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《维罗尔杂志》。2005年9月；79(17): 11335–11342.
数字对象标识：10.1128/JVI.79.17.11335-11342.2005
预防性维修识别码：193615英镑
PMID：16103185

严重急性呼吸综合征相关冠状病毒特异性蛋白增强减毒鼠冠状病毒的毒力

勒西亚·佩韦,1,† 周海霞,2,† 杰森·奈特兰,1 钱德拉·坦古杜,三 海蒂·奥利瓦雷斯,三 雷氏,4 德怀特看,4 托马斯·加拉格尔,三和斯坦利·帕尔曼1,2,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

大多数可感染严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARS-CoV）的动物物种不会再发生临床疾病，阻碍了发病机制的研究。为了开发一种用于研究严重急性呼吸系统综合征冠状病毒的替代系统，我们将个体严重急性呼吸系统综合征冠状病毒基因（开放阅读框[ORFs]）引入减毒小鼠冠状病毒的基因组中。一种蛋白质，SARS-CoV ORF6的产物，将亚致死性感染转化为均匀致死性脑炎，并增强了病毒在组织培养细胞中的生长，表明SARS-CoV蛋白质在异源冠状病毒感染的情况下发挥作用。此外，这些结果表明，减毒鼠冠状病毒缺乏SARS-CoV中的毒力基因。重组鼠冠状病毒可引起一种可复制且特征明确的临床疾病，几乎不会给实验室人员带来任何风险，并且有助于阐明SARS-CoV非结构蛋白在病毒复制和发病机制中的作用。

2003年，严重急性呼吸综合征（SARS）首次被确定为具有高发病率和高死亡率的临床实体，此后不久，它被证明是由一种新型冠状病毒（SARS-CoV）感染所致(23). SARS-CoV是迄今为止发现的人类冠状病毒中最严重的疾病。然而，其他几种冠状病毒，包括传染性胃肠炎病毒、传染性支气管炎病毒和猫传染性腹膜炎病毒，在受感染的动物中造成大量的发病率和死亡率。在研究最深入的冠状病毒感染中，感染小鼠肝炎病毒（MHV）嗜神经毒株的啮齿动物会发生急性脑炎和急性及慢性脱髓鞘疾病(30). MHV诱导的脱髓鞘主要是免疫介导的。免疫缺陷小鼠（患有严重联合免疫缺陷或重组激活基因1活性缺陷的小鼠）感染MHV后不会发生脱髓鞘。然而，在转移抗MHV T细胞或抗体几天后检测到脱髓鞘(13,16,37)免疫反应也可能导致SARS患者的临床疾病，因为随着病毒清除，一些患者的病情恶化(24). SARS-CoV和其他冠状病毒一样感染巨噬细胞，这也可能导致免疫功能障碍(39). 虽然这些结果表明宿主反应在SARS发病机制中发挥作用，但由于缺乏可靠的动物模型，对疾病过程的研究受到限制。小鼠、仓鼠、雪貂、猫和猴子容易感染，但实验室之间对这些动物在受感染器官中表现出临床症状和病理变化的程度缺乏一致意见（参考文献综述23). 除小鼠外，很少有试剂可用于研究免疫反应，免疫活性小鼠不会出现临床疾病(32). 此外，使用SARS-CoV活疫苗需要一个3级生物安全实验室。

作为直接感染动物SARS-CoV的替代方法，我们设计了一组表达SARS-CoV蛋白的重组MHV。我们推断SARS-CoV蛋白，特别是非结构蛋白，将在MHV的背景下发挥作用，因为MHV和SARS-CoV都是第2组冠状病毒(10). 此外，一些流行病学和遗传学研究表明，SARS-CoV越过了棕榈果子狸和其他外来动物的物种屏障，感染人类(24). 这些动物可能不是SARS-CoV的自然宿主；另一种动物，例如啮齿动物，实际上可能是主要宿主。在这两种情况下，一旦SARS-CoV能够跨种系感染，SARS-CoV蛋白，包括非结构蛋白，可能会在新宿主中发挥作用。SARS-CoV感染几种实验动物的能力也支持这一观点。重组MHV具有几个优点。首先，多年来在多个实验室对MHV进行了研究，没有任何证据表明实验室人员存在风险。其次，许多实验室菌株，包括我们研究中使用的菌株，对未感染的小鼠没有风险，因为它们不会传播到同一笼子中未感染的动物（未发表的观察结果）。第三，对MHV的先天性和适应性免疫反应进行了广泛研究(11)和试剂可用于研究T细胞和B细胞对重组MHV感染的反应。

