用改良抗CD3单克隆抗体刺激TCR可扩增CD8⁺T细胞群并诱导CD8⁺CD25型⁺特雷格斯

体外观察到的T细胞亚群变化与体内观察到的变化相对应。

在我们之前的I/II期试验中，通过在药物治疗1年后对混合耐受性试验保持或增加C肽反应来确定的临床应答者，发现CD4的比率降低⁺至CD8⁺循环CD8绝对数量增加导致的T细胞⁺T细胞(8,31). CD8数量增加的一个可能解释⁺T细胞是扩张的CD8⁺T细胞对潜伏病毒（如EBV）的激活作出反应，这可能是抗CD3单克隆抗体免疫抑制的结果。我们试验中的受试者包括EBV血清阳性和血清阴性个体，因此，如果T细胞亚群的变化与EBV的激活有关，我们预计只会在EBV血清阴性个体中发现。然而，情况并非如此（图​（图3A）。三A） ●●●●。与CD4相比⁺/CD8（CD8）⁺服用抗CD3单克隆抗体前的T细胞比率，CD4降低⁺/CD8（CD8）⁺在抗CD3单克隆抗体治疗后第90天，在EBV血清阳性和血清阴性个体中观察到T细胞比率，这表明EBV活化的细胞反应并不能解释体内观察到的变化。

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图3

接受hOKT3γ1（Ala-Ala）治疗的1型糖尿病受试者CD4/CD8 T细胞比率的变化与研究开始时EBV状态的关系，以及CD4变化之间的相关性⁺和CD8⁺在用抗CD3单克隆抗体培养的体外T细胞和用抗CD3-单克隆抗体治疗的体内T细胞。(A类)EBV血清阳性个体在接受hOKT3γ1（Ala-Ala）治疗3个月后CD4/CD8 T细胞比率与药物治疗前比率的差异(n个=12）或血清阴性(n个=7）在研究开始时确定。黑线表示组的平均值。EBV血清阳性和血清阴性受试者的CD4/CD8 T细胞比率（低于虚线）均下降。(B类)在单克隆抗体治疗1.5–2年后，对接受抗CD3单克隆抗体的1型糖尿病患者的外周血单个核细胞进行了研究，此时单克隆抗体处理后CD4/CD8 T细胞比率的变化已经消除。根据患者在12个月时与基线相比的C肽反应，将患者指定为临床反应者（填充圈）或无反应者（开放圈）。细胞用hOKT3γ1（Ala-Ala）培养，CD4的百分比⁺和CD8⁺6天后检测T细胞。计算皮尔逊相关系数以比较CD4的比率⁺/CD8（CD8）⁺体外T细胞与CD4分析^+/CD8（CD8）⁺单克隆抗体治疗3个月后体内T细胞(8)，并用相关程序SAS检验显著性水平(第页= 0.6;P（P）= 0.024). 该线表明了体内外变化之间的关系[体内CD4/CD8比率=0.174+0.865（体外CD4/CD8比率）]。

为了确定体外T细胞增殖对单克隆抗体的反应是否反映了体内细胞计数的变化，我们比较了CD4的比率⁺至CD8⁺用CD4抗CD3单克隆抗体培养T细胞⁺/CD8（CD8）⁺用单克隆抗体治疗后体内T细胞比率（图​（图3B）。三B） ●●●●。这些研究中使用的PBMC是在单克隆抗体治疗1–2.5年后从患者中分离出来的，此时CD4的变化⁺/CD8（CD8）⁺药物治疗3个月后观察到的T细胞比率已经恢复。CD4与⁺/CD8（CD8）⁺临床应答者和无应答者在用抗CD3单克隆抗体培养6天后的体外T细胞比率和12或14天疗程后3个月的体内T细胞比率(第页= 0.60;P（P）= 0.02). 这些发现表明，在体外观察到的T细胞亚群的变化确定了体内反应的个体差异。

