒瞬时转染到增殖的NIH 3T3细胞中时，与亲代pGL2-Basic质粒相比，其荧光素酶活性的诱导是亲代pGL2-Basic质粒的9.8倍（图。B） ●●●●。删除573个基点囊二-Nru公司包括p18（L）起始位点（Luc3）的I区取消了启动子活性，从而证实了该区域中存在启动子序列（图。B） ●●●●。
p18（L）转录本的引物延伸。从生长培养基（增殖）中培养的C2C12细胞和分化培养基中培养4天（分化）的C2C11细胞中制备总RNA。酵母tRNA被用作阴性对照。将30微克的每个RNA样本与p18（L）转录物特异的反义引物、引物L杂交，并用逆转录酶延伸。延伸产物在7%尿素变性凝胶上溶解。标记车道采用pUC18消化血红蛋白标记II和5′端。片段长度（以核苷酸为单位）显示在左侧。
我们还试图绘制p18（S）转录本的转录起始位点。然而，尽管我们一再努力，但我们未能通过核酸酶保护、PCR对cDNA末端的5′快速扩增和引物延伸最终确定p18（S）转录物的精确转录起始位点。我们不知道这些困难的确切原因，我们只能将其归因于短转录物5′端周围的高GC含量和/或可能的多个起始位点，正如短转录物的异质性所表明的那样（图。A） ●●●●。因此，我们将工作转向通过使用荧光素酶报告启动子分析来检测p18启动子活性，从而确定是否存在单独的下游启动子。将一系列跨越外显子1和内含子1的部分重叠小鼠p18基因组DNA片段亚克隆到pGL2-Basic荧光素酶报告质粒中（图。A） ●●●●。将产生的质粒瞬时转染到增殖的NIH 3T3细胞中，并测量荧光素酶活性的表达（图。A） ●●●●。从第一个p18启动子起始位点下游65 bp开始的1407-bp基因组片段Luc10显示出9.7倍的荧光素酶活性诱导（图。A） ，表明存在第二个小鼠p18启动子。Luc10构建物产生了两个方向的连续缺失，以确认第二个启动子的活性并进一步定位。包含Luc10的3′端缺失的两个报告结构Luc8和Luc11均显示出荧光素酶活性增加，其中Luc11显示出所检测结构中最高的荧光素酶活性，比亲本pGL2-Basic质粒增加24.9倍。Luc11中存在的小鼠p18基因组序列的3′端位于最长p18（S）cDNA p18M1的5′端上游239 bp（图。A） ，这表明p18M1在其5′端被截断。进一步从Luc11的3′端162-bp（Luc12）或804-bp（Luc13）缺失导致荧光素酶活性的类似急剧下降。这些结果表明，下游启动子的完全活性需要外显子1内的162-bp序列（核苷酸355至517）。然而，与Luc11相比，这个162-bp片段（Luc18）本身只表现出较弱的启动子活性。此162-bp片段的扩展包括5′序列（Luc17）的额外337个核苷酸，但不包括较短的55 bp片段（至Nhe公司I站点；数据未显示），恢复了接近Luc11的启动子活性。值得注意的是，Luc17质粒的5′端位于p18（L）起始位点下游729bp处，排除了上游启动子的可能贡献，并将p18（S）转录物的起始位点定位在介于Sma公司我和欣d三。
为了进一步证实小鼠p18基因中存在两个不同的启动子，我们在同一组实验中比较了包含上游启动子（Luc5）和下游启动子（Luc11和Luc17）的构建物表达的荧光素酶活性。与pGL2-Basic质粒相比，所有三个构建物均表现出显著的荧光素酶活性（图。B） ●●●●。特别是不共享任何重叠序列的Luc5和Luc17，它们都表现出启动子活性，这与包含启动子序列的p18基因中存在两个不同且可分离的区域相一致。
小鼠胚胎发育过程中p18 mRNA的表达。
