抑制前体蛋白法尼基化可预防Hutchinson-Gilford早衰综合征的特征性核泡

摘要

H（H）utchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是一种极为罕见且致命的“早衰”疾病，所有儿童均因心肌梗死或脑血管意外死亡，平均年龄为12岁（范围为8-21岁）。这种疾病最早的表现是在≈12-14个月大时出现，包括脱发和生长迟缓（Progeria Research Foundation的医学和研究数据库）。除进行性动脉粥样硬化外，HGPS的特征是骨变形，包括颅面部不均衡、下颌骨和锁骨发育不全、骨质疏松，以及皮下脂肪丢失、牙列延迟、皮肤硬化、关节僵硬和髋关节脱位(1-三).

HGPS是一种散发性常染色体显性疾病，几乎所有病例都是由从头开始基因第11外显子608密码子的单碱基替换LMNA公司1号染色体上的基因(4,5). 这个LMNA公司基因编码三种蛋白质，层粘连蛋白A（LA）、LC和LAΔ10，它们都是核膜的组成部分，核膜是位于内核膜内的动态分子界面(6). 最初被认为是一个惰性的支架网络，现在已经证明叶片在DNA复制、转录、染色质组织、核形状和细胞分裂中具有重要作用(7). 在LMNA公司目前，除了HGPS（被称为“层粘连病”）外，还有8种疾病与该基因的各种突变有关(7). 这些疾病包括Emery-Dreifuss肌营养不良、下颌骨发育不良、非典型沃纳综合征、1A型扩张型心肌病、限制性皮肤病和Dunnigan型家族性部分脂肪营养不良(8,9).

典型的LMNA公司HGPS中的突变是1824位的C-to-T核苷酸替换，导致编码氨基酸（G608G）没有变化，但产生了一个隐蔽的剪接供体位点。该位点的激活导致mRNA缺乏150核苷酸。反过来，该mRNA被翻译成一种突变蛋白，称为“前体蛋白”(4)，在C末端附近有50-aa的内部缺失。LA通常由大多数分化细胞表达，它对核膜结构和功能都有整体影响(10). 孕激素显然对表达LA的细胞类型的核功能起主导-负作用(11,12). 除了破坏核膜造成的潜在机械脆弱性外，这种突变还可能影响其他重要的细胞过程，如基因转录、DNA复制和细胞分裂。

在正常细胞中，前层蛋白A蛋白在C末端含有CAAX四肽基序。这个四肽信号通过法尼基转移酶（FTase）向半胱氨酸中添加15-碳法尼基类异戊二烯脂质基团(13). CAAX基序是一个半胱氨酸，其后是两个脂肪族氨基酸和一个末端“X”残基。最后一个氨基酸定义了异戊烯基与蛋氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸的加成的特异性，通过FTase进行信号修饰，而亮氨酸则通过结构相关酶香叶酰基转移酶（GGTase）I催化20-碳香叶酰基异戊二烯基的加成(14). 对于洛杉矶来说，CAAX主题是CSIM。法尼基化以及随后的CAAX信号修饰促进前层蛋白A与核膜的结合(15). 法尼基化后，末端三个AAX氨基酸被去除，C末端半胱氨酸进行甲基酯化(16,17). 虽然B型层粘连蛋白和LA都是法尼基化和羧甲基化的，但LA独有的是细胞核内的第二次分裂，导致从成熟蛋白质中去除额外的15个C末端氨基酸，包括法尼基半胱氨酸。这个最后的分裂步骤和由此导致的法尼基锚的丢失可能会从核膜释放前层胺A，并使其插入核膜。在HGPS中，尽管前齐聚物可以法尼基化，但其氨基酸606-656的内部缺失会移除执行最终切割步骤所需的内蛋白酶识别位点(图1). ZMPSTE24的突变导致严重的下颌骨发育不良，这是一种与HGPS表型相似的层压板病，这一事实证明了这种分裂的重要性(18). ZMPSTE24是酵母STE24的人类同源物，负责LA的最终裂解(19).