我们的初步分析旨在研究SARS-CoV非结构蛋白在小鼠疾病中的作用。与其他冠状病毒一样，SARS-CoV基因组在基因组的3′端包含几个新的开放阅读框（ORF）。据预测，这些ORF编码的蛋白质与任何其他病毒或细胞蛋白质没有同源性。每个冠状病毒都表达一组独特的非结构蛋白。冠状病毒非结构蛋白的一般特征是它们在组织培养细胞中不需要生长(18). 然而，它们很可能在受感染动物的病毒生长中发挥作用。鉴定这些病毒蛋白的功能具有挑战性，因为在某些情况下，它们的缺失并没有影响病毒引起急性疾病的能力(22). 在这里，我们证明SARS-CoV非结构基因可以在MHV基因组的背景下表达，并且我们还描述了表达这些蛋白之一的重组MHV的初始特征。

材料和方法

动物。

在40μl Dulbecco改良的Eagle’s培养基中，用1000 PFU的病毒经头颅内（i.c.）接种特定的5至6周龄C57BL/6（B6）小鼠（马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所）。每天对小鼠进行检查和称重。使用之前描述的量表评估小鼠的临床疾病(5)如下：0，无症状；1、尾巴无力或略驼背；2、步态不稳或驼背或轻度脑炎；3、后肢麻痹或中度脑炎；4、四肢瘫痪或严重脑炎；5，奄奄一息。在所有实验中，小鼠在感染后21天被安乐死（p.i.）。从受感染的中枢神经系统（CNS）中采集病毒，通过对表达小鼠肝炎病毒细胞受体（HeLa-MHVR）的HeLa细胞进行斑块试验来测定病毒滴度。所有动物研究均由爱荷华州大学动物保护和使用委员会批准。

病毒和细胞。

病毒在17Cl-1细胞中生长，并在HeLa-MHVR细胞上测定滴度。用重组MHV感染小鼠17Cl-1和L929细胞以及人HeLa MHVR细胞。在所有测定病毒滴度的实验中，在测定滴度之前，将细胞和上清液合并。

重组病毒。

靶向重组(17,22)用于产生表达单个SARS-CoV非结构蛋白的重组病毒（图。1A和B). 简言之，使用从感染SARS-CoV Urbani株的细胞（GenBank登录号：AY278741号; 由佐治亚州亚特兰大疾病控制和预防中心的Tom Ksiazek提供）。通过添加一些SARS-CoV毒株中存在但Urbani毒株中没有的29-核苷酸序列，ORF8产物进一步被修饰(三). 反向引物还编码流感血凝素（HA）表位以监测其表达。PCR产物被插入含有神经衰弱型MHV J2.2-v-1变异体基因2-9的质粒的基因4(8,16)（图。​（图1）。1). 菌株J2.2-v-1与神经毒性菌株JHM不同。通过S蛋白（L1114F）的单一突变实现SD，如图所示。​图11(15,35). 用T7聚合酶转录供体RNA，并将其转染到之前感染fMHV-JHM（编码猫表面[S]糖蛋白的重组MHV株）的猫细胞（AK-D）中[22])。fMHV-JHM不会感染小鼠细胞，但表达MHV S蛋白的重组病毒会感染，从而可以在17Cl-1小鼠细胞上高效选择重组病毒。作为编码ORF6（rJ2.2.6）的重组病毒研究的对照，设计了第二组病毒，其中使用重叠延伸PCR在氨基酸27处引入终止密码子（pJ2.2.6特朗克). 作为另一个对照，病毒也被开发出来，其中ORF6特朗克引发剂蛋氨酸突变为赖氨酸（J2.2.6击倒对手). 在用于进一步研究之前，通过序列分析证实了引入的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒RNA的存在。为了控制靶向重组过程中可能发生的任何有害突变，在这些研究中分析了每个重组病毒的至少两个独立分离物。这两个分离物获得了相同的结果，在下文所述的研究中结合了这两个菌株的数据。此外，重组病毒分离株rJ2.2、rJ.2.2.6.1和rJ2.2.6的S基因击倒对手测序后发现与质粒序列相同，从而排除了S中可能影响毒力的虚假突变。

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rJ2.2感染细胞中SARS-CoV非结构ORF的表达。（A） SARS-CoV基因组，含ORF和结构蛋白（灰色）。（B） 如材料方法所述，通过靶向重组（如rJ2.2.6所示）将SARS-CoV非结构蛋白引入rJ2.2。作为对照，在rJ.2.2.6的残基27处引入终止密码子特朗克和rJ2.2.6击倒对手引发剂蛋氨酸也在rJ2.2.6中发生突变击倒对手每个构建体都是带有流感病毒HA表位标记的C末端。（C） ORF3a、-6和-7b的产物用抗HA抗体进行Western blot分析。车道：1，rJ2.2；2，rJ2.2.6；3，rJ2.2.3a；4，rJ2.2.3b；5，rJ2.2.7a；6，rJ2.2.7b；第7章第J2.2.8条。（D） 所有插入的蛋白都用抗HA抗体通过IFA检测。显示了ORF3b、-7a和-8的产物。请注意，蛋白质3b定位于细胞核。感染rJ2.2（WT）的细胞未检测到染色。

