BMP4信号通路参与内耳感觉上皮的生成
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1,2 ,1 ,2 ,2 ,2 ,1和1 华为Li
1哈佛医学院耳鼻咽喉科和神经科学项目，美国马萨诸塞州波士顿市眼耳医院Eaton Peabody实验室，邮编02114
2复旦大学上海医学院眼耳喉鼻医院中心实验室耳鼻科，中国上海，200031
卡尔顿E科拉莱斯
1哈佛医学院耳鼻咽喉科和神经科学项目，美国马萨诸塞州波士顿市眼耳医院Eaton Peabody实验室，邮编02114
王正民（音）
2复旦大学上海医学院眼耳喉鼻医院中心实验室耳鼻科，中国上海，200031
赵燕玲
2复旦大学上海医学院眼耳喉鼻医院中心实验室耳鼻科，中国上海，200031
王玉成
2复旦大学上海医学院眼耳喉鼻医院中心实验室耳鼻科，中国上海，200031
刘洪（音）
1哈佛医学院耳鼻咽喉科和神经科学项目，美国马萨诸塞州波士顿市眼耳医院Eaton Peabody实验室，邮编02114
斯特凡·海勒
1哈佛医学院耳鼻咽喉科和神经科学项目，美国马萨诸塞州波士顿市眼耳医院Eaton Peabody实验室，邮编02114
1哈佛医学院耳鼻咽喉科和神经科学项目，美国马萨诸塞州波士顿市眼耳医院Eaton Peabody实验室，邮编02114
2复旦大学上海医学院眼耳喉鼻医院中心实验室耳鼻科，中国上海，200031
通讯作者。 收稿日期：2005年6月24日；2005年8月17日接受。
版权所有©2005 Li等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
BMP4在内耳早期感觉器官中的强烈表达表明该信号蛋白在听觉和前庭感觉上皮的诱导和发育过程中可能发挥作用。纯合BMP4-/-动物在内耳感觉器官发育之前死亡，这就排除了通过简单的基因敲除实验来确定BMP4在这些器官中的作用。
结果
在这里，我们使用鸡耳囊培养系统对内耳细胞类型的发育进行定量研究，并表明当BMP信号被阻断时，无论是用其拮抗物noggin还是用可溶性BMP受体，毛细胞和支持细胞的生成都会显著减少。相反，当用外源性BMP4处理培养的耳囊时，我们观察到毛细胞数量增加。BMP4治疗还促使增殖的感觉上皮祖细胞中Pax-2蛋白下调，导致祖细胞增殖减少。
结论
我们的研究结果表明，BMP4参与了鸡内耳感觉上皮形成过程中的两个事件：首先，诱导从增殖性感觉上皮祖细胞向分化上皮细胞的转变，其次，促进发育中的感觉上皮内毛细胞的分化。
背景
内耳来源于外胚层细胞增厚的斑块，即耳板，它在发育中的后脑外侧发育。在鸟类和哺乳动物中，耳板内陷并挤压形成梨形耳囊或耳囊。内耳的感觉上皮起源于耳囊的腹内侧区，该区域可以通过一些标记物的表达来定义，例如BEN（囊上皮和神经元）[1]、疯子边缘和cSerrate-1[2-4]，胰岛-1[5]和骨形态发生蛋白[4,6,7]。BMP4在几乎所有发育中的鸡内耳感觉上皮细胞中独特的时空表达模式表明，该蛋白可能在内耳感觉器官的诱导中发挥重要作用[4,6]。因为纯合BMP4基因敲除小鼠在E6.5和E9.5之间死亡[8]在内耳形成之前的一个时期，很难分析BMP4在内耳感觉器官发生中的作用。因此，其他模型系统，如鸡胚，已被用于研究BMP4在内耳中的可能作用。例如，noggin，一种BMP的拮抗剂，已被用于干扰鸡内耳发育过程中的BMP信号传导，导致半规管形成缺陷和耳膜畸形[9,10]。虽然在这些实验中观察到嵴畸形或缺失，但毛细胞发育正常。