为了确认第18页在体内基因中，我们通过原位杂交检测了两种p18转录物在发育中的小鼠胚胎中的表达。通过使用包含编码序列的小鼠p18反义RNA探针，在子宫颈分化的肌肉细胞中检测到p18 mRNA的丰富表达（图。A） ，膜片（图。C） 和心脏（图。E） 第15天胚胎。除了肌肉细胞外，肺中也有丰富的p18 mRNA（图。C） ，肝脏（图。E） 胸腺（图。E） 和眼睛的晶状体（数据未显示）。检测控制探头未检测到信号（数据未显示）。在包括神经管和视网膜在内的多个组织中未检测到p18 mRNA（数据未显示）。为了确定哪些形式的p18转录物在这些分化细胞中高度表达，我们使用包含5′UTR（非编码外显子1）的p18反义RNA探针，在第15天小鼠胚胎的相同组织中进行原位杂交，该5′UTR5′UTR1（非编码第1外显子）存在于较长的p18（L）转录物中。该探针在子宫颈分化的骨骼肌细胞中未检测到或检测到p18 mRNA的水平极低（图。G） ，心脏（图。一） 和隔膜（图。一） ●●●●。此外，外显子1探针也未能检测到肺部的任何p18 mRNA（图。一） 和肝脏（图。一） ●●●●。相反，p18（L）特异性探针在成年小鼠睾丸组织中检测到丰富的p18 mRNA，其中包含大量未分化的有丝分裂活性细胞（图。K） ●●●●。这与我们之前的Northern分析一致，该分析显示成年小鼠睾丸精原细胞中较长的p18（L）转录物高水平表达(7,36)这些观察结果提供了体内证据，证明短p18（S）转录物的表达与包括肌肉细胞谱系在内的几种细胞类型的终末分化相关。
小鼠胚胎中p18 mRNA的表达。E15.0胚胎的矢状切面与小鼠p18反义RNA探针杂交，该探针对应于长转录物和短转录物（A、C和E）共同的编码序列或长转录物（G、I和K）中唯一存在的5′UTR。显示了暗场（左）和相应的亮场（右）照片。睾丸组织取自2个月大的小鼠（K和L）。dp，隔膜；ht，心脏；lv，肝脏；肺；sc，脊髓；sm，骨骼肌；ST，生精小管；ty，胸腺；vc，椎体软骨。
5′UTR对p18 mRNA的翻译调控。
当p18转录物在C2C12细胞分化过程中发生转换时，活跃增殖细胞中p18（L）转录物的稳态水平与分化细胞中的p18（S）转录物相似（图。A） ●●●●。因此，p18蛋白的诱导，从增殖的C2C12细胞中几乎检测不到的水平，到成熟的C2C11肌管中增加50倍(7)，不受p18mRNA稳态水平变化的调节。为了阐明p18蛋白诱导的机制，我们检测了两种p18转录物在体外和体内的翻译调节差异的可能性。编码p18（S）和p18（L）转录物的cDNA序列置于位于pcDNA3表达质粒内的异源CMV和噬菌体T7启动子的控制下。这两个cDNA序列包含相同的编码和3′UTR序列，但5′UTR不同。p18（L）cDNA包含来自2.4kb cDNA克隆T9的1115-bp 5′UTR，而p18（S）cDNA则包含来自1.2kb cNA克隆M1的120-bp 5′UTR-（图。A） ●●●●。使用T7 RNA聚合酶在体外生成5′端p18 RNA转录物，并通过分光光度法和凝胶电泳进行定量（图。B） ●●●●。这两个DNA模板都生成了一个预期大小的RNA物种。将体外转录的p18 RNA产物（分别为0.1和0.5 pmol）用作兔网织红细胞裂解物的体外翻译模板。用针对p18的抗血清免疫沉淀等体积的翻译反应，并用SDS-PAGE对样品进行解析（图。C） ●●●●。从任何一种形式的p18 RNA产生的唯一翻译产物是18-kDa蛋白，该蛋白被p18特异性抗体识别，证实两种转录物编码相同的蛋白质物种（图。C） ●●●●。引人注目的是，较短的p18（S）转录本的翻译效率是较长p18（L）转录本翻译效率的50倍（图。C） 为肌发生过程中p18蛋白的诱导提供了合理的分子基础。
