非线性结构照明显微镜：理论上分辨率无限的宽场荧光成像

摘要

荧光显微镜凭借其独特的能力，可以用具有极端特异性的多色分子标记对活体标本的3D内部进行成像，这是电子显微镜和扫描探针法等高分辨率技术所没有的优势组合，因此已成为细胞生物学中普遍存在的成像工具。因此，不幸的是，它的空间分辨率受到衍射造成的严格限制。

最近，人们发现了绕过衍射极限的方法。通过使用受激发射耗尽（STED）实现了30 nm范围内的2D分辨率(1). STED基于使用两个同步超快激光源的饱和受激发射(2,三); 基本概念已被推广到包括一类可逆饱和现象(4). STED和其他拟议方法(5–7)是在激光扫描显微镜的背景下构思的，旨在直接最小化扫描焦点的尺寸。本文演示了一种替代方法，通过使用非线性荧光响应和填充视野的周期照明模式，为宽视野（非扫描）显微镜带来理论上无限的分辨率。

当然，结构照明光和光学非线性都是既定的概念。例如，图案光已被用于测量表面形状(8)和变形(9)以及提高光漂白后荧光恢复实验的灵敏度(10). 轴向结构光已被用于提高驻波荧光显微镜的轴向分辨率(11)，4Pi显微镜(12)、和我⁵M（M）(13). 卢科什和马尔坎德(14)1963年提出可以使用横向光图案来提高分辨率，这种图案已经用于两个轴向(15)和横向(16–19)分辨率增强。在检索高分辨率信息时，它们比点扫描更有效(17,19). 非线性荧光是多光子荧光显微镜的基础(20)以及其他一些经典的光学非线性(21)在这两个远场也有应用(22,23)和近场(24)显微镜检查。

结构照明可以提供分辨率扩展的原因是，它可以以低分辨率莫尔条纹的形式呈现其他无法解析的高分辨率信息(图1). 这种效应的强度与图案的空间频率成正比；非线性的作用是将高频谐波引入有效模式，从而增加其分辨率增强功率。

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图1。

通过莫尔效应扩展分辨率。如果样本结构未知(一)乘以已知的规则照明图案(b条)，将出现节拍图案（莫尔条纹）(c（c）). 莫尔条纹出现在图案频率和样品结构的每个空间频率分量之间的空间差频率处，并且可以足够粗糙，以便通过显微镜观察，即使原始未知图案无法解析。其他不可观测的样本信息可以从条纹中推导出来，并通过计算进行恢复。

因为非线性不必锐化焦点，所以可以利用更大类的物理现象。事实上，最近有人指出(25)该方法甚至可以使用激发态本身的简单饱和。这种众所周知的效应（事实上，一旦照明强度足以将大多数荧光团分子提升到激发状态，额外强度的增加将不会产生与发射速率成比例的增加）发生在所有荧光团中，并且可以用单个廉价光源诱导。它不适合点扫描，因为它会加宽而不是锐化焦斑，但这在扩展模式方法中不是问题。

以下章节通过实验演示了饱和结构照明显微镜（SSIM），作为非线性结构照明显微镜更一般概念的一个例子，并表明它可以实现<50 nm的二维分辨率。

原理

经典分辨率限制规定了最大空间频率k个₀可以通过显微镜观察到。对于光学显微镜，k个₀= 2不适用/λ_{相对长度单位}，其中λ_{相对长度单位}是观测波长不适用是物镜的数值孔径(26). 如果在2D频率空间中描述样本的频率内容，则此限制定义了“可观察区域”（半径为的圆k个₀围绕原点）。在传统显微镜下，基本上无法观察到该区域以外的信息。分辨率扩展的目标是使某些信息可见，即扩大可观察区域。

结构照明显微镜通过将信息以莫尔条纹的形式从频率空间的其他地方移动到可观察区域，从而将分辨率扩展到截止点以外。每当两个信号相乘时，混频就会产生莫尔条纹。在这种情况下，倍增是荧光固有的：观察到的发射强度是荧光染料（即样品）的局部密度和激发光的局部强度的乘积。