蛋白质印迹分析。

17Cl-1细胞感染表达SARS-CoV蛋白的重组MHV（感染多重性[MOI]=1），于16h p.i收获。使用生物素化大鼠抗HA抗体（单克隆抗体[MAb]3F10；德国曼海姆Roche Molecular Biochemicals）通过免疫印迹分析检测HA标记的SARS-CoV蛋白和链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Jackson Immunoresearch，West Grove，PA）。使用ECLplus检测试剂盒检测蛋白质（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。

免疫荧光分析。

用甲醇将感染重组MHV的17Cl-1细胞固定在每天8至9小时。使用抗HA小鼠抗体（MAb HA.11；加州伯克利市Covance）、生物素化山羊抗鼠抗体（Jackson Immunoresearch）和链霉亲和素Cy3（Jackson-Imunoresource）检测SARS-CoV蛋白。为了定位ORF6蛋白，用rJ2.2.6感染L929细胞，并在12~16 h p.i固定。对样品进行ORF6蛋白质（MAb 3F10，生物素结合；罗氏）和内质网蛋白（BiP；MAb 10C3；Stressgen Biochents，维多利亚，CA）或MHV结构蛋白（跨膜[M]MAb 5B11.5，表面[S]的双重染色MAb 4B11.6和核衣壳[N]MAb 5B188.2）（均由M.Buchmeier，The Scripps Research Institute，La Jolla，CA提供）。然后用异硫氰酸荧光素结合的驴抗鼠抗体（Jackson Immunoresearch）和TSA-Cy3扩增试剂盒（马萨诸塞州波士顿Perkin-Elmer）培养细胞。

实时RT-PCR。

按照制造商的指示，使用Tri试剂（俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心公司）从大脑中分离出总RNA。cDNA的合成如前所述(26). 将两微升cDNA添加到含有2×SYBR Green Master Mix（ABI，Foster City，CA）和0.2μM每个正反义引物（IDT DNA，Coralville，IA）的23μl PCR鸡尾酒中。在ABI Prism7700热循环仪中进行扩增。利用熔融曲线分析证实了扩增的特异性。数据由ABI Prism 7700软件收集和记录，并表示为阈值周期的函数(计算机断层扫描)，给定反应管中荧光强度高于背景的周期（计算为基线周期内所有孔中荧光平均标准偏差的10倍）。用于MHV-JHM和小鼠管家基因的特异性引物组如下（5′至3′）；JHM核衣壳义；JHM核衣壳反义；次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）义；HPRT反义，CAGATTCAACTTGTGCTCATC。定量JHM核衣壳（N）丰度计算如下：对于每个分析的cDNA样本，计算机断层扫描测定了JHM核衣壳和HPRT扩增反应的值。JHM编号计算机断层扫描通过减去计算机断层扫描对于HPRT（Δ计算机断层扫描). JHM N RNA与HPRT RNA的比率由公式2计算−(Δ计算机断层扫描)使用连续10倍稀释的cDNA验证了该方法的有效性。发现JHM核衣壳反义和小鼠HPRT扩增子的扩增效率是相同的。

代谢放射标记和免疫沉淀分析。

80%的融合L929或HeLa-MHVR细胞感染了重组MHV（MOI=1）。在指定的时间，将细胞清洗，置于无蛋氨酸培养基中，并用50μCi的反式35S-label（ICN Biomedicals，Inc.，俄亥俄州奥罗拉）。如前所述制备细胞裂解物(20). 用兔抗MHV抗体和抗原-抗体复合物将MHV蛋白免疫沉淀到蛋白A-Sepharose珠上（瑞典乌普萨拉Amersham Pharmacia Biotech AB）。样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

为了评估ORF6是否与病毒相关，感染细胞的上清液在2000×克在5°C下清除碎屑，然后在20000×克在5°C下保持10分钟。将澄清培养基覆盖在HNB中的线性3-ml 10-30%（wt/wt）蔗糖梯度上（25 mM HEPES钠[pH7.4]，100 mM NaCl，0.1%牛血清白蛋白）。在5°C下，在SW60转子中以55000 rpm的转速离心1小时。倾析梯度，在凝胶电泳和随后的HA-标记ORF6蛋白免疫印迹之前，将含有完整病毒离子的颗粒溶解在0.1 ml十二烷基硫酸钠裂解缓冲液中（62 mM Tris HCl[pH6.8]，2%十二烷基硫酸纳，5%2-巯基乙醇，2.5%Ficoll，0.01%溴酚蓝）。

Northern印迹分析。

RNA从感染重组MHV的L929培养物和模拟感染培养物中制备，并按前面所述进行分析(22).

