新皮质网络的成像输入和输出体内

摘要

要了解哺乳动物新皮质中信息的表示和处理方式，不仅需要测量单细胞动力学，还需要测量已识别的神经元网络中的时空活动模式体内到目前为止，本征或电压敏感染料信号的光学成像已经揭示了皮质柱尺度上的时空动力学，但缺乏细胞分辨率(1). 细胞外记录方法可以从多个细胞同时进行测量，但存在细胞身份定义不明确、空间分辨率不足以及无法分辨非活动神经元的问题(2). 因此，这些技术无法全面描述皮层微电路。特别是，这些方法无法监测代表输入特定局部区域的传入轴突的激活。进一步了解新皮质信息处理的关键是一种能够同时以单细胞和单棘波分辨率解析皮质微电路输入和输出的方法。

在这里，我们应用最近开发的新皮质细胞群双光子钙成像技术体内(三-5)描述麻醉期间自发观察到的上下状态波动期间的新皮质活动(6,7)睡眠和安静清醒(8). 我们证明神经元胞体的钙成像显示了具有单细胞和单棘分辨率的局部棘波模式。此外，在神经膜中发现了一个显著的基于轴突的钙信号，可以测量局部输入。对自发Up状态期间峰值活动的时空分布的分析表明，峰值是稀疏的，并且在神经元群体中分布不均匀。此外，我们还表明，峰值的数量取决于驱动输入的水平，如从大量神经纤维钙信号测量的。因此，大块标记组织的钙成像允许对局部皮层回路中的输入输出关系进行光学测量体内.

方法

外科手术。所有实验程序均按照马普学会的动物福利指南进行。Wistar大鼠(n个= 35; P25-36）用每公斤体重2克氨基甲酸乙酯静脉麻醉。暴露并清洁动物颅骨，用牙科丙烯酸水泥将金属板固定在颅骨上。在初级运动皮层或躯体感觉皮层上方打开2至3 mm宽的开颅手术。暴露的皮层用温暖的正常大鼠振铃液（135mM NaCl/5.4mM KCl/5mM Hepes/1.8mM CaCl₂pH 7.2，含NaOH）。开颅手术用琼脂糖填充（III-A型，Sigma；1%在正常大鼠林格溶液中），并用固定玻璃盖玻片覆盖。

标签程序。钙指示剂俄勒冈州绿488 1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷对新皮质细胞的多细胞团注负荷-N、 N、N’，N个如参考文献所述，进行′-四乙酰基-1（OGB-1）乙酰氧基甲基（OGB-1-AM；分子探针）。三-5在大多数实验中，在表层2/3（L2/3）进行多细胞团注加载。为了对第1层和L2/3层中的树突状结构进行特定负载，将OGB-1-AM（1.4 mM）在0.2-0.3 bar（1 bar=100 kPa）的压力下缓慢注射到运动皮层第5层中10-15分钟，并在软脑膜下方650-750μm处使用微量移液管尖端。这种深层负荷导致第5层锥体神经元的离散标记。注射后1-1.5小时可对枝晶进行成像。体内星形胶质细胞的标记如参考文献所述。4.

双光子显微镜。如参考文献所述，使用定制的双光子激光扫描显微镜进行双光子成像。4和9激发波长≈880 nm（Mira 900-F激光器，Verdi-10泵浦，相干，加州圣克拉拉）。使用奥林巴斯（纽约州梅尔维尔）20×浸水物镜（0.95数值孔径）。

电生理学。用直径500μm、涂有特氟隆的银线尖端贴在开颅术一角的软脑膜表面上，记录皮层电图（ECoG）。参考电极通过枕骨上的一个小孔放置在小脑上。ECoG信号由定制的交流耦合放大器采集（输入阻抗1 MΩ；带宽0.1 Hz至8 kHz）。

在OGB-1-AM加载的L2/3神经元中，以细胞连接或全细胞结构进行斑贴记录。使用双光子显微镜对细胞进行视觉定位。开吸管电阻为4-6 MΩ。细胞内信号用Axoclamp 2-B放大器（Axon Instruments，Foster City，CA）记录，并用CED1401进行数字化加（英国剑桥电子设计公司）。