如果照明包含空间频率k个₁，然后是每个采样频率k个在不同频率处产生莫尔条纹k个–k个₁.如果满足以下条件，则可以在显微镜上观察到这些条纹|k个–k个₁| <k个₀，也就是说，如果k个位于半径的圆内k个₀围绕k个₁(图2). 因此，该圈内的信息已被间接观察到；它可以用相移法提取(17). 新信息增加了最高可观测空间频率（分辨率）k个₀到k个₀+k个₁因此，为了最大化分辨率，照明最好包含高空间频率k个₁尽可能地。不幸的是，在光场中产生的空间频率集受到衍射的限制，就像可以观察到的频率集一样。因此，k个₁不能设置为大于2不适用/λ_交易所≈k个₀，所以新的分辨率限制k个₀+k个₁最多可达≈2k个₀因此，普通、线性、结构照明显微镜（以及共焦显微镜，这是结构照明的一种特殊情况）只能将分辨率提高约2倍。

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图2。

结构化照明概念。(一)传统显微镜可以观察到的一组样本空间频率定义了一个半径为k个₀在频率空间中。(b条)如果激发光包含空间频率k个₁一组新的信息以莫尔条纹（阴影圆）的形式出现。该区域与正常可观察区域形状相同，但中心位于k个₁。（在这个方向上）可以检测到的最大空间频率为k个₀+k个₁.

然而，如果发射率可以非线性地依赖于照明强度，那么即使是这个新的限制也可能被超过。这种非线性将导致有效照明模式包含空间频率为k个₁.频率为2的组件k个₁将使分辨率提高两倍于线性方法，a 3k个₁如果非线性可以用多项式描述秒，它将产生秒–1个新谐波。因此，非多项式非线性（即具有无限泰勒级数）会产生无限数量的谐波，对应于理论上的无限分辨率。当然，实际的分辨率是有限的，但只受信噪比和光稳定性等“软”问题的限制，而不受任何硬限制。

本文讨论的特殊非线性现象是激发态饱和S公司₁，参考文献。25在正常的荧光过程中，处于电子基态的荧光团分子S公司₀被激发到第一激发态S公司₁通过在λ处吸收光子_交易所然后衰变回S公司₀在λ处发射光子的平均时间τ（荧光寿命）后_{相对长度单位}显然，每个分子平均每寿命τ最多只能发射一个光子。因此，它不能对每个吸收截面上每个寿命超过一个光子的照明强度作出线性响应(图3一). 如果样品被峰值强度接近或高于该阈值的正弦光模式照亮，则每个荧光团的发射率模式呈非正弦形状(图3b条)，它包含比照明模式本身具有更高空间频率的所需谐波序列(图3c（c）).

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图3。

非线性荧光产生谐波。(一)饱和状态下荧光发射率与照明强度的非线性关系。(b条)峰值脉冲能量密度为饱和阈值0.25、1、4、16和64倍的正弦模式照明产生的发射模式。(c（c）)这种发射模式的每个傅里叶分量的振幅作为照明脉冲能量的函数（对数标度）。等效地，曲线表示来自照明模式的每个谐波的图像信号的分数。随着照明能量的增加，越来越多的谐波开始起作用（较低的曲线）。计算使用光的标量模型，用于稳态照明(一)实验中使用的脉冲长度为0.64ns，实际荧光寿命为3.5ns(b条和c（c）).