流式细胞术。

从感染的CNS中采集白细胞(25)并分析中性粒细胞、巨噬细胞、MHV特异性CD4 T细胞和CD8 T细胞。简单地说，用磷酸盐缓冲盐水灌注小鼠，取下大脑和脊髓。在磨砂玻璃载玻片之间研磨组织，并在含有10%胎牛血清的5 ml RPMI培养基中通过强力吸管研磨。在组织完全分散后，加入Percoll（Pharmacia，Uppsala，Sweden）至30%的最终浓度。裂解液以1300×克在4°C下保持30分钟。抽吸Percoll和脂质层，清洗细胞颗粒并计数。用于表型分型细胞的抗体是生物素化的大鼠抗小鼠F4/80（cl BM-8；加利福尼亚州伯林盖姆的Caltag实验室）、结合了环肽叶绿素蛋白的大鼠抗小鼠CD45（加利福尼亚州圣地亚哥的BD生物科学公司）和异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠Ly6G（MAb 1A8；BD生物科学公司）。在所有病例中，均使用了同种匹配的对照抗体。如前所述，使用细胞内γ-干扰素（IFN-γ）检测试验鉴定MHV特异性CD4和CD8 T细胞(36). 样品在FACScan流式细胞仪（BD Biosciences，Mountain View，CA）上进行分析。

干扰素-α/β生物测定。

采用基于抑制L929细胞中水泡性口炎病毒（VSV）生长的生物测定法测定IFN-α/β水平。L929细胞以0.1的MOI感染重组MHV。采集上清液，紫外线灭活MHV。用上清液或重组小鼠干扰素-β（PBL Biomedical Laboratories，Piscataway，NJ）稀释液在30 min p.i.下处理感染1000 PFU的L929细胞。在Vero细胞上测定VSV的滴度。根据重组干扰素生成的标准曲线计算干扰素-α/β水平。为了验证L929细胞产生干扰素，用25μg poly（I-C）（Invivogen，San Diego，CA）处理样品，并对上清液进行分析。

对干扰素-β的敏感性。

rJ2.2.6和rJ2.2.6的相对灵敏度击倒对手通过用干扰素-β系列稀释液处理感染的L929细胞，测定干扰素与β的比值。每次30分钟添加干扰素-β。；在一些实验中，用相同浓度的IFN-β预处理细胞24小时。在HeLa-MHVR细胞上测定MHV滴度。作为对照，将VSV感染的L929细胞与干扰素-β平行处理，并在Vero细胞上测定病毒滴度。

逆转录病毒结构。

ORF6-HA被克隆到pBMN-IRES-GFP中，并通过磷酸钙沉淀（Nolan实验室网站协议）转染到Phoenix-Eco细胞（由斯坦福大学G.Nolan提供）。收集逆转录病毒颗粒并使用Polybrene将其转导至L929细胞。两次传代后，绿色荧光蛋白阳性（GFP+)流式细胞术对细胞进行分类。ORF6-HA蛋白的存在通过使用抗HA抗体的间接免疫荧光分析（IFA）确认。

统计。

一个双尾未成对学生的t吨测试用于分析组间平均值的差异。所有结果均表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。

结果

表达SARS-CoV非结构蛋白的重组MHV的开发和分析。

我们选择特征良好的MHV减毒rJ2.2变异体作为开发重组病毒的底物。此前，我们发现将外源基因插入MHV ORF4不会影响其在组织培养细胞中的生长能力，也不会导致小鼠急性神经疾病(22). 因此，我们将SARS-CoV特定ORFs 3a、3b、6、7a、7b和8插入该站点。在每种情况下，在序列的3′端插入HA表位标签以便于检测。通过免疫印迹法检测ORF6-HA、ORF3a-HA和ORF7b-HA（但不是ORF-3b、ORF-7a和ORF-8）（图。​（图1C）。1摄氏度). IFA在感染细胞的细胞质中检测到除ORF3b-HA外的所有六种蛋白，ORF3b-HA定位于细胞核（图。​（图1D）。一维). 接下来，我们用每种重组病毒的1000 PFU以及rJ2.2接种B6小鼠，并监测临床结果。初步分析表明，感染rJ2.2.6（表达ORF6-HA的MHV）比感染任何其他重组病毒或rJ2.2导致更高的发病率和死亡率。基于这些结果，我们更详细地分析了rJ2.2.6的感染情况。值得注意的是，ORF6蛋白在所有SARS-CoV分离物中都是完全保守的，并且与任何已知的病毒或细胞蛋白没有同源性。ORF6蛋白的序列表明它与膜相关。