CD4缺失⁺T细胞在抗CD3单克隆抗体培养过程中的增殖是由于CD8的存在⁺细胞。

调查CD8差异的基础⁺和CD4⁺T细胞增殖，我们耗尽CD8⁺或CD4⁺来自PBMC的T细胞，并用CFSE标记剩余的细胞。然后用hOKT3γ1（Ala-Ala）抗体培养这些细胞6天。如图所示​图4A，4A、 CD4⁺在CD8存在的情况下，T细胞没有广泛增殖⁺T细胞；然而，在没有CD8的情况下⁺T细胞，CD4⁺T细胞在抗CD3单克隆抗体刺激下增殖，并经历与CD8相似的多次分裂⁺单元格（图​（图4B）。4B） ●●●●。同样，在没有CD8的情况下⁺T细胞，活化标志物CD25在CD4上的表达增加⁺T细胞（图​（图4，4、C和D）。相反，CD8的模式⁺在缺乏CD4的情况下，T细胞增殖没有改变⁺T细胞。CD4增殖⁺和CD8⁺T淋巴细胞依赖于培养物中APC的存在，因为纯化的CD8⁺和CD4⁺仅T细胞对抗CD3单克隆抗体没有反应（数据未显示）。此外，CD4的失败⁺T细胞在CD8存在下增殖为CD3单克隆抗体⁺T细胞并不是由于抗TCR单克隆抗体的限量，因为TCR对CD4的包被和调节⁺细胞在CD8存在下使用的药物浓度下达到最大⁺单元格（未显示数据）。

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图4

CD4增殖反应降低⁺细胞对hOKT3γ1（Ala-Ala）的刺激仅在CD8存在时发生⁺但不是由于缺乏IL-2。CFSE标记的细胞在hOKT3γ1（Ala-Ala）存在下培养6天。用PE结合的抗CD4和抗CD25单克隆抗体对细胞进行染色，并在FACSCalibur流式细胞仪上进行分析。(A类和C类)散装PBMC。(B类和天)CD8耗尽的PBMC⁺T细胞。给出了6个独立实验的代表性结果。圆点上的数字A类和B类表示单元划分的数量。中的百分比C类和天代表CD4的百分比⁺CD25细胞⁺PBMC在无CD3抗体的情况下与抗CD3单克隆抗体一起培养(E类和如果)或存在(G公司和H（H）)重组IL-2（50 U/ml）。在培养物中添加IL-2可增强CD8的增殖⁺T细胞(E类和G公司)但对CD4没有影响⁺PBMC中的T细胞增殖(如果和H（H）). 给出了4个独立实验的代表性结果。

CD4缺乏增殖是可能的⁺T淋巴细胞是由于增殖的CD8消耗IL-2所致⁺细胞。例如，已有研究表明，添加外源性IL-2可以恢复某些“失能”细胞的增殖功能(33). 因此，我们测试了IL-2是否会导致CD4⁺将T细胞增殖与hOKT3γ1（Ala-Ala）一起添加到PBMC培养物中（图​（图4，4，E–H）。然而，添加IL-2（50 U/ml）后增殖没有增加，这表明CD4⁺在CD8存在下与单克隆抗体培养时，细胞对IL-2无反应⁺T细胞（图​（图4，4、F和H）。相反，CD8⁺当IL-2被添加到带有抗CD3单克隆抗体的培养物中时，来自相同培养物的细胞的增殖速度更快（图​（图4，4、E和G）。

用单克隆抗体hOKT3γ1（Ala-Ala）CD8培养后⁺淋巴细胞抑制抗原特异性反应。

这些研究表明CD8⁺受hOKT3γ1（Ala-Ala）刺激的PBMC培养物中的T淋巴细胞对自身CD4具有抑制活性⁺T细胞存在于同一培养物中。为了确定CD8⁺细胞也可以调节CD4⁺细胞对其他抗原产生反应，我们测试了活化CD8的能力⁺T细胞对CD4增殖反应的影响⁺T细胞感染破伤风类毒素。CD8（CD8）⁺从有或无hOKT3γ1（Ala-Ala）培养6天的PBMC中分离T细胞，照射并添加到CD8中⁺用破伤风类毒素冲击同一供体的T细胞耗尽的PBMC。细胞在CD8存在下培养3天⁺与CD8细胞相比，用抗CD3单克隆抗体激活的培养物中的T细胞对抗原的反应减少了60%⁺未与抗体一起培养的T细胞（图​（图5）5)CD4的抑制⁺T细胞反应取决于CD8的数量⁺培养物中的T细胞，在比率为1 CD8时仍很明显⁺每96个反应细胞中有一个T细胞。