在单独的窗口中打开

图1。

的翻译LMNA公司该基因产生前层蛋白A蛋白，需要翻译后处理才能并入核膜。前层胺A蛋白在C末端包含一个CAAX盒，它表示异戊烯基化（在这种情况下，通过酶FTase向半胱氨酸添加法尼基）。法尼基化后，末端三个氨基酸（SIM）被裂解，末端法尼基半胱氨酸进行甲基酯化。然后，通过ZMPSTE24内蛋白酶的第二个切割步骤去除末端15 aa，包括法尼基。这最后一个卵裂步骤在早熟期被阻断。

我们假设法尼基化C末端的保留会导致前体蛋白永久固定在核膜上，无法释放。然后，前体蛋白的中央杆状结构域允许与成熟的非肉桂酰化LA二聚并组装成多蛋白复合物，导致核支架和潜在异染色质的显性负破坏，并导致HGPS中所见的特征性核泡(11). 此外，我们假设法尼基转移酶（FTIs）抑制剂会抑制前体蛋白的形成，并且减少这种异常蛋白的数量可能会改善HGPS和其他层压板病的病情。

在这项研究中，我们检测了基因突变和药物治疗预防HGPS中异常核表型的能力。这些结果支持了我们的假设，即正是前体蛋白的永久法尼基化状态使其能够发挥主导负效应，并对核结构和功能造成破坏性影响。此外，我们还证明了FTI逆转这种核表型的能力。因为FTI目前正在作为抗癌药物进行第三阶段临床试验评估(20)，我们已经确定FTIs是HGPS的一种潜在治疗方法。

材料和方法

构建和突变。如参考文献所述，创建pEGFP-myc-LA载体（此处称为WT LA-CSIM）和LAΔ50载体（此处简称为progren-CSIM）。11; 这些载体编码GFP标记的LA融合蛋白。使用以下寡核苷酸通过定点突变产生WT LA-CSIL、前体CSIL、WT LA-SSIM和前体-SSIM突变：CSIL，5′-CCCAGAGCATTAAATCTAGTCGACGGTA-3′；和SSIM，5′-CACAGAGCCCCAGAACTCAAGCATCATGTAATCTAGAG-3′（QuikChange II XL定点突变试剂盒，Stratagene）。

细胞培养。所使用的细胞系为正常人成纤维细胞系AG06299和HGPS成纤维细胞株AG06917、AG11513和AG11498（NIA老化细胞培养库，Coriell细胞库，新泽西州卡姆登）。成纤维细胞在补充有15%FBS（HyClone）/2 mM的MEM（Invitrogen/GIBCO）中培养我-谷氨酰胺/50单位/ml青霉素/50 mg/ml链霉素。HeLa和HEK 293细胞系在添加10%FBS和抗生素的DMEM（Invitrogen/GIBCO）中培养。

瞬时转染。四室载玻片每室约25000个细胞（Nunc编号154526，Lab-Tek，Nalge）。24小时后，在标准条件下，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染HeLa和HEK 293细胞系，每个构建体转染0.8μg。

FTI治疗。瞬时转染时，HeLa细胞接受一次剂量的0、0.5、1.0或2.0μM选择性FTI lonafarnib（Sarasar SCH66336，Schering-Plough）处理。用0、1、2、5或10μM选择性FTI L-744832（Biomol，普利茅斯会议，PA）的一个剂量处理HEK 293细胞。此外，用5μM FTI-2153处理NIH 3T3细胞，FTase或GGTI抑制剂（GGTI）-2166对GGTase I具有高度选择性（S.M.Sebti和A.D.Hamilton的馈赠，耶鲁大学，康涅狄格州纽黑文）。这些FTI具有相同的作用机制，可以互换使用以抑制蛋白质法尼基化在体外然而，只有洛那法尼是临床候选药物。正常和HGPS成纤维细胞用每日剂量为0、0.5、1.0或2.0μM的罗纳法尼治疗3天。