药理学。为了局部阻断突触后活动，我们在1 mM的正常大鼠林格溶液中应用了特异性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）型谷氨酸受体拮抗剂1-（4-氨基苯基）-3-甲基氨基甲酰基-4-甲基-3,4，-二氢-7,8-亚甲基二氧基-5H-2,3-苯二氮卓（GYKI53655）。将含有GYKI53655的微量移液管插入L2/3皮层。在3分钟的控制成像期后，GYKI53655持续加压（0.3-0.4巴）3分钟。通过施加轻微负压（-0.01巴）或拔出移液管停止应用。继续成像3-4分钟。

数据分析。使用由64×128或32×128像素组成的帧测量钙瞬变，线扫描持续时间为1-1.5 ms（15至31Hz帧速率）。OGB-1荧光在感兴趣的区域中平均，包括细胞体或缺乏细胞体的大区域（neuropil）。在未染色的血管中测量背景荧光。信号表示为相对荧光变化（ΔF类/F类)背景减影后。动作电位（AP）诱发的钙瞬变是通过模板匹配算法检测的，该算法利用了其特征形状，先是急剧上升，然后是指数衰减(10). 请参阅支持信息，发布在PNAS网站上，以获取有关方法的更多详细信息。所有数据均以平均值±SEM表示。

结果

新皮质L2/3中的自发钙信号。我们使用最近开发的用于细胞群体钙指示剂负载的多细胞团负载技术，研究了新皮层的自发活动体内(三). 通过玻璃吸管将膜透性钙指示剂OGB-1-AM压力注入麻醉大鼠运动皮层或桶状皮层的L2/3。通常在染料注射后1小时，对半径数百微米内的所有细胞进行标记(图1A类). 值得注意的是，不仅细胞体被染色，神经膜也被染色，其中包括树突、轴突、突触前神经束和胶质突起。这种染色模式表明，不同的细胞隔室吸收了钙指示染料。Neuropil染色呈弥漫状，没有可识别的结构，可能是因为相似负载的亚细胞隔室之间缺乏对比。

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图1。

大量新皮质L2/3细胞体和神经膜中的自发钙瞬变。(A类)(左侧)运动皮层OGB-1负载细胞的侧面投射。星形胶质细胞（黄色）用硫酸罗丹明101复染。(A类)(赖特)(上部)软脑膜表面下250μm的双光子图像显示神经元（绿色）、星形胶质细胞（黄色）和周围装有OGB-1的神经膜。(下部)面积与上部显示感兴趣的区域：神经元（白色圆圈）、星形胶质细胞（白色方形）、神经膜（灰色阴影）和血管内腔作为背景（蓝色圆圈）。(B类)已鉴定星形胶质细胞的同步钙瞬变(顶部)，神经元(中部)和神经膜(底部)记录了几分钟。(插入)注意快速开始和指数衰减（黑色）的急剧瞬变，以及扩展时间尺度上的持续神经纤维信号（来自方框）

使用多细胞团注加载技术进行非特异性加载需要解剖各种钙信号成分。我们之前已经证明可以识别星形胶质细胞体内使用红色荧光染料硫罗丹明101(4). 该标记可对星形胶质细胞网络进行反染色，并区分星形胶质细胞和神经元中不同的钙动力学(图1). 与我们之前的研究一样，我们在已鉴定的星形胶质细胞中观察到缓慢的钙振荡（平均半衰期为75±23 s；n个=15个细胞和5只动物）。相反，神经元表现出短时间（<1s）的自发但罕见的钙瞬变，伴随快速启动和指数衰减，类似于观察到的AP-voked钙瞬变在体外和体内(9,10). 最值得注意的是，周围神经膜也出现了较大的荧光变化(图1B类). 绘制不含细胞体的大范围感兴趣区域的平均荧光强度的时间进程显示，在0.5-1 Hz范围内（0.56±0.12 Hz，n个=5只动物）。这些波动高于我们成像系统的固有噪声水平，表明它们可能代表了神经膜结构中钙信号的整体测量。因此，在进一步描述自发活动之前，我们讨论了两个关键问题：(我)是否可以在单个神经元中检测到单个AP，以及(ii（ii）)神经纤毛波动的起源是什么。