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图5

CD8（CD8）⁺受hOKT3γ1（Ala-Ala）刺激的PBMC培养物淋巴细胞抑制破伤风特异性反应。将从新鲜PBMC（CD8无；白条）或在hOKT3γ1（Ala-Ala）（灰条）存在下培养6天的PBMC分离的CD8细胞照射并与耗尽CD8的新鲜PBMC混合⁺T细胞处于指定的比率。细胞在有或无破伤风类毒素存在的情况下培养3天。细胞增殖通过[^三H] 胸腺嘧啶核苷摄取，数据表示为有抗原和无抗原培养物之间的差异（每分钟计数）。背景计数（CD8应答细胞⁺无抗原细胞）范围为542至1796 cpm。给出了3个独立实验的代表性结果。

CD4的调节⁺CD8检测的T细胞⁺存在抗CD3 hOKT3γ1（Ala-Ala）单克隆抗体的T细胞依赖于细胞间接触。

确定是否抑制CD4⁺CD8增殖⁺细胞由可溶性因子介导，我们在PBMC和单克隆抗体hOKT3γ1（Ala-Ala）的培养物中添加了抗IL-10或TNF-α的中和单克隆抗体。这些单克隆抗体都不能逆转CD4的抑制作用⁺CD8存在下培养的细胞⁺细胞和抗CD3单克隆抗体。抑制CD4不需要TGF-β⁺T细胞，因为在两个单独的实验中，增殖CD4的水平⁺T细胞（占CD4总量的29.4%⁺当向培养物中添加抗TGF-β单克隆抗体时（当CD8的67%⁺T细胞增殖；数据未显示）。同样，添加CTLA4-Ig也不会增加CD4的增殖⁺即使添加了抗CD28单克隆抗体，T细胞对抗CD3单克隆抗体的反应也表明，B7配体通过CD28和/或CTLA4发出的信号并不介导抑制作用（数据未显示）。此外，没有证据表明CD4的死亡增加⁺用膜联蛋白V染色分析细胞（数据未显示）。我们通过分离CD4来测试是否需要细胞间接触⁺T和CD8⁺T细胞通过微孔Transwell膜，防止细胞接触（图​（图6）6)但允许中等汇率。CFSE标记的CD8缺失的PBMC⁺从CD4缺失的PBMC中分离上腔的T细胞⁺T细胞在下室培养，并在hOKT3γ1（Ala-Ala）存在的培养基中培养。CD4⁺当从CD8中分离出来时，T细胞对hOKT3γ1（Ala-Ala）产生增殖反应⁺T细胞的生长速度与在没有CD8的情况下培养的细胞相似⁺单元格（图​（图6，6，中间行），这表明调节需要细胞间接触。

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图6

CD4的抑制⁺CD8引起的细胞增殖⁺淋巴细胞不是由可溶性因子介导的。CFSE标记细胞在hOKT3γ1（Ala-Ala）存在下培养6天。用荧光结合抗表面标记单克隆抗体标记细胞，并用流式细胞仪进行分析。在CD4上对直方图进行门控⁺淋巴细胞。所示为PBMC（顶面板）、由Transwell膜从CD4缺失的PBMC（中面板）中分离的CD8缺失的PBMCs和CD8缺失PBMCs（底面板）。每个直方图中的数字代表CD4的百分比⁺CFSE稀释的细胞。结果代表了4个独立实验。

CD8的表型和细胞因子产生谱⁺用hOKT3γ1（Ala-Ala）刺激后的T细胞。

我们研究了活化和其他细胞表面标记物的表达，以及用hOKT3γ1（Ala-Ala）培养的T细胞亚群产生的细胞因子。在没有抗体的情况下，CD8⁺T细胞不表达活化标记CD25或CD69。大多数未刺激CD8⁺表达CD28的T细胞中，60-80%为原始表型（仅CD45RA），约15%仅表达CD45RO。用抗CD3单克隆抗体培养后，CD8上CD25的表达增加⁺细胞在24小时内表达，第2天出现峰值（图​（图7A）。7A） ●●●●。CD25在增殖（27.3%±13.3%）和非增殖（15.6%±5.3%）CD8上均有表达⁺T细胞(n个=3个单独的实验）。CD8⁺T细胞失去了原始表型，大多数细胞（60-80%）表达CD45RO。CD8⁺用抗CD3单克隆抗体刺激的T细胞显示细胞内CTLA4的表达增强，尤其是CD25⁺CD8（CD8）⁺单元格（图​（图7B）。7B） ●●●●。通过细胞内染色评估，CD8⁺T细胞不产生IL-2或IFN-γ，但用抗CD3单克隆抗体培养6天后，约2%的CD8细胞中检测到IL-10。然而，当通过RT-PCR分析细胞因子基因转录物时，在一些但不是所有的实验中发现IL-10的表达增加，即使在分类的CD8亚群中也是如此⁺对细胞进行了研究。因此，在活化的CD8中，细胞因子基因表达增加不是一个一致的发现⁺T细胞。