ORF6蛋白表达将亚致死感染转化为致命感染。

作为rJ2.2.6实验的对照，我们设计了第二组重组病毒，其中在氨基酸27（rJ2.2.5）处引入终止密码子特朗克)以及包含终止密码子和突变起始密码子（蛋氨酸到赖氨酸）的第三组密码子（rJ2.2.6击倒对手). 对于所有实验，分析每个重组病毒的两个独立分离物，以控制重组过程中引入的任何突变。我们通过静脉接种将每种重组病毒的1000个PFU感染B6小鼠，并监测动物的体重减轻、临床症状和死亡情况。我们将所得结果与rJ2.2.6相结合特朗克和rJ2.2.6击倒对手（标记为rJ2.2.6KO+截断因为它们无法区分。与感染rJ2.2或rJ2.2.6的小鼠相比，感染rJ2.2.6的小鼠在p.i.早期出现临床疾病和体重减轻KO+trunc（图。2B和C). 此外，超过75%的rJ2.2.6感染小鼠在第9天p.i.死亡。；相反，70%或83%的小鼠感染rJ2.2.6KO+trunc或rJ2.2存活到第21天献祭（图。​（图2A）。2年). rJ2.2.6感染小鼠的死亡率增加与较高的病毒滴度相关（图。​（图2D），二维)，尽管与感染rJ2.2.6的小鼠相比，仅在每次>6天时才观察到滴度的显著差异KO+trunc当通过Northern blot分析（数据未显示）或实时PCR（图。​（图2E第二版).

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感染rJ2.2.6和rJ2.2.7小鼠的死亡率、发病率和病毒滴度特朗克，或rJ2.2.6击倒对手小鼠感染了rJ2.2（三角形）、rJ2.2.6（开放圆）或rJ2.2.5特朗克或rJ2.2.6击倒对手（正方形），并监测死亡率（A）、临床疾病（B）和体重减轻（C）。6 rJ2.2-、38 rJ2.2.6-30 rJ2.2.6组特朗克-或rJ2.2.6击倒对手-这些研究中使用了感染小鼠。（D） 还测定了中枢神经系统病毒滴度。为此，共使用了212只小鼠。与感染rJ2.2.6的小鼠相比，感染rJ2-2.6的小鼠的CNS中检测到病毒滴度显著增加trunc+KO（第1.5天，P（P）= 0.38; 第3天，P（P）= 0.23; 第6天，P（P）< 0.01; 第7天，P（P）= 0.056; 第9天，P（P）<0.001）。与感染rJ2.2的小鼠（第7天，P（P）< 0.05; 第9天，P（P）< 0.005). 面板B、C和D显示了感染rJ2.2.6的小鼠第0天到第9天的数据，因为在此之前只有23%的小鼠存活。rJ2.2.6的数据特朗克-和rJ2.2.6击倒对手-受感染的小鼠合并在一起，因为感染了这些病毒的小鼠会产生相同的临床疾病。（E） 从感染rJ2.2.6的小鼠大脑中提取RNA（开放条；n个=3）或rJ2.2.6击倒对手（封闭钢筋；n个=3）在每个时间点。如材料和方法中所述，通过实时RT-PCR定量N基因特异性RNA的数量。

感染rJ2.2.6导致中性粒细胞浸润增加。

这些结果表明，与控制病毒相比，rJ2.2中的ORF6-HA蛋白导致临床疾病和死亡大大增加。我们推测ORF6蛋白可能促进MHV生长，或者可能抑制先天性或适应性抗病毒免疫反应。最初，我们通过组织学检查和流式细胞术研究了ORF6-HA对小鼠MHV炎症细胞反应的影响。当用苏木精和伊红染色后检查感染小鼠的切片时，我们没有发现炎症细胞浸润程度的实质性差异。在每次1.5、3和6天时从感染的CNS和中性粒细胞（CD45）中采集细胞你好80层/四层−赖氨酸6G+)和巨噬细胞（CD45你好80层/四层+)如材料和方法中所述列举。我们检测到，与感染rJ2.2.6的小鼠相比，感染rJ2-2.6的小鼠大脑中中性粒细胞的频率（第3天和第6天p.i.）和数量（第3天p.iKO+trunc（表​（表11).