因此，这些结果并没有阐明为什么BMP4在感觉上皮原基中强烈表达，从而既没有证实也没有反驳BMP信号参与内耳感觉器官发生的假说。之前观察到的感觉上皮缺损缺失的可能解释在ovo中BMP4拮抗剂的应用是，拮抗剂在发育中的感觉上皮细胞中渗透的深度不够，浓度不够高，无法有效阻断BMP信号传导。为了解决这个问题，我们开发了一种无血清悬浮耳囊培养系统，该系统使我们能够定量分析发育中的耳囊中的祖细胞增殖、凋亡和细胞分化，并进行功能丧失和功能获得实验。我们的实验表明，BMP4信号通过下调同源域转录因子Pax-2负调控内耳祖细胞增殖，参与感觉上皮的生成。随后，BMP4信号传导促进毛细胞分化。
结果
外源性BMP4导致毛细胞数量增加，阻断BMP信号抑制毛细胞生成
发育中鸟类内耳的维护在体外在一个外界影响大大减少的环境中，可以通过去除耳周间质来促进外源性影响，否则它可能成为各种信号分子的来源[11,12]。我们尽可能通过胰蛋白酶温和的酶处理和仔细的解剖来清除耳囊周围的间充质组织。我们发现，在无血清悬浮培养7天后，去除耳周间质不会影响第16期耳囊泡生成主要内耳细胞类型的能力（图。). 具有明显间充质贡献的囊泡可产生具有软骨细胞形态的细胞（图。)被排除在本研究之外。本研究仅包括培养后未显示任何明显间充质贡献迹象的耳囊泡（图。).
第16期耳囊肿培养7天后，发育毛细胞和神经元，与间充质组织无关。（A）在培养7天的耳囊冷冻切片中可以清楚地看到耳周间充质的不完全去除。星号标记了具有软骨细胞形态的间充质衍生细胞的这一区域，该区域用指骨样蛋白标记不佳（如B所示），表明间充质衍生物中的F-actin水平较低。（B）绿色肌球蛋白VIIA免疫荧光显示毛细胞和神经元（红色β-III微管蛋白免疫荧光）在间质存在下发育。用柱状肽标记（蓝色荧光）观察丝状肌动蛋白（C）无间充质的耳囊肿不显示间充质衍生的细胞形态。（D）毛细胞（绿色）和神经元（红色）在无间充质的耳囊中发育。丝状肌动蛋白用指骨苷标记（蓝色荧光）可见。（E）β-III微管蛋白阳性轴突（红色）似乎与绿色（箭头）所示的肌球蛋白VIIA阳性毛细胞接触。（F）毛细胞产生的发束可以用espin抗体（绿色荧光）、毛细胞抗原（红色荧光）和丝状肌动蛋白（蓝色荧光）进行观察。
尽管自由漂浮的耳囊并没有分化成形态清晰、结构合理的内耳，但在培养7天后，它们在总细胞数方面表现出显著的一致性（每个耳囊约有40000个细胞；Mutai和Heller，未发表的数据）培养期间形成的毛细胞数量（每个耳囊648±117个毛细胞，n=8；约占总细胞数的1.6%）。我们用肌球蛋白VIIA抗体鉴定了毛细胞[13]并用发束标记物espin和毛细胞抗原的抗体标记他们的发束[14-16]（图。). 此外，在自由漂浮的耳囊中分化的毛细胞似乎与神经突起接触，并用神经元特异性β-III微管蛋白抗体进行鉴定（图。).
为了评估BMP信号对耳囊细胞和毛细胞生成的影响，我们分析了从每个实验组的单个样本中获得的完整系列切片。当在培养第三天添加外源性BMP4时，与未经处理的对照组相比，我们观察到毛细胞数量显著增加（图。)；通过肌球蛋白VIIA和毛细胞抗原双重免疫染色鉴定毛细胞。用noggin或可溶性BMP受体1a或1b蛋白阻断BMP信号，在培养7天后，毛细胞数量显著减少（图。). noggin对毛细胞生成的影响是剂量依赖性的，可以通过添加外源性BMP4来挽救（图。). 将培养物暴露于不同浓度的BMP4后，发现最佳浓度为3–5 ng/ml，从而产生最多的毛细胞（图，).