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图7

CD25的诱导⁺用hOKT3γ1（Ala-Ala）刺激CD8细胞的数量。(A类)新鲜分离的PBMC在hOKT3γ1（Ala-Ala）存在下培养6天。为了分析CD25的表达，在培养的第0天（刺激前）、第1天、第2天、第3天和第6天收集细胞，用氟铬偶联抗CD8和抗CD25标记，并用流式细胞仪进行分析。结果以CD8的比率表示⁺CD25型⁺-表达细胞至总CD8⁺细胞。显示了4个独立实验的平均值（±SEM）。(B类)流式细胞术分析CTLA4的细胞内表达。左：门控CD8淋巴细胞；右上：门控CD8⁺CD25型⁺细胞；右下：门控CD8⁺CD25型^–细胞。显示了3个独立实验的代表性结果。CTLA4CV、CTLA4 CyChrome。

CD8（CD8）⁺CD25型⁺细胞负责抑制CD4抗原特异性反应⁺T细胞。

我们试图识别标志CD8的标记⁺负责调节抗原反应CD4的T细胞⁺T细胞。在我们最初的实验中，细胞内CTLA4的表达与CD8细胞表面CD25分子上调之间的关系引导我们研究这一群体的功能。因此，CD8⁺CD25型⁺和CD8⁺CD25型^–CD8的种群⁺用抗CD3单克隆抗体培养6天后，从PBMC中分离T细胞，并测试其抑制葡萄球菌肠毒素B（SEB）抗原特异性反应的能力（图​（图8，8、A和B）。作为对照，CD8⁺将来自自体PBMC的T细胞添加到培养物中。当照射CD8时，超抗原对增殖的抑制作用是6倍⁺CD25型⁺但不是CD8⁺CD25型^–添加了个单元格（图​（图8A）8A） CD8存在时，培养上清液中IFN-γ的释放较低⁺CD25型⁺T与CD8相比⁺CD25型^–T细胞（图​（图8B）。8B） ●●●●。CD8对SEB-特异性CD4细胞扩增的抑制作用⁺CD25型⁺克隆水平的细胞也可见。我们分析了Vβ3阳性CD4细胞在6天共培养中的扩增。在含有CD8的培养物中，Vβ3阳性CD4细胞的数量减少了50%以上⁺CD25型⁺与未激活CD8细胞的培养物进行比较（图​（图8C）。8C） ●●●●。因此，这些结果表明诱导的CD8⁺CD25型⁺T细胞可以调节抗原特异性反应。

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图8

CD8⁺CD25型⁺hOKT3γ1（Ala-Ala）诱导的细胞抑制CD4细胞对SEB和IFN-γ分泌的反应。(A类)CD8细胞⁺CD25型⁺或CD8⁺CD25型^–用hOKT3γ1（Ala-Ala）或CD8刺激来自PBMC的细胞6天⁺将新鲜PBMC的细胞进行辐照，并与在SEB存在下耗尽CD8的新鲜PBMC共培养3天。增殖反应评估方法为[^三H] 胸苷摄取。(B类)使用Luminex系统，使用Th1/Th2复合微球，测量相同培养物上清液中的IFN-γ水平。给出了两个独立实验的代表性结果。(C类)已排序CD8⁺CD25型⁺在SEB存在的情况下，以1:2的比例将（底部面板）或未经处理的CD8细胞（上部面板）与CFSE标记的、CD8缺失的PBMC共培养6天。流式细胞术分析SEB特异性克隆扩增。Vβ3阳性CD4（M1）淋巴细胞的扩增率从Vβ3的46.1%降至15.5%⁺T细胞。在另外两项研究中也获得了类似的结果。