单个AP在厚壁组织中溶解。为了确定我们测量神经元钙瞬变的敏感性，我们进行了同步的细胞贴附记录(图2). 用充满红色荧光染料Alexa Fluor 594的贴片吸管靶向单个L2/3神经元，形成Gigaohm密封(图2A类). 随后，在细胞外记录自发AP，同时测量同一细胞内的体细胞钙瞬变(图2B类). 在记录结束时，建立了一个全细胞结构，以验证记录了哪个神经元。为了量化棘波检测的可靠性，我们分析了光学检测到的单个AP的分数和几个AP的短脉冲(图2C). 总体而言，检测到97%的单AP和100%的突发（95个单AP、46个双AP、6个三元组和4个四元组；n个=14个细胞和12只动物）(图2E类). 钙瞬态振幅与AP数量相关(R（右）²= 0.81; 看见图4D类)(11,12). 单次AP诱发瞬变的平均振幅为10.0±0.9%，平均衰减时间常数为0.82±0.42 s(n个=10次瞬变和5只动物）。两个或多个AP的突发导致较大的钙瞬变（双峰平均振幅15±2%；衰减时间常数1.01±0.3 s；n个=10次瞬变和5只动物）。我们的结论是，通过使用大块组织的钙成像，单细胞和单AP分辨率可以可靠地分辨AP活性。这使得光学提取局部神经元电路中代表“输出”活动的AP模式成为可能，为多单位记录提供了光学模拟，但其优点是AP活动可以分配给已识别的神经元。

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图2。

在大容量组织中检测到单次AP-voked钙瞬变。(A类)OGB-1负载神经元（绿色）和星形胶质细胞（黄色）的叠加。细胞贴附记录从中央神经元获得（箭头表示含有5μM Alexa Fluor 594的吸管）。(B类)(上部)细胞贴附记录中显示神经元自发放电的电流轨迹A类（显示峰值数量）。(下部)同时记录对应于单个AP和AP双重的体细胞钙瞬变。(C)从细胞贴附记录（上迹线）中自发单AP、双AP和三AP诱发的体细胞钙瞬变（下迹线）示例。(D类)通过同步细胞附加电流记录证实了棘波检测的保真度。显示了光学检测到的单个AP和AP突发的分数。(E类)钙瞬态振幅与同时细胞附加电流记录中检测到的AP数量的关系

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图4。

阻断突触后放电活动不会改变OEG。(A类)25个L2/3神经元在局部加压应用特定AMPA受体拮抗剂（1 mM GYKI53655）之前、期间和之后的尖峰诱发钙瞬变（光栅图）。图中显示了同一时间段内的群体活动（下部直方图；1s箱）和单个神经元的总活动（右上方直方图）。与光栅图同期记录的神经磷脂钙波动（红色）。(B类)典型的ECoG（黑色痕迹）和神经细胞钙波动（红色痕迹）周期以及拮抗剂应用之前和期间产生的交叉相关性（取自虚线框）。(C)比较前拮抗期（前）、拮抗期和拮抗后期的神经元放电率（黑色）和峰值相关性（红色）摘要

Neuropil的光学脑电图（OEG）记录。为了探索神经纤维荧光波动的起源，我们结合了体内使用ECoG的双光子成像和全细胞记录。在大量负载组织中单个细胞的全细胞记录中，膜电位在上下状态之间波动，这在新皮质神经元中是典型的(图3A类)(6-8). 这种持续的自发活动在ECoG中也很明显，与细胞内记录相关（峰值相关，0.79±0.1；n个=5只动物）(7,13). 神经磷脂荧光波动与这种电活动高度同步，表明它们反映了持续的上升和下降状态(图3A类和B类和图7）。交叉相关显示出与ECoG和细胞内记录密切相关（平均峰值相关分别为0.70±0.1和0.75±0.1；n个=5只动物）。对于L2/3中的钙指示剂负载，两个峰值ΔF类/F类神经膜波动幅度以及与ECoG的峰值相关性与软脑膜表面的深度无关(图3B、 D类、和E类). 这些发现证实了一种观点，即神经膜的波动是由其成分中的自发钙信号引起的，并与持续的电活动直接相关。鉴于与ECoG的强相关性，我们将神经膜信号称为OEG。