用外源性BMP4增加毛细胞的生成，并减少毛细胞数量以响应BMP信号的阻断。（A）冷冻切片耳囊中的毛细胞抗原（红色）和肌球蛋白VIIA阳性毛细胞（绿色）培养7天后。丝状肌动蛋白用指骨苷标记（蓝色荧光）可见。我们常规观察到上皮组织中的毛细胞（参见（F）中的高倍放大）和分散的毛细胞。（B）在培养的第三天应用5 ng/ml的BMP4，导致上皮细胞中的毛细胞数量以及分散的孤立毛细胞数量显著增加。（C）诺金在0.5μg/ml时会减少毛细胞的数量。（D）添加5 ng/ml外源性BMP4可以缓解noggin治疗（0.5μg/ml）的效果。（E）体外培养7天后，外源性添加BMP4对耳囊毛细胞数量影响的剂量依赖性。与对照条件相比，BMP4（3 ng/ml和5 ng/ml）显著增加毛细胞数量（星号表示对<0.05，未配对的学生t检验，n=4–5）。与未经处理的对照组相比，不同浓度的诺金和可溶性BMPR 1a和1b显著减少了培养7天后耳囊中检测到的毛细胞数量（星号表示对<0.003，未配对学生t检验，n=6-7）；添加5 ng/ml的BMP4可以完全挽救0.5μg/ml noggin的作用。误差线表示标准偏差。（F、G）高倍放大显示（A）和（B）中观察到的毛细胞形态。
BMP4抑制耳囊细胞增殖并诱导内耳神经节细胞凋亡
为了阐明BMP4对毛细胞生成增加的影响，我们分析了从培养第三天开始用外源性BMP4处理的培养物中的细胞增殖和凋亡。我们发现用BMP4治疗的耳囊增殖显著减少，而凋亡增加（图。). BMP4诱导的凋亡几乎只发生在我们使用耳蜗前庭神经元核的强胰岛-1免疫染色确定为神经元的区域（图。). Islet-1在发育中的内耳神经元和新生的感觉上皮中表达；与上皮染色相比，神经元胰岛-1染色的神经元核形状更圆，强度更高，因此很容易与胰岛-1阳性发育的感觉上皮区分开来（另请参阅[5]). 配对盒转录因子Pax-2在发育中的感觉上皮中表达，在耳蜗前庭神经节细胞中下调[17]因此，培养的耳囊中的神经元区域缺乏Pax-2表达（图。). 当用noggin阻断BMP信号传导时，整体细胞增殖没有显著增加，但神经元区域发生的凋亡较少，通过β-III微管蛋白染色鉴定（图。). 基于这些结果，我们排除了对BMP4的反应导致毛细胞数量增加的原因是细胞增殖率较高或凋亡率较低。
外源性BMP4导致培养耳囊神经结构域的整体增殖减少和凋亡增加。（A）在培养三天后，当以10 ng/ml或20 ng/ml的浓度添加到耳囊中时，添加BMP4后24小时的8小时BrdU脉冲测试表明，BMP4显著抑制增殖。（星号表示对<0.05（10纳克/毫升）和对<0.01（20 ng/ml），未配对学生t检验，n=7；误差条代表标准偏差）。（B）在培养三天后添加BMP4，在第七天分析时，导致TUNEL阳性细胞增加（星号表示对<0.01（10纳克/毫升）和对<0.001（20 ng/ml），未配对学生t检验，n=7；误差条代表标准偏差）。（C） 在培养第7天分析的对照耳囊切片中，TUNEL染色（红色）鉴定的凋亡细胞大多出现在Pax-2阳性区域以外（蓝色）。（D） 10 ng/ml的BMP4显著增加了由绿色胰岛-1阳性细胞核识别的潜在神经域中TUNEL阳性细胞的数量。（E，F）与（C，D）类似，但神经结构域标记有β-III微管蛋白抗体（以绿色显示）。注意神经域内TUNEL阳性细胞数量的增加。（G）诺金不影响凋亡细胞的数量。
在缺乏BMP信号的情况下，耳囊细胞无法参与感觉上皮的命运