如果样品被这样一个扭曲的图案照亮，观察到的图像将是几个信息分量的叠加，每个信息分量在频率空间中的位移量与图案中每个傅里叶分量的空间频率相对应(图4d日). 模式谐波的数量，以及由此产生的信息分量的数量，原则上是无限的。然而，实际上，只有有限的数字米信息分量的强度足以上升到噪声水平以上。

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图4。

非线性结构照明的分辨率扩展。(一)通过常规显微镜观察到的频率空间区域（与图2一). (b条)正弦照明模式的示例。(c（c）)该照明模式有三个频率分量：一个位于原点（黑色），代表平均强度，另两个位于±k个₁，表示调制（深灰色）。这些也是线性（即非饱和）结构照明下有效激励的频率分量。在饱和或其他非线性效应的条件下，理论上在有效激励中会出现无限多的附加分量；这里显示了三个最低的谐波（浅灰色）。(d日)基于这三种最低谐波的常规显微镜（黑色）、线性结构照明（深灰色）和非线性结构照明显微镜（浅灰色）的可观察区域。(e（电子）)如果与其他模式方向重复该过程，则显示相应的可观察区域。可观测空间频率的更大区域(e（电子）)与中所示的相比一使重建样本的空间分辨率相应提高成为可能。

观察到的图像是这些图像的总和米替换了信息组件。要将分量移回它们在频率空间中的真实位置，必须首先对它们进行分离，这不能基于单个图像来完成。然而，如果图案发生偏移（即，其相位改变了一些角度），并且获得了第二个图像，则该图像是相同分量的总和乘以e（电子）^我ϕ。第二个图像表示米组件。如果米或者在不同的相移下获得更多的图像，方程（图像）的数量与未知量（信息分量）的数量一样多；因此，可以通过反转米×米矩阵并将逆像素沿堆栈应用于米图像。自然选择米相位从0到2π等距分布，分离矩阵变得等效于相对于相移变量的离散傅里叶变换。

如果照明光子通量我应用于吸收截面σ为发射率的荧光团E类将随时间呈指数增长吨走向平衡：E类∝ [我σ/(我σ +k个_（f）)]{1–经验[–(我σ +k个_（f）)吨]}，其中k个_（f）=1/τ是荧光衰减率。因此，对于稳定照明或长脉冲（脉冲长度吨_第页>>τ），强度依赖性E类是有理函数[我σ/(我σ+k个_（f）)]，而短脉冲(吨_第页<<τ）产生指数依赖性E类■{1–exp[–(我σ +k个_（f）)吨_第页]}，这在产生谐波方面更加有效。在这项工作中，选择了0.64 ns的脉冲长度，这比2-4 ns的典型寿命短，但不会短到涉及可能增加非线性损伤过程风险的极端场强。

测量

光源是一个双频被动调Q二极管泵浦的固态激光器（北卡罗来纳州夏洛特的诺斯罗普·格鲁曼理工大学），是一种只有22毫米长的微芯片设备。该激光器在532 nm的波长和6 kHz的重复频率下产生了3.6μJ的脉冲，持续时间为640-ps。到达样品的脉冲能量由基于偏振的可变分束器调节。

在所有实验中，照明图案通过一个×100/1.4数字孔径平面复消色差油浸物镜投影到样品上，该物镜也用于通过二向色镜和580-630-nm带通滤波器将样品成像到冷却的电荷耦合器件相机上。

饱和演示。进行了初步实验，证明饱和会产生谐波。通过将激光穿过透射相位光栅，并将光栅的去放大图像投影到样品上，产生平行线图案。选择的模式周期（2.5μm）比分辨率极限（0.19μm）粗得多，以便能够直接观察模式及其若干谐波。通过只允许光栅的衍射级+1和-1到达样品，使线型图案纯正弦（除了激光束的整体高斯轮廓）。这两束光束在样品中以一定角度相交，产生正弦干涉图案（相当于去放大的光栅图像）。

通过在水中稀释直径为120-nm的微球（分子探针）悬浮液，并在盖玻片上使一滴悬浮液风干，制备出有效均匀的薄层样品。调整液滴的浓度和体积，以便在干燥步骤中形成封闭的单层区域。这种单层膜在传统显微镜下看起来没有特征，因为它的周期性nm无法解析。干燥后，将样品装入甘油基培养基中。