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图3。

神经肽波动与持续的电活动高度相关。(A类)使用全细胞（WC）记录、ECoG和神经细胞荧光波动（OEG）同步测量L2/3锥体神经元的膜电位。(B类)(左侧)表面装有OGB-1的细胞的侧面投影，描绘了从软脑膜收集神经膜信号的深度（虚线）。(赖特)不同深度的持续OEG波动（红色）与电子ECoG信号（黑色）相关。(C)树枝晶对组织环境足迹波动影响不大。(左侧)使用深度加载技术对源自第5层神经元的OGB-1负载树突进行侧面投影（参见方法). (赖特)同时记录树突的ECoG（黑色）和OEG（红色）。下部记录道显示初始染料喷射位置附近的记录（显示成像深度）。(D类)浅负荷皮层神经膜钙瞬变峰值振幅(▪) 和深负荷皮层（○）(E类)OGB-1加载到L2/3时不同深度神经膜和ECoG波动的峰值相关图(▪,n个=5只动物）或分散加载到第5层（○，n个=5只动物）

OEG起源于轴心结构。新皮质中的神经磷脂由>50%的轴突和突触前神经束、30%的树突和树突棘以及10%的胶质突起组成(14). 所有这些结构都可能导致组织环境足迹波动。星形胶质细胞不太可能发挥作用，因为它们在较慢的时间尺度上显示钙振荡(图1)(4). 此外，电活动和OEG之间的紧密联系表明其来源于神经元。问题是OEG主要代表轴突（突触前）还是树突（突触后）钙信号。

为了解决这个问题，我们使用了两种互补的方法。首先，我们开发了一种体积加载技术的变体，在该技术中，染料被离散地压力注入第5层，主要标记深部细胞及其投射到上部皮质层的顶端树突(图3C；看见方法). 这种加载方法使我们能够单独研究OEG的树枝状成分。通过使用深层负荷，表层组织环境足迹缺失或显著减少(图3C). 峰值ΔF类/F类深度为150μm时振幅为1.7±1.1%，深度为350μm时振幅为3.7±2.9%，明显低于表观载荷(P（P）对于150至450μm的深度，<0.001；P（P）550-μm深度<0.01；n个=5只动物；成对的t吨测试）(图3D类). 只有在深度大于500μm和注射部位附近，OEG振幅才与表面载荷相当（16.3±4.0%；P（P）>深度为600至680μm时为0.05）。同样，通过使用深度加载，同时记录的OEG和ECoG之间的相关峰在表层显著降低至400μm，但不会进一步降低（50至150μm深度处的峰值相关为0.1-0.2，200至400μm深度处的峰相关为0.2-0.4，≈600μm深度时为0.6-0.75）(图3E类). 这些结果表明，树突钙瞬变对神经胶质荧光信号的贡献很小（如果有的话），这表明OEG主要来源于轴突。

为了进一步验证轴突起源假说，我们用GYKI53655局部阻断突触后活动，GYKI是AMPA型谷氨酸受体的特异性拮抗剂(15)对轴突钙信号的影响最小。1 mM GYKI53655通过微量移液管喷射到L2/3的压力并没有改变该区域持续OEG波动的幅度(P（P）= 0.87;n个=4只动物）(图4A类和B类). 作为对照，拮抗剂的突触后阻断作用在同时测量的自发AP-激活钙瞬变模式中明显(图4A类). 在应用拮抗剂期间，钙瞬变的平均频率显著降低（之前为0.038±0.005 Hz，GYKI53655为0.014±0.003 Hz；P（P）<0.001，配对检验；n个=4只动物）(图4C)但在终止用药后恢复到前触角蛋白水平（0.046±0.002 Hz；P（P）> 0.05).