内耳的感觉上皮细胞，包括毛细胞和支持细胞，来源于Pax-2阳性的祖细胞，也产生其他内耳细胞类型[17-20]。响应于用诺金阻断BMP信号传导，毛细胞数量的减少并没有伴随着可检测到的Pax-2阳性祖细胞的总体减少（图。). 当感觉上皮祖细胞形成感觉斑时，在毛细胞标记物开始表达之前，Pax-2表达降低，在新生毛细胞和支持细胞中都可以检测到胰岛-1[5,17]。我们发现，在诺金治疗的耳囊中，含有毛细胞的胰岛-1阳性上皮斑块明显减少，而胰岛表达更强烈的耳蜗前庭神经元明显没有受到影响（图。). 这些数据支持我们的假设，即Pax-2表达的祖细胞产生的感觉斑依赖于BMP信号。
在缺乏BMP信号的情况下，感觉上皮不能发育。（A、B）用0.5μg/ml noggin阻断BMP信号，可显著减少培养7天后可检测到的毛细胞抗原表达毛细胞（HCA以红色显示）的数量。似乎Pax-2的表达（以绿色显示）不受noggin的影响。（C、D）如这组具有代表性的图像所示，在经noggin治疗的耳囊中，胰岛-1阳性感觉上皮细胞（以绿色显示）明显减少，但并非完全消失（箭头）。所示图像不代表神经区域，我们观察到胰岛-1阳性神经元的总数（C和D中的箭头）在noggin处理的耳囊和对照耳囊之间没有差异（无显著差异，n=5）。（C）中的插图显示胰岛-1阳性感觉上皮的放大倍数较高（另见Li等人，2004b）。
BMP4通过下调Pax-2抑制细胞增殖
Pax-2在早期发育的内耳中的表达通常与细胞增殖增加和缺乏凋亡有关，这主要发生在Pax-2阳性区域以外[17,21]。当在第7天培养期开始时添加BMP4时，我们注意到Pax-2阳性细胞的数量显著减少，尽管对发育中的感觉上皮没有明显影响（图。). 蛋白质印迹分析证实BMP4以剂量依赖的方式下调Pax-2的表达（图。).
BMP4下调Pax-2。（A-C）对照组培养7天后。类似于体内情况[5]，（B）胰岛-1阳性细胞（绿色）出现在早期表达Pax-2的感觉上皮（红色）中；（C） 表达胰岛-1（绿色）的肌球蛋白VIIA阳性早期毛细胞（红色）出现在胰岛-1阳性上皮斑块内。（D-F）在培养期开始时用10 ng/ml BMP4处理的耳囊中，Pax-2的表达明显减少，而胰岛-1的表达和毛细胞的生成没有受到影响。（G）在比较的Western blot分析中，经BMP4治疗48小时的耳囊中，Pax-2蛋白水平明显降低。每条通道的蛋白质负载量为5个耳囊的总蛋白质。（H）与（G）中所示的实验类似，但BMP4治疗的持续时间缩短至24小时，每条车道的总蛋白负荷相等。（I-K）在25期鸡内耳冷冻切片中，BMP4 mRNA在基底乳头感觉上皮原基中表达（（I）中的黑色沉淀物）。（J） 当上皮性胰岛-1表达（以绿色显示）发生时，BMP4表达区的Pax-2蛋白表达（以红色表示）同时显著降低。面板（K）是（I）与（J）的合并图像。
在正常内耳中，BMP4 mRNA被用作标记物以可视化假定的感觉上皮[4-7]。在发育的关键时期，当感觉上皮细胞发生有丝分裂后，上皮胰岛-1的表达与BMP4的表达区域重叠（图。). 相反，在相同的假定感觉上皮中，Pax-2表达下调（图。)，表明BMP4在正常的内感觉上皮形成过程中起到抑制Pax-2表达的作用。
讨论
内耳感觉器官的形成需要BMP信号
在发育中内耳的所有感觉器官原基中发现BMP4 mRNA表达，这导致了这样一种假设，即该信号蛋白在内耳感觉上皮的诱导或分化中起作用[4,6]。然而，由于纯合BMP4基因敲除小鼠的寿命不会超过胚胎发育的第九天，因此在小鼠耳发育过程中分析BMP4功能是不可行的。