CD8（CD8）⁺CD25型⁺细胞表达Foxp3。

我们的研究表明CD8的调节功能⁺抗CD3单克隆抗体刺激后的细胞涉及CD8亚群⁺CD25型⁺用抗CD3单克隆抗体培养期间诱导的T细胞。因此，我们询问是否诱导监管CD8⁺CD25型⁺T细胞与Foxp3在这些细胞中的表达有关。我们用抗CD3单克隆抗体培养PBMCs 6天，并对CD8进行分类⁺细胞进入CD25⁺和CD25^–亚群体。Foxp3系列通过实时PCR分析表达（图​（图9A）9A） 和Western blotting（图​（图9B）9B）(29).Foxp3系列CD8的表达增加了10到40倍⁺CD25型⁺T细胞与CD8比较⁺CD25型^–或未活化的CD8⁺单元格(P（P）≤ 0.02). 在初步研究中，我们发现Foxp3系列CD8中的转录本⁺CD25型⁺T细胞大约是Foxp3表达的九分之一，相对于间隙，单位为CD4⁺CD25型⁺用抗CD3单克隆抗体培养6天（CD8⁺CD25型⁺与CD4相比，102±56个任意单位⁺CD25型⁺，931±98个任意单位；P（P）< 0.05). 这些研究表明，CD8⁺CD25型⁺被诱导的T细胞具有功能性抑制作用，并表达Foxp3，这是一种与免疫调节T细胞相关的转录因子。

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图9

CD8中Foxp3表达增加⁺CD25型⁺hOKT3γ1（Ala-Ala）诱导的细胞。(A类)PBMC与hOKT3γ1（Ala-Ala）培养6天，并根据CD25的表达进行分类。Foxp3系列通过实时定量PCR检测表达。结果如下所示Foxp3系列基因表达归一化为GAPDH表达，CD8的结果⁺CD25型⁺或CD8⁺CD25型^–将细胞与新鲜分离的CD8细胞进行比较⁺来自同一受试者的T细胞。显示了4个独立实验的平均值（±SD）**P（P）≤ 0.02. (B类)研究Foxp3在CD8中的表达⁺CD25型⁺和CD8⁺CD25型^–通过Western blotting检测来自相同培养物的细胞，并在CD8中检测到较高水平的细胞⁺CD25型⁺细胞。

细胞分离和T细胞培养条件。

人外周血单个核细胞是从棕色皮毛、志愿者（卑尔根社区区域血液中心）或hOKT3γ1（Ala-Ala）临床试验参与者的肝素化全血中分离出来的。该临床试验的设计和初步数据之前已经公布(8,31). CD4的分析⁺和CD8⁺本研究在基线检查时以及单克隆抗体治疗后1个月和3个月对药物治疗受试者进行T细胞亚群检测。EBV血清状态不是本研究的进入标准，但通过ELISA对19/21名受试者进行回顾性检测：12名药物治疗受试者被发现为EBV IgG⁺，发现7名受试者为EBV IgG^–在注册时。经抗CD3单克隆抗体治疗后，药物治疗的受试者均未出现EBV重新激活的临床症状或体征。这项研究得到了哥伦比亚大学机构审查委员会和合作机构的批准。哥伦比亚大学机构审查委员会批准使用患者样本。

在抗CD3单克隆抗体12天疗程的最后一天和之前，分离并冷冻研究参与者的PBMC(n个=3）或，如果是1人，则在药物治疗前和10周后。同时从2月2日的1型糖尿病对照患者中收集PBMC(n个=3）或3(n个=1）场合和冻结。

根据制造商的说明，使用磁珠（Dynal Biotech）对CD8或CD4细胞进行阳性分离或去除。我们发现，通过这种方法，在细胞耗尽后染色，96-100%的CD4或CD8细胞从PBMC中耗尽。用于隔离CD8⁺将患者和对照组的T细胞解冻，首先对T细胞进行阴性选择，然后对CD8进行阳性选择⁺带有磁珠的电池。CD8⁺以这种方式分离的细胞置于TRIzol（Invitrogen Corp.）中，用于Foxp3表达的实时分析。

PBMC，耗尽CD8的PBMC⁺CD4缺失的细胞或PBMC⁺细胞在无血清AIM-V培养基中重新悬浮（Invitrogen Corp.）（2×10⁶细胞/ml）在37°C和5%CO条件下，在指定浓度的hOKT3γ1（Ala-Ala）存在下培养5-7天₂在某些实验中，向培养物中添加中和IL-10、TNF-α或FasL（10μg/ml）或rIL-2（50 U/ml）的单克隆抗体。