荧光层样品由上述线谱调制高斯光束照明。图像曝光0.1秒，对应≈600个激发脉冲。在0.58 mJ/cm的相对较低峰值能量密度下²，观察到的发射模式近似正弦(图5一，底部轨迹），不偏离照明强度模式。在37 mJ/cm的较高峰值能量密度下²然而，排放模式发生了巨大变化，出现了宽而平的峰值和尖锐而窄的谷(图5一，顶部痕量），因为荧光在高强度区域饱和。这种行为在质量上与预期相符(图3b条). 对这种模式的傅里叶分析显示出五种可检测的谐波，其空间频率高于照明频率(图5b条，顶部轨迹）。最低谐波也出现在较低的脉冲能量上(图5b条，底部轨迹），表明荧光响应明显非线性，因为在该能量密度下已经存在饱和效应。

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图5。

通过饱和验证谐波产生。(一)周期为2.5μm，脉冲峰值能量密度为0.58 mJ/cm的正弦条纹调制的高斯激光束照射薄荧光层的图像轮廓²（底部曲线）和37 mJ/cm²（顶部曲线）。底部曲线大致遵循正弦照明模式，因为峰值能量密度低于饱和状态。在顶部曲线中，较高的脉冲能量导致荧光在图案的峰值附近饱和，从而形成具有宽峰和锐谷的不对称曲线形式。（由于观测光学系统的模糊，预计观测谷不会达到零，并不一定意味着实际强度最小值不为零。）(b条)与中所示轮廓对应的傅里叶变换一显示高能模式中的五个可检测谐波（箭头）。在低能模式（箭头）中只能检测到最低谐波。纵轴为对数（以10为底）；中的曲线b条为了清晰起见，已垂直分开。

SSIM分辨率测试。用于测试实际SSIM显微镜的硬件与上述硬件类似，只是通过增加光栅到样品的脱木质素程度来缩短线型图案的周期。除了脉冲光源外，该装置还与早期用于线性结构照明的装置类似(17,18). 对应于+1和-1衍射级的两束光束在物镜后焦平面孔径的相对边缘附近重新聚焦，从而在样品中以最大角度交叉，产生最大空间频率的干涉图样。产生的照明图案的周期为0.20μm，接近该波长下0.19μm的理论极限。这种图案的方向和相位是通过旋转和横向平移光栅来控制的。光栅位置的电容传感指的是围绕压电可移动光栅支架的固定圆柱形对电极，允许在任何模式方向上以亚纳米级再现性控制模式相位。为了使图案对比度最大化，在旋转台上使用共转线性偏振器对干涉光束进行s偏振；入射光束是圆极化的，因此工作台的旋转不会影响脉冲能量。

通过将直径为50 nm的荧光聚苯乙烯微球沉积在盖玻片上并用甘油基固定介质覆盖，制备分辨率测试样品。该样品在5.3 mJ/cm的脉冲能量密度下被线条图案照亮²曝光时间为0.15s（900脉冲）。在这些参数下，预计只有模式的前三次谐波是不可忽略的，对应于总共九个叠加的信息分量(图4c（c）和d日). 因此，获得了九幅图像序列，图像之间的模式相位提前了2π/9弧度。将分离矩阵应用于这九个相位图像，产生了源自九个频率空间区域的九个分离信息分量，如图4d日对被π/12弧度分隔的12个不同方向的图案重复此过程，以从频率空间的近似圆形区域检索完整信息(图4e（电子）).

通过比较重叠的不同信息成分，从数据中确定图案的精确方向、行距和起始相位。模式的调制深度和每个谐波（或者，等价地，各种信息成分之间的相对比例因子）也可以通过这种方式确定，正如线性结构照明显微镜所做的那样(17,18). 在实践中，人们发现最好在经验基础上手动输入调制深度值，因为最高信息分量中的信噪比水平不足以可靠地自动确定调制深度。使用性能良好的显微镜，可以将所有这些参数视为已知的系统常数。