为了避免这个问题，我们使用了无血清漂浮培养技术，这使我们能够在受控环境中定量测试BMP4对鸟类内耳感觉上皮形成的功能。这种培养方法使我们能够使用细胞特异性标记物定量分析内耳细胞类型的产生。我们发现，培养7天的耳囊中形成的毛细胞数量远低于10天时鸡耳中发现的毛细胞的数量第个胚胎发育天数（E10；相当于E3加7天在体外). 然而，我们认为E10处的鸡内耳也比7天培养的耳囊大得多，这使得很难评估漂浮耳囊中毛细胞占总细胞数的约1.6%的比例是否与毛细胞的比例相当对E10内耳细胞总数。然而，我们认为我们观察到的影响在体外至少部分代表了发育中鸡耳不同毛细胞承载器官中的毛细胞群。尽我们所能，我们从E3耳囊中去除了耳周间质。本研究未对具有明显间充质贡献的标本进行评分。然而，我们没有观察到在具有明显间充质贡献的耳囊中可检测到的毛细胞和神经元的数量存在明显差异，这表明耳周间充质似乎对16期（E3）后的耳囊几乎没有影响。
应用noggin或显性负性BMP受体组合导致BMP信号缺失，显著减少了发育中耳囊中毛细胞的数量，这有力地支持了BMP信号是毛细胞生成所必需的假设。然而，即使在noggin或显性阴性BMP受体的最高浓度下，也无法完全阻断毛细胞的生成。我们怀疑，发育中感觉上皮中BMP信号的性质不允许应用可溶性抑制剂完全阻断。BMP4是一种分泌蛋白，与细胞表面受体结合以激活Smad信号通路（综述于[22,23]). 分泌的BMP4以旁分泌的方式作用于邻近细胞，如果这些细胞具有适当的BMP受体，则以自分泌方式作用于产生因子的细胞。我们假设细胞外BMP抑制剂不能完全干扰自分泌信号，导致不完全阻断同时表达BMP4和BMP受体的耳囊细胞中的BMP信号。
内耳BMP信号的干扰体内通过应用noggin或noggin产生细胞[9,10]导致半规管抑制或畸形，并伴有偶尔的壶腹变形。未报告对感觉上皮形成和毛细胞的影响；然而，这些研究并没有明确量化毛细胞的数量。另外，我们假设，将浸有noggin或noggin产生细胞的小球背侧移植到耳周间质中，显然不足以在数天的过程中在耳囊腹内侧区（感觉上皮的起源地）达到足够的抑制剂浓度。使用无血清漂浮培养环境，我们可以比以前更精确地控制BMP4或BMP信号抑制剂的浓度在ovo中实验。
BMP4促进毛细胞分化
外源性BMP4增加毛细胞数量有三种机制：1）促进感觉上皮祖细胞增殖，2）阻止祖细胞凋亡，或3）促进祖细胞向毛细胞分化。我们的结果表明，BMP4抑制耳囊细胞增殖，但只影响培养的耳蜗细胞的神经元区域的凋亡，这意味着BMP4增加毛细胞数量的一个可能机制是促进感觉上皮祖细胞分化。
BMP4对感觉上皮祖细胞作用的另一系列证据来自我们对noggin的功能丧失分析。在这里，我们发现noggin治疗不会影响Pax-2阳性细胞的数量，而毛细胞的数量则显著减少。这一结果表明，当BMP信号被阻断时，Pax-2阳性祖细胞无法分化为感觉上皮。
我们观察到BMP4治疗导致毛细胞生成增加和耳囊细胞增殖减少，这表明BMP4具有双重的浓度依赖性作用：浓度为3-5 ng/ml的BMP4可增强细胞分化。事实上，我们没有发现BMP4浓度低于10 ng/ml时对细胞增殖有明显抑制作用（数据未显示）。在较高的BMP4浓度（10-20 ng/ml）下，细胞增殖充分减少，以抵消BMP4对毛细胞分化的影响。BMP4的浓度依赖性双重效应的结果表现为毛细胞数量的钟形剂量依赖性（图。).