表1。

中枢神经系统中巨噬细胞和中性粒细胞的频率和数量

病毒和组(n个)一起始编号（105)巨噬细胞
中性白细胞
%编号（104)%编号（104)
第J2.2.6条
    第1.5（6）天7.5 ± 1.347.2 ± 4.97.8 ± 2.79.7 ± 1.51.4 ± 0.3
    第3天（6）7.5 ± 1.033.6 ± 3.314 ± 3.032.6 ± 5.3b条12 ± 3.0b条
    第6天（4）12 ± 2.012.7 ± 0.87.6 ± 2.24.8 ± 1.0b条2.5 ± 0.4b条
第J2.2.6条trunc和KO
    第1.5（6）天4.5 ± 0.642.6 ± 2.64.7 ± 1.012.8 ± 2.71.6±0.6
    第3天（10）5.8 ± 0.832.7±2.86.7 ± 2.314.7 ± 2.52.7 ± 0.9
    第6天（6）13 ± 1.021.2 ± 2.916 ± 3.02.5 ± 0.31.8 ± 0.2
一分析的单个小鼠数量。
b条rJ2.2.6感染的CNS在第3天出现中性粒细胞增多（频率和数量）(P（P）<0.005）和第6天p.i(P（P）频率<0.05；P（P）=0.13（对于数字）。数值为平均值±SEM。

B6小鼠的抗MHV T细胞反应主要针对两个CD8 T细胞表位（跨越S蛋白510到518个残基[表位S510]和598到605个残基）和一个免疫显性CD4 T细胞表表位（包含M蛋白134到147个残基[表位M134]）(1,2,38). 当分析CD4和CD8 T细胞反应时，感染rJ2.2.6的小鼠的CNS中检测到的表位特异性细胞数量少于感染rJ2.2的小鼠KO+trunc，但这些差异在统计学上并不显著（表​（表2）。2). 总之，这些结果表明，ORF6蛋白的存在在很大程度上增加了中性粒细胞对中枢神经系统的浸润，但并未显著影响T细胞反应。

表2。

中枢神经系统中MHV表位特异性CD4和CD8 T细胞的数量（第7天p.i.）

病毒(n个)一%CD8（CD8）表位S510（CD8）
%CD4细胞表位M134（CD4）
%编号（104)%编号（104)
rJ2.2.6（8）32.7 ± 3.2b条10.8 ± 1.33.8 ± 0.615.0±1.75.3 ± 0.90.7 ± 0.1
第J2.2.6条截断和KO（6）26.4 ± 3.215.7 ± 2.54.8 ± 1.615.4 ± 3.76.7 ± 1.31.2 ± 0.6
一分析的单个小鼠数量。
b条数值为平均值±SEM。

感染rJ2.2.6导致组织培养细胞中的病毒生长增加。

为了研究ORF6蛋白在促进病毒生长或抑制先天性免疫反应中的作用，我们用rJ2.2.6、rJ2.2.5感染17Cl-1、L929和HeLa-MHVR细胞击倒对手或rJ2.2。17-Cl-1和HeLa-MHVR细胞极易感染MHV，而L929细胞则不易感染。在所有情况下，感染rJ2.2.6导致细胞病变的发展比感染任何对照病毒更快。然而，L929的差异最为显著，部分原因是该细胞系中的MHV感染动力学慢于其他两个细胞系。用rJ2.2.6感染L929细胞导致合胞体更早出现，伴随而来的病毒滴度增加，每次检测48小时（图。​（图3A）3A级)与感染rJ2.2.6的细胞相比击倒对手与感染rJ2.2.6的细胞相比，感染rJ2-2.6的L929细胞中的病毒RNA和蛋白质水平也增加击倒对手（图。3B和C). 两个不同的分离物rJ2.2.6和rJ2.2.5获得了相同的结果击倒对手（图。​（图3C3C公司).