CFSE标签。

PBMC在37°C的PBS中用5μM CFSE（Invitrogen Corp.）染色15分钟，然后洗涤，再悬浮在AIM-V培养基中，再培养30分钟。将标记的细胞洗涤、计数并重悬在AIM-V培养基中用于细胞培养。

流式细胞术。

电池（1×10⁵/样品）用FACS染色缓冲液（PBS，2%FBS或1%BSA，0.1%叠氮化钠）洗涤，并在4°C下用制造商推荐浓度的氟铬结合单克隆抗体染色30分钟。在使用CellQuest 3.3版软件（BD Biosciences）在FACSCalibur流式细胞仪中进行分析之前，用1%多聚甲醛清洗细胞并固定。对于IL-2、IL-10、IFN-γ和CTLA4表达的细胞内染色，刺激细胞在高尔基球蛋白（BD Biosciences）存在下培养。在室温下，用Perm Buffer（BD Biosciences）渗透表面标记和固定细胞15分钟。细胞在4°C下与荧光染色结合单克隆抗体孵育30分钟，清洗，并在流式细胞仪中进行分析。

单元格排序。

在不含叠氮化钠的无菌FACS染色缓冲液（PBS，2%FBS）中，用荧光结合抗细胞表面分子抗体标记细胞，并使用FACSAria（BD Biosciences）进行清洗和分类。从新分选的细胞中分离出RNA，或者对细胞进行辐照并添加到功能分析中。

Transwell实验。

在6孔板（孔径0.4-μm；Costar，Corning Inc.）中进行Transwell实验。CFSE标记的PBMC缺乏CD4⁺细胞被放置在下室，PBMC耗尽CD8⁺在5μg/ml hOKT3γ1（Ala-Ala）存在下，将细胞置于无血清培养基的上腔中5-6天。同时，控制未耗尽的PBMC和耗尽CD8的PBMC⁺以上述相同方式刺激的T细胞在不同的孔中培养。在培养结束时，用荧光结合抗CD4单克隆抗体标记细胞，并进行流式细胞术分析。

[^三H] 胸苷掺入试验。

在96周的圆底平板上进行增殖试验。电池（1×10⁵/well）在破伤风类毒素（10μg/ml）、SEB（1μg/ml。[^三H] 在培养结束前18小时添加胸腺嘧啶核苷（1μCi/孔；PerkinElmer）。收集细胞，并在Wallac MicroBeta计数器（PerkinElmer）中计算合并的放射性。

Foxp3表达的Western blot分析。

分离的T细胞在PBS中洗涤，在NuPAGE LDS样品缓冲液（Invitrogen Corp.）中溶解，并在5×10变性条件下在10%Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（Invit罗gen Corp）上分离⁵每条车道的单元数。蛋白质被转移到硝化纤维素膜（Invitrogen Corp.），在TBS中用0.1%吐温-20和3%脱脂奶粉（Sigma-Aldrich）封闭后，用多克隆兔抗人Foxp3（1:2000）和HRP-结合山羊抗兔二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）对其进行探测。ECL化学发光系统（Amersham Biosciences）检测到特定信号。洗涤印迹并用抗β-微管蛋白抗体重新处理。

Foxp3总RNA的分离和实时PCR分析。

分析Foxp3系列如前所述，通过实时PCR进行表达(29). 简言之，从新鲜PBMC CD8中分离出RNA⁺使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）从PBMC分离的T细胞或从hOKT3γ1（Ala-Ala）刺激细胞中分离的亚群。用于实时PCR的引物由Invitrogen Corp.根据公布的序列合成(29)：GAPDH:5′-CACACATCGCTCAGACCAT-3′和5′-GGCAACATACCATTTACCAGT-3′；CD8:5′-CCCTGAGCAACTCCATCATGT-3′和5′-GTGGGCTTCGCTGGCA-3′；Foxp3:5′-GAACAGCACATTCCCCAGAGTTC-3′和5′-ATGGCCCCAGCGGAG-3′。结果表示为Foxp3系列表达式规范化为间隙或CD8，如前所述，用于激活的CD8⁺T细胞(52,53).

这项工作得到了NIH拨款DK57846、AI-98-010、DK063608和RR00645的支持。