将相同的p18表达质粒瞬时转染到增殖的C2C12细胞中，以确定体外观察到的p18（L）中5′UTR的翻译衰减是否在体内重现。转染后20小时，收集细胞并将其分为两部分，分别进行RNA和蛋白质分析。从两个独立的实验中获得了相同的结果。使用与小鼠p18编码区相对应的探针对总RNA进行Northern印迹分析，检测到预期大小的RNA种类（图。D、 顶部）。根据放射自显影的密度计扫描测定，p18（L）和p18（S）信息的相对量几乎相等。使用针对p18蛋白的抗体对总细胞裂解物进行的Western blot分析发现，在转染p18（S）质粒的细胞中，p18蛋白比转染p19（L）质粒的电池中多12倍（图。E、 顶部）。在用空的pcDNA3表达质粒转染的细胞中，在该暴露时间内检测不到p18蛋白水平。这些结果表明，缺失1.1-kb 5′UTR外显子1的短p18转录本的翻译效率显著提高。
讨论
CDK抑制剂蛋白丰度的调节在细胞对各种生长信号的反应中起着关键作用。DNA损伤后CDK抑制剂p21丰度的升高(6)，在细胞分化期间(21)和γ-干扰素诱导后(三)以及CDK抑制剂p15的诱导墨水4b通过抗增殖细胞因子转化生长因子β(12)，均由转录激活介导。CDK抑制剂p27的蛋白质丰度基普1在丝裂原刺激后减少，并通过泛素介导的蛋白质降解途径在转录后进行调节(26)或平移机构(1,13). 在本报告中，我们首次证明了CDK抑制剂p18丰度的转录和翻译双重调控INK4c（墨水4c），响应特定的细胞生长控制信号，终末肌细胞分化。
在C2C12细胞的成肌诱导后，在成肌诱导的8小时内，p18蛋白从增殖成肌细胞中的可忽略水平快速显著地诱导到可清楚检测的水平，在最终分化的肌管中累积到50倍以上。p18是在分化过程中发现的唯一持续积累的CDK抑制剂。p18蛋白的诱导与复合物形成增加相关，首先与CDK6相关，然后与CDK4相关，并且CDK4的pRb激酶活性降低。在终末分化的C2C12肌管和成年小鼠肌肉组织中，p18几乎与所有CDK6和一半CDK4复合(7). 在本文中，我们提供了四系列证据，证明在C2C12细胞分化过程中这种快速和持续的p18蛋白诱导在很大程度上受转录和翻译控制的耦合调节。首先，p18 mRNA在G1C2C12电池退出。增殖的C2C12成肌细胞优先表达较大的2.4-kb p18转录物，其丰度随着C2C12细胞分化为最终分化的肌管而降低。与这种下调相一致的是，短1.2kb的p18转录物从增殖细胞中几乎无法检测到的水平诱导为永久性停搏肌管中的主要p18转录。基因组和cDNA序列的结构分析表明，这两个p18转录物最有可能来自替代转录起始位点。第二，短而非长的p18转录物的表达与小鼠胚胎发育过程中的体内终末分化相关。第三，小鼠p18基因包含两个不同的启动子，定位于基因组DNA中的两个不同区域；一个是长p18（L）转录本的上游，而另一个是短p18（S）转录本上游。最后，虽然阻滞的C2C12肌管中较短的p18转录物的稳态水平与增殖的成肌细胞中较长的转录物相似或略低，但与较长的p18基因转录物相比，它在体外和体内的翻译效率明显更高，为C2C12细胞分化过程中p18蛋白的50倍诱导和持续表达提供了分子基础。在G1小鼠巨噬细胞的退出，其中较短的转录物优先在被生长因子剥夺阻止的细胞中表达，较长的转录物则优先在增殖细胞中表达(14). 总之，这些结果表明，p18表达的转录和翻译偶联控制可能不是肌发生所独有的，并且可能在其他细胞类型中用于调节p18蛋白的丰度。
两种形式的p18转录本之间的主要结构差异在于其5′UTR。这两个转录本都包含编码外显子2和3，并编码相同的蛋白质（图。A） 但较大的p18转录本唯一包含额外的1.2kb非编码外显子，即外显子1。去除这个长的5′UTR显著提高了平移效率（图。)表明外显子1编码的5′UTR具有抑制作用。5′UTR的翻译抑制作用已在许多细胞基因中得到证实，这些基因在调节细胞生长和发育中发挥作用（见最近的文献综述5).