综上所述，这些研究结果表明，OEG波动主要来源于轴突结构，可能反映了突触前神经束和突触前激活的轴突中AP-voked钙瞬变的总体平均值。因此，组织环境足迹可以被视为对特定地区的体积平均“投入”活动的度量。

AP在大脑皮层向上状态中均匀分布。 体内因此，大块组织中的钙成像允许测量局部皮层区域的输入和输出神经元活动。我们使用这种方法在人群水平上描述了新皮质中持续的自发活动。我们首先研究了在Up状态下AP活动的时间结构。在L2/3锥体神经元的全细胞记录中，相对于Up状态的出现，AP具有均匀分布的时间延迟(图5A类). 为了研究这种均匀分布在群体水平上是否成立，我们对在小神经元群体（最多40个神经元）中同时检测到的体细胞钙瞬变进行了类似的分析。图5B类显示了20个连续记录的Up状态，这些状态是从ECoG中解析出来并与它们的开始对齐的，以及38个已识别神经元的相应AP-voked钙瞬变模式。注意，在记录的神经元群中，并非每个Up状态都会产生AP激活的钙瞬变。与全细胞记录一样，AP活动分布在整个Up状态，并且不局限于一个特定时期(图5B类). 将五只动物的220个Up状态的AP-voked钙瞬变开始延迟合并，并将这些结果暂时合并，结果表明平均Up-state时间过程中不同时间段之间没有显著差异(P（P）> 0.05) (图5C). 电测和光学检测AP活性的累积时间分布均为线性(R（右）²>0.99），表示均匀分布。

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图5。

Up状态期间的活动分布。(A类)三种自发全细胞Up状态的叠加(上部)和同步ECoG记录(下部)描绘了AP发射相对于Up状态开始的可变定时。显示的是43个Up状态下AP触发时间的分布(n个=5只动物），参照急性发作(下部). 指示为第一个(▪), 第二（□）和第三（○）个AP。上膜电位迹线的AP用彩色符号表示。(B类)38个神经元在20个连续自发ECoG Up状态下的体细胞钙瞬变光栅图（叠加）。每行表示活动的峰值时间，颜色与不同Up状态（覆盖）的颜色相关联。(C)来自五只动物的220个Up状态的活动直方图，显示突触后活动的平均（红线）时间与平均Up状态时间进程（0.1-s箱）的关系

人口活动的异质性和稀疏性。接下来，我们旨在确定参与Up-state的神经元活性亚群的时空分布。我们在包含20-30个神经元的区域进行了90秒成像周期的测量(图6A类). 为了揭示活动的空间模式，我们根据神经元诱发钙瞬变的全部Up-state的分数对神经元进行了彩色编码。我们发现活动神经元的空间组织不稳定，但在几分钟的时间过程中表现出相当大的异质性(图6B类). 这种异质性表明，自发活动并非只出现在特定的神经元子集中，而是由不断变化的神经元亚群产生的。神经元在时间激活方面也表现出异质性。为了验证这一点，我们分析了网络中单个神经元的事件间隔（IEI）的分布和方差系数(图6E类). 事件定义为一个或多个AP产生的钙瞬变。单个神经元在6分钟内的IEI分布（数据未显示）以及神经元群体的IEI分配可通过指数曲线拟合（τ=15.7 s，R（右）²= 0.98) (图6E类). 单个神经元的IEI显示出较高的变异系数值，范围为0.58至1.5，平均值为0.95±0.04(n个=5只动物）。这些结果表明，在自发持续活动期间，AP活性以最简单的形式呈泊松分布。