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rJ2.2.6-和rJ2.2.6中的病毒滴度和干扰素反应击倒对手-感染L929细胞。（A） L929细胞感染rJ2.2.6或rJ2.2.7击倒对手MOI为1。在指定的时间收获三份细胞，并在HeLa-MHVR细胞上测量病毒滴度。开放圆，rJ2.2.6；正方形，rJ2.2.6击倒对手图中显示了滴定和SEM。（B） 感染rJ2.2.6（通道2、4和6）或rJ2.2.7的L929细胞击倒对手（通道3、5和7）用Tran脉冲标记35在17小时（第2和第3车道）、22小时（第4和第5车道）和29小时（第6和第7车道）时贴上S标签30分钟，并按照材料和方法中的说明进行处理。泳道1显示模拟感染细胞。显示了N和S蛋白。每条车道装载50微克蛋白质。（C） 感染rJ2.2.6的L929细胞（1道和2道；两个分离株）于16h p.i.时获得RNA，rJ2.2.7击倒对手（泳道3和4；两个分离株）或rJ2.2（泳道5）或模拟感染细胞（泳道6），并如材料和方法中所述进行分析。每条车道装载10微克RNA。病毒RNA 1（基因组）和2至7（亚基因组）如右图所示。（D） 感染rJ2.2（虚线）、rJ2.2.6（开放圆）或rJ2.2.7前24小时击倒对手（平方），用指示浓度的干扰素-β处理一式三份细胞。感染后（MOI=0.1），在相同浓度的干扰素存在下培养细胞20小时。然后采集样本，并在HeLa-MHVR细胞上测定病毒滴度。

L929细胞具有完整的IFN-α/β生成和信号通路。由于SARS-CoV抑制IFN-β的表达(29)干扰素-α/β治疗只能适度抑制SARS-CoV复制(4,12,27,31)接下来，我们评估了ORF6-HA对干扰素-α/β诱导或信号传导的抑制是否有助于rJ2.2.6感染小鼠的致死率增加。首先，感染rJ2.2.6或rJ2.2.5的细胞上清液中的IFN-α/β水平击倒对手如材料和方法中所述，使用生物测定法进行测量。与以前的报告一致(9)重组MHV均未诱导IFN-α/β（<1 U/ml），而poly（I-C）处理可显著诱导IFN-。其次，在感染rJ2.2.6或rJ2.2.5前后，用不同浓度的干扰素-β处理细胞击倒对手虽然rJ2.2.6的滴度始终高于rJ2.2.5，但两种病毒都表现出类似的干扰素-β抑制模式击倒对手在分析的每个IFN-β浓度下（图。​（图3D三维).

这些结果并不表明ORF6-HA的主要作用是抑制干扰素的产生或信号传导。在其他几种感染中，病毒蛋白通过灭活特定的翻译起始因子来抑制宿主细胞蛋白质的合成。反过来，病毒也发展了一些机制，例如利用内部核糖体进入位点，在没有失活因子的情况下增强病毒蛋白的翻译。为了确定ORF6-HA是否抑制宿主细胞蛋白质合成，我们用rJ2.2.6或rJ2.2.7感染HeLa-MHVR细胞击倒对手并使用[35S] 蛋氨酸-半胱氨酸脉冲标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳。ORF6蛋白的存在不会影响在p.i.4、8或12 h时的残留宿主蛋白合成量（数据未显示）。

总之，这些结果与ORF6在感染MHV的情况下直接增强病毒在感染细胞中的生长这一概念是一致的。我们确定ORF6产物没有优先结合到病毒粒子中（图。​（图4），4)，使其不太可能通过增强分泌颗粒的特定传染性而发挥作用。由于冠状病毒复制和组装发生在细胞膜上，ORF6的一级结构表明它与膜相关，我们接下来确定ORF6-HA是否与任何主要MHV结构蛋白或内质网（BiP）标记物共定位（图。​（图5）。5). MHV M蛋白定位于感染细胞中的高尔基体，并作为这种结构的标记(18). ORF6-HA广泛分布于细胞质中。用表达ORF6-HA的逆转录病毒转导的L929细胞显示出类似的模式，表明ORF6蛋白不需要任何其他病毒蛋白进行细胞内定位。合并后的复合图显示与M蛋白的共定位最强，但与S、N和BiP蛋白也有显著重叠。这种标记表明ORF6-HA与整个细胞的膜相关，尽管大多数存在于内质网和高尔基体室中。

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S和ORF6-HA蛋白在感染细胞培养物中的分布。感染rJ2.2.6（MOI=0.05）的17Cl-1细胞在24小时后被洗涤剂溶解。（A）使用MAb 10G（由F.Taguchi，National Institute of Neuroscience，Tokyo，Japan善意提供）和抗HA MAb HA.11（Covance，Inc.）进行电泳和免疫印迹，以检测S和ORF6-HA，分别是。（B） 按照材料和方法中的描述，通过蔗糖垫造粒，从澄清的培养基中浓缩病毒，并对蛋白质进行类似的处理以揭示蛋白质。S蛋白以～40:1的细胞/病毒比率分布，而ORF6-HA蛋白以>300:1的电池/病毒比率分配。

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ORF6-HA与MHV结构蛋白和BiP的定位。用rJ2.2.6感染L929细胞12～16h。固定后，对细胞进行HA和MHV M、N、S蛋白或内质网（ER）蛋白BiP染色。还显示了用表达ORF6-HA的逆转录病毒转导的L929细胞。最后四个面板合并显示ORF6-HA与所示蛋白质的共定位。