我们在此报道的BMP4对耳囊细胞增殖和凋亡的影响与以下结果不同，但并不矛盾：体内noggin对发育中鸡内耳的作用[9,10]。在这些实验中，将分泌noggin的小球或细胞移植到耳囊附近的间质后，细胞增殖减少，凋亡增加。我们认为，这些先前的分析和我们的实验方案不容易比较，因为许多因素可以解释观察到的差异。例如，与无间充质耳囊培养物相比，noggin与耳周间充质中潜在信号的相互作用可能对内耳组织产生不同的影响。另一种可能的解释是，我们的分析包括了所有的耳蜗囊肿衍生细胞，而之前的研究主要集中在围绕着分泌noggin的移植物的内耳发育部分。
BMP4促进感觉上皮祖细胞分化的作用与其在内耳感觉器官发育中的时空表达一致[4,6,7]。在毛细胞和支持细胞发育之前，BMP4 mRNA在所有感觉器官原基中表达。在感觉器官形成的关键时期，祖细胞下调Pax-2，离开细胞周期，开始分化为毛细胞和支持细胞；Pax-2随后在毛细胞中持续表达[5,17]。这些事件似乎与感觉斑片中BMP4的存在相关，支持BMP4在控制内耳感觉上皮细胞增殖和分化中的可能作用。
通过对BMP受体的表达和BMP信号通路的组成部分的分析，可以得出有关发育中内耳中BMP4潜在靶点的其他线索。除了斑马鱼耳朵和侧线发育的综合研究[24]，只有一项研究涉及发育中的鸡内耳BMP受体和Smad蛋白的表达，Smad蛋白是BMP信号的细胞内传感器[25]。尽管后一项研究的重点是BMP信号在半规管发育过程中的作用，但应注意的是，BMP受体在发育中的鸡内耳中的表达可能并不局限于感觉斑或Pax-2阳性结构域。BMP受体的更广泛表达可能是Pax-2蛋白显著下调的原因，我们在对BMP4治疗的自由漂浮耳膜中观察到了这种下调。至少在发育中的斑马鱼内耳中，几种BMP受体广泛表达，其中一些在所有发育阶段都普遍存在[24].
BMP4是发育中内耳增殖、分化和凋亡的关键控制因子
在内耳发育的早期阶段，耳板和耳窝的所有细胞都表达转录调节因子Pax-2。随后，在胚胎第三天明显可见，Pax-2表达更局限于耳囊的中腹部，即感觉上皮的起源区域[18-20]。在发育的这个阶段，细胞增殖主要发生在Pax-2表达域，而凋亡发生在Pax-2阳性域之外[17]。我们发现，当外源性BMP4添加到培养的耳囊中时，Pax-2阳性细胞和增殖细胞的数量显著减少。在Pax-2阳性细胞数量减少的同时，我们还检测到Pax-2蛋白的表达显著下调。在发育中的感觉斑中，我们能够观察到，就在胰岛-1表达明显的时候，BMP4 mRNA在早期感觉斑中可以检测到。感觉斑片中胰岛-1表达的开始与感觉上皮细胞的早期分化相一致[5]。同时，这些斑块中的Pax-2蛋白显著下调，这意味着BMP4也会导致Pax-2下调、增殖停止和早期分化感觉上皮标记物上调体内.
结论
总之，我们的结果表明BMP信号参与内耳感觉斑和毛细胞的生成。我们还发现，BMP4可以影响发育中内耳不同细胞群的细胞增殖和凋亡。因此，我们得出结论，正确控制发育中耳囊所有区域的BMP信号对获得内耳感觉器官正确形态发生所需的细胞增殖、凋亡和细胞分化的精确平衡至关重要。
方法
鸡胚
将白色莱霍恩毒株（查尔斯·里弗·SPAFAS）的受精鸡蛋储存在14°C下，直到胚胎发育开始，方法是将其放在摇动平台上，放入保持在38°C的加湿培养箱中。根据汉堡包和汉密尔顿的说法，胚胎是分阶段的[26].