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图6。

异质种群峰值活动。(A类)荧光图像显示星形胶质细胞（黄色）和OGB-1填充神经元（绿色）的空间分布。(B类)图像区域的伪彩色表示A类描绘了神经元在90s周期内活动的Up状态的分数。显示活动规模；在此期间没有活动的神经元是黑色的。(C)光栅图描绘了在连续Up状态下，一个区域产生尖峰诱发钙瞬变的神经元百分比。每个点代表一个Up状态。平均活动用红线表示。(D类)五种动物在许多Up状态下活动神经元的平均百分比的人口直方图。(E类)人群IEI分布汇集于多个成像周期（指数拟合，红色）。(F类)放电频率范围，其中212个神经元在10分钟内处于活动状态；根据神经元的平均活动度对其进行排序（红点表示平均值）。(G公司)来自五种动物的神经元群中尖峰活动的概率（与E类). (H（H）)局部投入产出关系。相对ΔF类/F类根据之前的Down状态计算出的Up-state转换期间OEG荧光（突触前）的变化，并绘制出整个神经元群体对应Up状态期间突触后放电相关事件（突触后）的绝对数量

成像方法的一个主要优点是可以识别非活性细胞，这使我们能够确定每个Up状态下活性细胞的比例。在个别实验中，这一比例在0%到50%之间变化(图6C). 将多个动物的许多Up状态汇集在一起，得出了一个歪斜的分布，每个Up状态平均有10.6±2.1%的神经元处于活动状态（183个神经元；5只动物）。

神经元的体细胞钙瞬变率较低，介于0至0.14 Hz之间，平均值为0.048±0.002 Hz(n个=212个神经元和11只动物）(图6F类). 这些比率与在电记录中观察到的自发性AP的低比率一致（细胞附着记录：0.05±0.008Hz，n个=14个神经元和12只动物；全细胞记录：0.05±0.01 Hz，n个=10个神经元和9只动物；各组之间无显著差异，P（P）> 0.05). 虽然一些自发的钙瞬变可能是由几个AP的爆发引起的，但这些事件很罕见（<10%），因此对使用光学数据计算的速率影响可以忽略不计。在确定的神经元中，11%的神经元在成像期间没有出现任何钙瞬变。一种可能性是，这些细胞是中间神经元，目前尚不清楚单个AP是否可以被分解。根据平均活动度对所有神经元进行排名，结果显示，从非活动细胞到活动度相对较高的细胞，神经元的分布是连续、平稳的(图6F类). 总之，这些结果表明，大脑皮层L2/3神经元的自发AP活性在空间和时间上分布稀疏且不均匀。活动水平在整个人群中有所不同，但不是以连续的形式，而是以非活动和活动神经元的离散组的形式。

本地输入输出关系的光学记录。OEG和AP诱发的钙瞬变模式分别反映了新皮质局部区域的输入和输出活动。因此，较大的输入，即较强的轴突激活，应导致较大的输出，即产生更多的AP。我们通过绘制局部神经元群中突触后钙瞬变的数量与周围神经膜中OEG的振幅的对比图来验证这一假设，以衡量轴突对这一特定区域的激活强度。该分析揭示了一种类似于投入产出关系的依赖性(16,17)阈值低于该阈值时不会生成任何AP，阈值以上近似线性关系(n个=5只动物）(图6H（H）). 因此，解析大量组织中轴突和细胞钙信号的能力有望成为研究局部新皮质网络中信号转换的有用工具。

讨论

输出活度的光学测量。AP通过电压依赖性钙通道引起钙内流，并引起细胞内钙浓度的变化。因此，细胞群的钙成像可以用于提取神经元网络中的尖峰（输出）模式，如之前在脑切片中所示(18). 在这里，我们将此方法扩展到体内条件，并证明使用OGB-1批量加载后可以光学检测到单个尖峰。这种具有单细胞分辨率的“光学多单元记录”允许以≈10-Hz的帧速率提取最多40个神经元组成的组中的尖峰模式。由于帧捕获率和钙信号相对较慢（1s）的衰减，这种方法的时间精度目前受到限制，这导致钙瞬变随着AP的快速连续发生而合并(10,18). 考虑到AP诱发的钙瞬变的振幅可能会提高尖峰模式提取的时间准确性，因为振幅取决于AP的数量(19)(图2E类)，它们的相对时间(20)，以及相对于Up-state起始点的间距(21). 或者，速度更快的染料，如电压敏感染料，可以提高时间分辨率(1)，但这些染料目前缺乏细胞分辨率体内在目前的研究中，只有一小部分事件由一个以上的AP组成，这表明有限的时间分辨率不会对得出的结论产生不利影响。