处理过程也与参考文献中所述类似。17除了相位图像、信息分量和模式方向的数量增加之外。通过计算将分离出的信息分量移动到其在频率空间中的真实位置。这个向量的转换k个₁在互易空间中实现为与相应复数波的乘法e（电子）^我k个₁^·x个在真实空间中，以便不约束k个₁傅里叶变换数据的整数像素。将这些分量补偿为显微镜的已知光学传递函数，并在它们重叠的地方通过加权平均值（权重与局部噪声方差成反比）进行组合。在平均值的分母中引入了一个加法常数(17,18)抑制低信噪比区域，如维纳滤波器(26). 当所有组件以这种方式重新组合成一个单一数据集时，会施加一个三角形切趾函数，以最小化放大的可观察区域硬边可能导致的振铃。最后的重建是通过将切趾数据集重传给实际空间来实现的。在处理过程中，像素尺寸减小，从原始数据图像中的90 nm减小到重建中的9 nm，以适应增加的分辨率。通过使用更少的信息分量计算比较重建，并相应调整切趾窗口的大小。

结果重建的子集如所示图6d日，这表明与传统显微镜相比，分辨率显著提高(图6一). 为了进一步比较，图6c（c）显示了基于相同数据的重建，但仅包括中心和一阶信息分量；因此，该结果代表了线性结构光显微术在不考虑饱和效应的情况下的分辨率。图6b条类似地，显示了仅使用中心信息成分的重建，表示传统显微镜，然后使用线性滤波器，使结果与处理的数据直接可比。

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图6。

用常规显微镜成像的50纳米荧光珠场(一)，常规显微镜加过滤(b条)，线性结构照明(c（c）)，以及使用5.3 mJ/cm的照明脉冲进行饱和结构照明²能量密度，考虑处理过程中的三个谐波阶数(d日). 因为不需要扫描，所以可以同时对宽场进行成像。

连续的分辨率增强在图6例如，场中心的小团簇在常规图像中几乎不成形，但在线性结构照明显微镜的帮助下被视为一个明显的分支棒状，并且在使用非线性饱和效应时被分解为19个单独的珠子。

为了量化该方法的分辨率，测量了50nm隔离珠的强度分布(图7)，并确定其半最大宽度（FWHM）。100个此类剖面的平均半高宽为58.6±0.5 nm，比未过滤传统显微镜的265 nm横向半高宽提高了5.5倍(图7，虚线轨迹）。然而，FWHM值低估了分辨率，因为物体不是点光源，而是有限直径的珠（制造商规定为51 nm）。为了估计真实的点分辨率，通过线性反褶积将已知的珠子形状从重建中删除（即，重建的傅里叶变换被51-nm球体的傅里叶变换分割并重新变换），并如上所述测量100个珠子轮廓。该校正数据集中的平均半高宽（即估计的点分辨率）为48.8±0.5 nm。

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图7。

通过SSIM（固体示踪）和传统显微镜（虚线示踪）获取的分离50nm红色荧光珠图像的侧面轮廓。（SSIM轮廓中沿基线的结构是由噪声引起的。）100个此类SSIM剖面通过不同珠子的平均半高宽为59 nm，与未处理的常规显微镜的265 nm宽度相比，大幅降低。

讨论

适用性。可以在图中所示的水平上获得分辨率。​图66和​和77在细胞中实现？就SSIM而言，主要障碍是，与正常照明强度相比，在饱和条件下，至少一些荧光团的光漂白速率似乎会加快（换句话说，每个分子在被破坏之前可以发射的光子数量似乎较小）。同时，与单个传统图像相比，给定信噪比所需的检测光子数量大大增加[图案方向的数量乘以傅立叶系数的平方倒数（如图3c（c）)使用的最高谐波]。初步测量中观察到的光稳定性[例如，≈50000个DNA染色剂Po-Pro-3（分子探针）的每个分子发射光子，安装在氧气耗尽介质中，暴露在峰值脉冲能量为其估计饱和阈值九倍的光模式下]理论上支持2D中50 nm的两点分辨率，信噪比高于1，即使每个点仅由单个分子组成。然而，在实际操作中，SSIM可能会要求样品贴上明亮的标签，并具有可拍照的特性。确实存在高度光稳定性的荧光标签，包括几种类型的纳米颗粒(27–29). 例如，已知含有氮空位色心的金刚石纳米晶在连续饱和条件下发光数小时而不漂白(28).