GFP定位和荧光显微镜。瞬时转染后48小时，使用Axioplan荧光显微镜（Zeiss）观察HeLa和HEK 293细胞的GFP定位。用洛那非尼处理3天后，用PBS（pH 7.2）洗涤HGPS成纤维细胞两次，并在室温下用1%多聚甲醛在PBS中固定10分钟。用PBS洗涤三次后，将细胞在室温下用PBS中的0.5%Triton X-100透化5分钟，并在室温下用5%马血清封闭30分钟。然后在室温下用在封闭溶液中稀释的原抗体（多克隆小鼠抗人LA/C，1:10）（mAb 3211；Chemicon）培养细胞1小时。然后用PBS再洗三次，再用二级抗体（Alexa Fluor 488-共轭驴抗鼠IgG；分子探针）孵育45分钟，再用三次PBS洗。然后用含有Vectastain DAPI（Vector Laboratories）的安装介质安装载玻片。

移动转移实验。NIH 3T3细胞，在37°C、10%CO、添加10%FCS的高糖DMEM（DMEM-H；Invitrogen/GIBCO）中生长₂根据制造商的说明，使用脂质体转染试剂（Invitrogen），用空载体、前体-CSIM或前体-SSIM瞬时转染。用载体（DMSO）或丙烯化抑制剂（5μM FTI-2153、5μM GGTI-2166或两者）处理转染细胞48小时。细胞在2×Laemmli负载缓冲液中直接裂解，总细胞裂解产物在SDS/8%PAGE上进行解析。将蛋白质转移到Immobilon poly（偏二氟乙烯）（Millipore），用抗GFP单克隆抗体（克隆B34，Covance，Berkeley，CA）进行印迹，并使用SuperSignal增强化学发光（Pierce）进行可视化。

形态分析。为了检测不同数量和长度的FTI处理细胞中泡状细胞的总百分比，200个细胞核被分类为泡状细胞（如果它们包含两个或多个分叶状细胞）或无泡状细胞，如前所述(11). 这些分类是由三名独立的观察者完成的，他们都不知道被检测细胞的具体情况，然后对三个独立的数据集进行平均。阿米蒂奇趋势测试(21)用于测试每种细胞类型的剂量依赖性反应。

结果

我们试图检测CAAX盒突变体或FTI阻断核泡的能力，核泡是HGPS表型的细胞标志。为了测试抑制所有丙烯基化的效果，产生了WT LA和前体蛋白CSIM基序的半胱氨酸残基的错义突变（指定为SSIM）。这些通过N-末端GFP融合标记为可视化的构建体被转染到HeLa细胞中，并在48小时后成像。在没有丙酰化的情况下，所有的前层蛋白A都从其核周边的正常位置重新定位到细胞质聚集体中，并且没有孕激素诱导的核起泡(图2). 共焦显微镜观察表明，这些核质聚集体分布在整个核质中（数据未显示）。将CSIM末端序列突变为CSIL预计有利于香叶基香叶酰化而非法尼基化(14)因此，产生一种抗FTI的蛋白质形式。在这种情况下，进展性核泡持续存在(图2)表明任何类前体蛋白组的持续修饰都会促进前体蛋白表型。HEK 293细胞和NIH 3T3细胞对所有这些构建物都获得了类似的结果（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图2。

WT和前体LA的前体化突变体的亚细胞定位和诱导核泡。用编码所示WT或前体LA蛋白的表达载体瞬时转染HeLa细胞。(一)普通WT LA-CSIM CAAX图案。(b条)CSIM序列突变为SSIM的WT LA，将所有LA重新定位为核质聚集体。(c（c）)带有CSIM序列的WT LA突变为CSIL，预测为香叶基香叶酰化，导致核质和核膜定位的混合。(d日)前体-CSIM结构重现了HGPS中的核泡状结构。(e（电子）)当前体CSIM的CSIM突变为SSIM（前体SSIM）时，起泡被阻止，前体蛋白积聚在核质聚集体中。(（f）)Progerin-CSIL引起的气泡与真正的Progerin-CCIM无法区分。转染后48小时观察细胞，并在×60倍放大下拍摄显微照片。