输入活动的光学测量。我们研究的一个主要发现是神经膜中显著的自发钙信号，我们称之为OEG。我们证明OEG在本质上主要是轴突性的，这与轴突和突触前神经束所占的大部分神经纤维体积一致(14,22). 在我们看来，OEG代表体积平均信号，反映了许多激活轴突中AP诱发的钙瞬变的总和。因此，OEG是对ECoG的补充，ECoG被认为反映了突触电位。鉴于复合突触电位反映突触前输入的平均速率，OEG和ECoG之间的高度相关性并不奇怪。

有两条证据支持突触前轴突起源的OEG。首先，神经膜中的树突对OEG的贡献最小，这与单细胞成像实验一致，该实验报告在阈下向上状态期间，树突顶端树干中没有可检测到的钙瞬变(23). 虽然树突状棘中的局部突触钙瞬变可能起作用，但它们在很大程度上取决于NMDA受体的激活，因此在静息膜电位附近可能相对较小。其次，OEG不受局部阻断AMPA受体的影响，而神经元尖峰诱导的钙瞬变频率明显降低。尽管L2/3锥体神经元轴突侧支位于起源神经元附近，因此可能对OEG有贡献，但当局部神经元的放电显著减少时，未检测到OEG的显著变化。此外，神经元放电并不常见，但OEG是连续的，如果OEG实际上依赖于局部神经元轴突树突的活动，那么人们会认为OEG信号更不连续，与同时记录的ECoG信号相关性更小。因此，神经膜的OEG记录可以监测局部神经元网络的体积平均输入，并与同步神经元输出活动相关。

自发皮层活动的特征。电学和光学记录都一致显示，单个神经元和神经元群表现出稀疏的自发活动。单个神经元显示出<0.1 Hz的低AP率，与之前的结果一致体内研究(24,25). 在种群水平上，在任何给定的Up状态下，只有一小部分（10%）的神经元处于活动状态，而这部分活动神经元会随着时间而变化。这种时间和空间上的稀疏性表明，新皮质有更大的能力来编码额外的信号，例如，在Up-state期间的传感器感应输入。神经元群体的IEI分布通过泊松过程得到了很好的近似。这种随机行为表明，自发活动中的峰值并不明显取决于之前的峰值时间，这与其他研究报告的急性皮层切片中的空间和时间峰值结构形成对比(26,27). 尽管这些研究记录了比目前研究中更多的细胞的瞬变，但神经元与星形胶质细胞没有区别，考虑到星形胶质细胞是间隙连接耦合的，并且显示钙瞬变，这一点可能很重要(4).

总之，我们已经证明，输入和输出活动可以通过使用大量钙指示剂负荷在局部皮层区域进行测量。此外，我们观察到输入和输出之间的直接关系，因为突触后峰值活动的数量取决于OEG测量的突触前轴突活动的强度。研究输入输出关系对于理解神经元电路中的信号处理至关重要(16,28). 例如，我们的光学方法可以用于研究在各种兴奋性和抑制性突触输入条件下这种转换增益的调制(16). 此外，它应该能够研究感官输入期间的输入-输出转换，以及它们如何受到不同水平的背景活动的影响，例如它们发生在不同的行为状态。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：J.N.D.K.和F.H.设计的研究；J.N.D.K.进行研究；J.N.D.K.和D.G.贡献了新的试剂/分析工具；J.N.D.K.、D.G.和F.H.分析数据；J.N.D.K.和F.H.撰写了这篇论文。

缩写：AMPA，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸；AP，动作电位；ECoG，皮层电图；GYKI53655，1-（4-氨基苯基）-3-甲基氨基甲酰基-4-甲基-3,4，-二氢-7,8-亚甲基二氧基-5H-2,3-苯二氮杂卓；IEI，事件间隔；OEG，光学脑图；OGB-1，俄勒冈州绿488 1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N个’，N个′-四乙酸酯-1；OGB-1-AM、OGB-1-乙酰氧基甲基；L2/3，第2/3层。

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