耳囊培养
在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）中解剖15-16期胚胎的耳蜗细胞，并在胰蛋白酶（PBS中0.125%）中培养30秒，以帮助去除耳周间质。将耳囊快速转移到培养皿中的10mL无血清培养基中（非问题培养处理）。培养基由等量的高糖Dulbecco改良Eagle培养基和补充N2和B27的F12培养基混合（培养基和补充物来自Invitrogen/GIBCO/BRL，Carlsbad，CA）。BMP4、noggin和可溶性BMPR1a和BMPR1b来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。BMP信号拮抗剂在整个培养期间不断补充。BMP4从培养期开始或从培养第三天（72小时）开始施用。漂浮的耳囊保存在5%CO的加湿培养箱中2大气温度为37°C。为了进行定量分析，在培养的第七天采集培养的耳囊，用多聚甲醛（PBS中的4%）固定过夜，在蔗糖中冷冻48小时（PBS的30%），包埋在TissueTek（EMS）中，并用冷冻器（CM3050，Leica）连续切片（16μm厚）。
5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）标记
在特定时间点加入BrdU（Sigma）（3μg/ml），暴露时间为8小时，之后采集耳膜并进行冷冻切片处理。免疫组织化学检测BrdU掺入（见下文）。通过测定每个耳囊每个其他切片中BrdU阳性细胞占总细胞数的比例进行定量。
细胞凋亡标记
用TUNEL标记技术鉴定凋亡细胞[27]（TUNEL酶标试剂盒，罗氏）。固定切片用PBS清洗三次，每次5 min，用冰镇0.1%酒石酸钠处理2 min，并用荧光素-dNTP和末端脱氧核苷酸转移酶在37℃孵育1 h。用PBS三次洗涤后，对切片进行免疫染色，以获得额外的细胞标记（见下文）。
免疫组织化学
用1%牛血清白蛋白、5%热灭活山羊血清和0.1%Triton-100在PBS（PBT1）中阻断冰冻切片1h。对于BrdU标记，在添加一级抗体之前，将切片暴露于2N HCl中30分钟。然后将载玻片在4°C的PBT1中与稀释抗体孵育过夜：1:5000用于小鼠抗-HCA（G.Richardson的礼物[28])，1:3000用于兔抗肌球蛋白VIIA（a.El-Amraoui和C.Petit的礼物），1:100用于单克隆抗islet-1（克隆40.3A4，细胞培养上清液，发育研究杂交瘤银行，爱荷华大学，爱荷华市，IA），1:100用于兔抗Pax2（Covance，Princeton，NJ），1:500用于单克隆抗神经元特异性β-III微管蛋白（TuJ）（Chemicon）和1:1000用于小鼠抗BrdU（Sigma）。在室温下，用三次PBT1清洗和一次PBT2（与PBT1相同，但无血清）清洗15分钟，去除未结合抗体。FITC-结合、TRITC-结合和cy5-结合的山羊抗兔和抗鼠二级抗体（Jackson ImmunoResearch）在PBS中以1:400的稀释度使用。在二级抗体混合物中培养45-60分钟，然后在PBS内进行三次洗涤，每次洗涤15分钟。用长波长核染色剂TOTO-3（分子探针）进行反染色以显示细胞核，用TRITC结合的指骨样蛋白显示丝状肌动蛋白。用共焦显微镜（TCS SP2，Leica）分析盖玻片。对于定量研究，我们使用了在单个样本的所有连续切片中测量的数据，并且我们计算了来自至少三个独立实验的单个样本的平均值。为了计数标记的细胞核，我们使用ImageJ（Mac OSX版本1.31v，可在网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/). 16μm的切片厚度不能完全排除毛细胞的重复计数，但使用TOTO-3复染的完整系列切片进行的初步实验评估并没有发现任何证据表明我们的分析高估了毛细胞数量。不完整系列未用于细胞数量的定量评估。
现场杂交/荧光免疫染色