然后，我们探讨了用临床候选的FTI罗纳法尼治疗转染WT LA-CSIM、前体-CSIM，前体-SSIM和前体-CSIL的HeLa细胞的效果(22). 在转染时单次给药0、0.5、1.0或2.0μM后，48小时后观察到细胞（图。​（图3三和​和4）。4). 在转染WT LA-CSIM的细胞中，细胞计数表明，尽管进行了处理，核泡状变的百分比没有改变，保持在≈5%，这是正常WT细胞的典型泡状变百分比(11). 相反，转染前体-CSIM构建物的细胞表现出显著的剂量依赖性反应(P（P）<0.0001），单剂量2.0μM洛那非尼使细胞核接近正常起泡百分比。预测为香叶基香叶基化的progerin CSIL突变体对FTI处理具有完全抗性，这证明抑制progerin的法尼酰化，而不是抑制任何其他内源性法尼酰化蛋白，是FTI处理所见的核表型改善的原因。正如预期的那样，FTI治疗前体-SSIM突变体没有发现任何差异，因为前体化已经被完全抑制。当FTIs L-744832或FTI-2153以1.0-10μM的剂量使用时，HEK 293和NIH 3T3细胞对所有这些结构都获得了类似的结果（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图3。

FTI治疗可防止法尼基化而非香叶基香叶酰化的前体蛋白引起的核泡。用编码前体-CSIM、前体-SSIM或前体-CSIL构建物的表达载体瞬时转染HeLa细胞，并用0(上部)或2(下部)μM FTI lonafarnib/SCH66336。(一和d日)前体-CSIM结构重建了HGPS中的标志性核泡，而FTI治疗几乎消除了它，导致前体蛋白重新定位为核质聚集物。(b条和e（电子）)未经处理的前体-SSIM模拟FTI处理的细胞表达真正的前体-CSIM的表型，所有前体重新定位为核质聚集体，并且不会随着处理而发生显著变化。(c（c）和（f）)孕激素-CSIL被预测为香叶基香叶酰化，可再现核泡，但对FTI治疗有抵抗力。转染后48小时观察细胞，并在×60倍放大下拍摄显微照片。

在单独的窗口中打开

图4。

用所示四种结构中的一种瞬时转染HeLa细胞核，并在转染时用单剂量的lonafarnib/SCH66336处理，可显示出气泡状HeLa核的百分比。百分比由三名独立观察者读取，他们在不知道所使用的构建体的情况下为每个实验打分200个细胞。误差条显示SEMP（P）这些值用于比较处理过的细胞和未处理的对照细胞。WT LA-CSIM与正常细胞典型的5%细胞核起泡相比没有显著变化。进展蛋白-CSIM表现出显著的剂量反应。预计为香叶基香叶酰化的前体-CSIL对法尼基化的抑制具有抵抗力。前体-SSIM不能进行法尼基化或香叶基香叶酰化，事实上没有起泡。^*,P（P）< 0.001.

下一步是研究FTI对HGPS患者（本例中为皮肤成纤维细胞）细胞核泡的影响。来自三名HGPS患者和一名未受影响的母亲的培养成纤维细胞接受为期3天的罗那非尼每日剂量治疗。为了观察治疗结束时的细胞核形态，用抗体对细胞核进行LA和LC染色（图。​（图55和​和6）。6). 在第3天，所有三种HGPS成纤维细胞系都显示出核泡的显著减少，这与患者年龄或细胞传代数无关(P（P）< 0.0001).

在单独的窗口中打开

图5。

FTI治疗导致两种不同表达进展蛋白的HGPS人成纤维细胞核泡的逆转。用0、1或2μM FTI lonafarnib/SCH66336处理3天后，用抗LA抗体对细胞进行染色。（原始放大倍数×60。）

在单独的窗口中打开

图6。

当HGPS皮肤成纤维细胞用所示剂量的洛那非尼每天治疗一次，连续治疗3天时，泡状核的百分比。AG06299来自一名6岁患者的34岁未受影响的母亲（第31段）（AG06917；第14段）。AG11513来自一名8岁的患者（第7段），AG11498来自一名14岁的患者。三名独立观察者读取了百分比，他们在不知道成纤维细胞基因型和所用FTI剂量的情况下，对每个实验的200个细胞进行评分。误差条显示SEMP（P）这些值用于比较处理过的细胞和未处理的对照细胞。^*,P（P）< 0.001.