我们已经讨论了2D成像，但SSIM的概念和一般的非线性结构照明显微镜很容易推广到3D，就像线性情况一样(17,18)原则上，可以在所有三个方向上提高分辨率。当然，荧光团的光稳定性要求随着节数的增加而进一步增加。由于该方法依赖于干净的强度零点，因此它对样品诱导的像差也比传统显微镜更敏感。

一个重要的问题是该方法在多大程度上适用于活样本。除了光漂白之外，主要关注的是样本运动：这里描述的简单数据处理假设，在采集期间，样本结构是固定的，在提高的分辨率给出的公差范围内。对于中所示的数据集图6，这意味着在许多秒内运动<50 nm。许多细胞内过程涉及更高的速度。因此，现场成像很可能仅限于缓慢移动的结构。

光损伤一直是活标本关注的问题。此处使用的光强度比活体标本双光子显微镜常用的光强度低3个数量级以上，但饱和条件可能会增加光毒性。

另类非线性现象。应该强调的是，这里使用的非线性，第一激发态的饱和S公司₁这只是发射率对照明强度非线性依赖的一般概念的一个例子。上述相同的处理和采集方案同样适用于其他非线性效应，唯一的要求是要提供高分辨率，非线性必须是非多项式或高阶的。

最经典的非线性光学现象(21)例如谐波产生是相干的，因为在样品的不同点产生的光波具有固定的相对相位，因此相互干扰。这种相干性导致观察到的图像与样品结构之间的关系不如荧光直接，因为从不同样品点发射的光波相互不相干，因此它们的强度只是相加。本文仅涉及荧光案例。

多光子吸收荧光(20)是一种经典的非线性现象，它确实产生非相干发射光，因此符合本文描述的框架。双光子荧光具有二次非线性，因此可以将分辨率扩展为相同波长线性结构照明的两倍。然而，该因素具有误导性，因为它指的是恒定照明波长下的比较。实际上，双光子显微镜使用的照明波长几乎是相同荧光团线性激发所用照明波长的两倍，而这两倍的因子抵消了非线性的分辨率加倍。因此，双光子荧光没有显著提高分辨率，同样的论点也适用于更高阶的多光子吸收。

一种被提出的称为“基态耗尽”的显微镜方法与目前的方法有关，但它使三重态饱和，而不是使单重激发态饱和(5). 因为三重态与光漂白有关(30)，在这种状态下蓄意积累分子是没有吸引力的。另一方面，在本方法中，通过以与三重态寿命相比较慢的脉冲重复率操作，可以在很大程度上避免累积到三重态。

然而，存在一些非线性效应，包括受激发射损耗，这些效应有望获得极高的分辨率(1–三)，特别设计的荧光团中的能量转移(6)和分子的可逆光活化(4,31–35). 最后一类特别有趣，因为一些有希望的分子是GFP家族的蛋白质(32–35)提出了一种令人兴奋的可能性，即非线性结构照明显微镜的极端分辨率可以与体内类GFP基因编码蛋白标签的标记能力。

结论

SSIM使用单个廉价激光器提供原则上无限制分辨率的荧光成像。实际上，它的最终分辨率取决于测量信噪比，而信噪比又受到光漂白的限制。在珠样品上实现了<50 nm的2D点分辨率。该方法是非线性结构光显微术的一般概念的一个例子，它有潜力为宽场光学显微术研究开辟一个新的纳米尺度领域。

致谢

笔记

作者贡献：M.G.L.G.设计研究、进行研究、分析数据并撰写论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：SSIM，饱和结构照明显微镜；半高宽，最大半宽。

参考文献