顺式-5′UTR内可能参与翻译抑制的作用元件包括高GC含量，GC含量有形成稳定的干环RNA二级结构的趋势，阻止核糖体扫描，编码小开放阅读框（uORF）的多个上游AUG密码子它可以干扰下游AUG密码子的翻译起始，以及可以被反式-阻碍翻译的作用因子（RNA结合蛋白）。p18（L）转录物外显子1编码的5′UTR的GC含量异常高，为62%，预示着形成稳定二级结构的趋势增加，从而减弱p18蛋白的翻译。较长形式p18转录物的5′UTR还包含五个AUG密码子（uORF），可能编码长度从12到43个氨基酸残基的多肽（图。A） ●●●●。这些特征可能为2.4-kb p18转录物翻译效率低提供了结构基础，从而解释了增殖细胞中p18蛋白积累水平低的原因。我们还没有研究p18蛋白稳定性的可能变化，这些变化也可能有助于p18蛋白的积累。然而，在体外和体内观察到去除p18（S）中的5′UTR后，p18翻译效率也有类似的提高（图。C和E），以及同源蛋白p16的长半衰期墨水4a（实验设计后3小时内变化不大[28])反对p18蛋白稳定性变化的重要贡献。
我们的发现提出了一个关于p18在增殖细胞中的功能的问题。当细胞从G区退出时0在生长因子刺激后的静止状态下，CDK4和CDK6的pRb激酶活性在G早期至中期被激活1增殖细胞中的期和持续升高(24,25). 因此，虽然在分化过程中诱导并在终末分化细胞中持续的高水平p18蛋白可能在抑制CDK4和CDK6（这是进入和维持细胞周期阻滞所必需的）方面发挥重要作用，但p18在增殖细胞中的功能（如果有的话）尚不清楚。我们认为p18可能在增殖细胞中执行一种未知的监视功能，只需要从p18（L）转录物合成的低水平p18蛋白。翻译减弱的较长p18转录物的表达可使增殖细胞通过翻译控制对某些生长条件作出快速可逆的反应，例如消除与5′UTR结合的翻译抑制蛋白的机制，类似于铁反应元件(29). 当细胞进入永久性细胞周期阻滞状态时，转换到翻译效率高的表达，较短的p18转录物将导致p18蛋白水平的升高和持续，以确保稳定的细胞周期阻滞，这很可能是通过pRb依赖性途径实现的。迄今为止，唯一显示在骨骼肌发育过程中具有重要非冗余作用的细胞周期调节分子是视网膜母细胞瘤蛋白（参考文献综述23和32). 此外，分化的肌管可以在表达病毒癌蛋白后重新进入细胞周期，这些癌蛋白在功能上使pRb失活，从而支持pRb在负调控这些细胞增殖中的作用，并表明这些细胞的增殖能力并未丧失，而是受到pRb的积极抑制。p18以pRb依赖性的方式抑制细胞生长，这表明p18在肌发生过程中依赖pRb启动和维持细胞周期阻滞中发挥作用的潜在机制：通过直接抑制CDK4和CDK6的激酶活性，从而使pRb保持其活性和生长抑制状态(8). 支持这一发现的是，视网膜母细胞瘤蛋白在CDK复合物下游发挥作用，调节肌生成(23,32).
本文的结果表明第18页该基因由两个启动子表达：一个主要用于增殖的未分化成肌细胞，另一个用于最终分化的未分化肌管细胞。上游启动子在分裂细胞中的优先表达导致更长的2.4-kb转录物和干扰翻译的长5′UTR。在细胞分化过程中下游启动子的激活导致较短的1.2-kb转录物的表达，该转录物更有效地翻译，进而负责p18蛋白的积累。我们的研究结果提出的一个关键问题涉及在细胞分化过程中调节p18启动子转换的未知机制。下游启动子可通过上游启动子的转录在增殖细胞中被抑制，然后在上游启动子关闭时默认激活。尽管当与瞬时转染的荧光素酶报告基因连接时，这两个启动子在增殖细胞内表现出类似的高活性，这种细胞培养系统使我们无法进一步确定上游启动子对下游启动子可能的抑制作用。或者，这两个发起人可以各自由一组不同的反式-影响因素。在任何一种情况下第18页基因将涉及一个特定的反式-监管因素。可以推测，调节p18表达的转录因子可能直接参与肌肉发生的控制，从而将末端肌肉细胞分化与细胞周期控制结合起来。在肌发生过程中差异表达的两个单独的p18启动子的发现和表征应该有助于鉴定这些转录因子。