如果用FTI治疗被认为是HGPS的可行选择，那么重要的是要确定是否真的前体蛋白，如K-Ras和一些其他法尼化蛋白(23)，在FTI存在下仍然可以是香叶基香叶基化的，因此对FTI处理具有抗性。为了探索这种可能性，我们进行了一系列实验，检测在使用FTI、GGTI或这两种药物的组合治疗时，前体素在高分辨率凝胶上的迁移。流动性向缓慢迁移形式转变的出现是证明FTI阻止法尼基化蛋白质加工能力的标准方法。如预期(图7)，单用GGTI治疗对progrein的流动性没有影响，表明progrein通常不是香叶基香叶酰化的。然而，GGTI完全改变了前体-CSIL的流动性，而FTI没有任何影响（数据未显示），证实了该突变体按预期进行了处理。重要的是，经FTI或FTI加GGTI处理的前体蛋白与经载体处理的、完全未处理的前体制蛋白-SSIM突变体迁移相同，这表明单用FTI处理可以完全抑制前体蛋白的处理，并且当法尼基化被抑制时，前体蛋白也不会被香叶基化。

在单独的窗口中打开

图7。

仅FTI治疗就足以削弱前体蛋白的加工。瞬时表达空载体（V.O.）、GFP-标记的前体-CSIM（前体）或GFP-标签的前体-SSIM（SSIM）的NIH 3T3细胞用载体（DMSO）或丙烯化抑制剂（5μM FTI-2153或GGTI-2166）处理48小时。用SDS/PAGE解析总细胞裂解物，并用抗GFP免疫印迹法检测前体CSIM或完全未处理的突变前体SSIM。用FTI而非GGTI治疗，可诱导前体蛋白-CSIM向未经处理的前体蛋白-SSIM迁移，表明前体蛋白是一个不进行替代性预酸化的FTI靶点。每条车道顶部的标签指示构成每个实验中主要物种的分子实体。P、 CAAX基序前体序列；C、 半胱氨酸；F、 法尼基基团。前进和SSIM通道中的较低频带被认为是击穿产物。

讨论

自1886年乔纳森·哈钦森描述以来(24)，由于其极为罕见（每400万活产中就有1例），HGPS很少受到科学研究人员的关注。然而，在2003年发现这种疾病背后的基因突变之后(4,5)人们对这一戏剧性的早衰疾病及其与正常衰老和动脉粥样硬化疾病之间的潜在联系的研究重新产生了兴趣。在此，我们提供证据表明，FTI可能是治疗这种毁灭性疾病的潜在疗法。

Farnesylation是一种翻译后修饰，包括添加15-碳异戊二烯部分，当发现癌蛋白Ras时，它被认为是潜在的抗癌靶点，据估计，Ras参与了多达30%的人类癌症(25)，其功能需要法尼基化(26). 自那时以来，制药行业的一项积极研究工作已经确定并开发了许多小分子化合物，它们能够有效且选择性地抑制FTase(20). 其中两种药物（来自新泽西州肯尼沃思Schering-Plough的lonafarnib/SCH66336和新泽西州新不伦瑞克强生公司的tipifarnib/R115777）已进入三期试验，耐受性良好，包括在涉及儿童的试验中(27). Lonafarnib与蛋白质底物竞争与FTase酶的结合(28).

与Ras类似，LA前体也被法尼化，法尼化是将前层胺a插入核膜的必要步骤，并允许完成LA加工的两个下游裂解步骤(13). 了解到在几乎所有HGPS病例中看到的单个C-to-T碱基改变都会产生一个隐蔽的剪接位点，从而删除了LA处理途径中正常的第二个内蛋白裂解位点，因此推测前体蛋白被迫保留其法尼基，因此，不能从核膜上分离出来。随着核膜的其他成员也可能被困在与定位错误的前体蛋白的复合物中，这一永久法尼化状态与HGPS细胞中显著的核泡泡和破坏的核结构之间的机械联系被提出，并提出了通过FTI预防或逆转这种表型的可能性(4).