从1μg线性化质粒DNA合成地高辛标记的鸡BMP4正、反义探针（DIG RNA标记试剂盒，罗氏），再悬浮在100μl水中。现场杂交是通过将切片在100μl稀释探针（1:100）中加入50%（v/v）甲酰胺、10%（w/v）硫酸右旋糖酐、1mg·ml中再水化而开始的-1个酵母RNA，1×Denhardt溶液，185 mM氯化钠，5.6 mM氢氧化钠2人事军官4，5 mM钠2高功率放大器4pH7.5，5 mM EDTA和15 mM Tris，预热至70°C。在盖玻片并在65°C下在150 mM NaCl中加入50%（v/v）甲酰胺和pH7（1×SSC）下加入15 mM柠檬酸三钠的加湿室中过夜培养后，在5×SSC中取出盖玻片，并分别在50%（v/v）甲胺和0.1%（v/v）聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯（吐温-20）中清洗玻片两次，每次30分钟65°C时，1×SSC。此后，在0.2×SSC中清洗载玻片15分钟，在室温下在PBS中清洗15分钟。
对于第一次抗体检测，在PBT1中阻断切片1小时。然后在室温下将载玻片与PBT1（1:1000；Boehringer Mannheim）中碱性磷酸酶结合的抗地高辛Fab片段孵育2 h。通过在PBS2中洗涤两次，每次30分钟来去除未结合的Fab片段。为了进行检测，用100μl硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸底物（1-STEP NBT/BCIP，Pierce）覆盖切片，盖玻片，并在室温下在加湿室中培养过夜。对于荧光抗体的第二次免疫染色，取下PBS中的盖唇，将载玻片与Pax-2和胰岛-1的初级抗体在PBT1中4°C孵育过夜。如上所述，通过共焦显微镜进行荧光二级抗体检测和图像采集。
蛋白质印迹分析
蛋白质在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并使用半干转移系统（Trans-Blot SD，BioRad）转移到硝化纤维素膜。用蛋白质分析试剂盒（BCA试剂盒，PIERCE）测定总蛋白质的相对含量和样品之间的浓度差异。在室温下，在2.5%（vol/vol）液块（Amersham Pharmacia Biotech）和PBS中0.1%（vol/vol）吐温-20中培养Western印迹膜1小时。将Pax-2抗血清在2.5%的液块（vol/vo）和PBS中以1:250稀释，并在4°C的稀释抗血清中培养印迹过夜。在室温下，在0.1%吐温-20的PBS中，通过四次洗涤去除未结合的一级抗体，每次洗涤15分钟。用辣根过氧化物酶偶联的兔IgG抗体（Amersham Pharmacia Biotech）在0.1%吐温-20的PBS中以1:7500的稀释度检测结合的一级抗体。通过在PBS中分别用0.1%吐温-20和PBS中各用两次15分钟的洗涤液洗涤两次，去除未结合的二级抗体。使用化学发光底物（ECL plus，Amersham Pharmacia Biotech）和超膜ECL（Amersham-Pharmacia-Botech）进行检测。
作者的贡献
HuL进行了大多数耳泡培养实验、免疫组织化学、原位杂交、显微镜成像和统计分析。EC参与免疫组化和定量分析，并进行Western blot实验。ZW、YZ和YW为观察到的影响提供了确凿证据，并提供了额外的定量数据。HoL进行了冷冻切片和器官型培养实验。HuL和SH构思了这项研究，HuL起草了手稿，SH定稿，所有作者都阅读并批准了手稿。
致谢
作者感谢D.K.Wu博士提供的鸡BMP4 cDNA和Sabine Mann对Western blot分析的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）DC04563和DC006167（S.H.）的资助，以及美国国家自然科学基金会（National Nature Science Foundation of China）的P30 DC05209核心资助，30271397资助，以及上海市科学技术委员会（Shanghai Science and Technology Commission）的04JC14094资助（均为H.L.）。
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