我们假设FTI会降低成熟前体蛋白对核膜结构的显性负效应。然而，这种药理作用对progrein并不特异；FTI也会降低WT LA的水平，增加未去乙酰化前胺A的水平，并且无疑会影响数十种其他法尼基蛋白质的翻译后处理。虽然细胞总LA预计会减少，但我们假设净效应仍然是有益的，因为导致前体蛋白的异常剪接是由突变等位基因产生的，效率很低，因此前体蛋白数量远低于WT LA。此外，只有少量成熟的LA才能进行适当的核包壳组装(29). 为了支持这一观点，使用FTI的临床试验表明，即使未烯化前胺A的水平显著升高，其毒性也很小(30). 然而，LA的缺乏会导致严重的细胞后果和疾病(31).

此外，我们还探讨了在FTIs存在的情况下，孕激素被香叶基香叶基化的可能性，这可能会限制这种方法的实用性。在FTI存在下，致癌K-Ras和N-Ras作为相关酶GGTase I的替代底物，因此保持生物活性，完全能够进行信号转导和恶性转化(22,32-34). 因此，尽管当FTase活性被阻断时，H-Ras不会进行替代性的丙内酰化，但FTIs并不是两种Ras亚型的有效抑制剂，这两种亚型在人类肿瘤中最常见的突变激活，损害了FTIs在癌症治疗中的有效性。幸运的是，这里报告的数据证实，这种替代性异戊二烯化不会发生在前体蛋白中，前体蛋白的加工仅受FTI的完全抑制。

我们的结果表明，法尼化前体蛋白是导致HGPS中出现的核形态异常的原因，因为通过遗传突变和药物干预抑制法尼化可防止核泡，并将所有突变前体蛋白从核膜重新分布到核质聚集体中。除了防止外源性表达的前体蛋白引起的转染细胞中的这种核表型外，洛那非尼能够显著降低HGPS成纤维细胞中的泡状核百分比，即使是在高传代数下，这也是其对内源性前体蛋白治疗潜力的令人鼓舞的证据。也许去除法尼化前体蛋白的效果，无论是通过基因表达改变还是通过核支架的实际机械稳定，都会拯救HGPS中最容易受损的细胞。最近的研究支持了这一观点，研究表明，通过简单地将法尼基化前胺A水平降低50%，可以消除Zmpste24缺陷小鼠的核泡状和前体样表型(35).

然而，不能推定核畸形的这种改善在体外在HGPS细胞中必然转化为HGPS患者的表型改善。事实上，核泡可能不是人体整体水平疾病表型的最佳衡量标准，因为LMNA公司突变导致人类疾病，但对核形状没有任何影响(36). 同样，在细胞已经丢失或不可逆损伤的组织中，FTI治疗可能无法诱导细胞重新繁殖。尽管如此，本文报道的结果支持积极探索FTI治疗HGPS的潜力，也许也适用于有核变形证据的其他椎板病。

致谢

笔记

作者贡献：B.C.C.、M.R.E.、C.J.D.、A.D.C.和F.S.C.设计的研究；B.C.C.、M.R.E.、J.P.M.和J.J.F.进行了研究；A.D.C.提供了新的试剂/分析工具；B.C.C.、M.R.E.、J.P.M.、J.J.F.、R.V.、K.N.C.、L.B.G.、C.J.D.、A.D.C.和F.S.C.分析数据；而B.C.C.、M.R.E.、C.J.D.、A.D.C.和F.S.C.撰写了这篇论文。

缩写：HGPS，Hutchinson-Gilford早衰综合征；LA/C、层粘连蛋白A/C；FTase，法尼基转移酶；FTI、FTase抑制剂；GGTase，香叶基香叶酰基转移酶；GGTI，GGTase抑制剂。

工具书类