我们进行了额外的研究，以确认ORF6-HA与细胞膜的相关性。生物信息学分析表明，ORF6氨基酸残基7至37主要是疏水性的。由于几个带电残基（E13、R20、R23和D30）散布在这个疏水性拉伸区域，残基7至37可能不会形成一个无硼跨膜跨度，但它们可能足以将ORF6定位在膜界面。为了确定ORF6-HA是否表现出疏水特性，我们使用涉及TX-114洗涤剂的方法将受感染的细胞蛋白分为疏水和亲水相。我们的结果（图。​（图6）6)发现ORF6-HA只在疏水性洗涤剂阶段进行分配。相比之下，超过90%的MHV N蛋白分离到亲水水相中，而三重跨膜M蛋白在疏水环境中被ORF6-HA保留。

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MHV N、M和ORF6-HA蛋白在疏水和亲水环境中的分配。在16h p.i.收集感染rJ.2.2.6的17Cl-1细胞，并使用M-PER试剂（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯公司）将蛋白质分为疏水（Triton X-114洗涤剂）和亲水（水）相。然后对来自所示细胞等效物的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并同时用抗-N MAb 5A5.2和Covance抗-HA MAb 1.1进行探测（顶面板）。然后剥离印迹，并用抗-M MAb 4B6.2（底部面板）重新涂覆。

讨论

我们的结果表明，SARS-CoV非结构蛋白可以在异源鼠冠状病毒感染的情况下发挥作用。这些实验中使用的MHV株只感染CNS，不会引起呼吸道疾病。因此，这些重组病毒对于研究SARS-CoV特异性非结构蛋白最为有用，这些非结构蛋白通常与发病机制有关，而不是呼吸道特异性蛋白的功能。值得注意的是，虽然SARS-CoV感染后存活下来的患者通常会出现精神后遗症，但SARS通常不会感染CNS(24).

我们还首次证明，对于任何冠状病毒，其中一种非结构蛋白在增强动物宿主中的病毒毒力方面具有作用。SARS-CoV蛋白在非人类细胞中发挥作用的能力并不令人惊讶。SARS-CoV最有可能从受感染的外来动物物种，如棕榈果子狸传播给人类(24). 一旦SARS-CoV获得感染人类细胞的能力，在2003年疫情期间仅在S、ORF3a和nsp3蛋白中检测到持续的变化(28). 值得注意的是，ORF6蛋白在人类中传代后没有发生突变。

虽然我们的结果清楚地表明ORF6-HA增加了小鼠感染的致死率，并增强了组织培养细胞中的病毒生长，但它们对先天性或适应性细胞免疫反应没有任何抑制作用，也没有改变病毒对干扰素-β治疗的敏感性。此外，我们无法证明对诱导干扰素应答基因的作用，例如ICAM-1和2′-5′寡腺苷酸合成酶（未发表的数据）。MHV和SARS-CoV均抑制IFN诱导（参考文献9和29以及我们的结果），使得无法确定ORF6蛋白在这一过程中可能产生的任何影响。尽管ORF6蛋白使组织培养细胞中的病毒滴度增加了10倍，但对受感染小鼠滴度的影响却不那么明显，只有在p.i.的后期才能检测到统计学上的显著差异（图。​（图2D）。二维). 然而，这些差异可能导致浸润中性粒细胞的数量增加（表​（表1）1)这反过来又可能导致更严重的疾病。

或者，ORF6蛋白可能优先影响特定细胞类型（如巨噬细胞或树突状细胞）的生长，从而导致免疫失调。已知MHV可在两种细胞类型中复制(30,34)（未显示数据）。携带另一种冠状病毒（猫传染性腹膜炎病毒）的猫也感染了巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞的感染导致与免疫抑制相关的进行性复发性疾病，促炎细胞因子和趋化因子水平升高，以及感染猫的显著发病率和死亡率(6). 在rJ2.2.6-和rJ2.2.6的中枢神经系统中，我们没有检测到CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CXCL10、肿瘤坏死因子α或白细胞介素-1β水平的实质性差异击倒对手-通过核糖核酸酶保护试验（数据未显示）感染小鼠，但这种试验不会检测到趋化因子或细胞因子水平的局部但重要的差异。在感染流感病毒的小鼠中，p.i.早期病毒滴度的细微差异对树突状细胞和随后的T细胞反应产生显著影响，从而区分致命感染和非致命感染(19).

目前，我们支持ORF6蛋白直接提高病毒复制、组装或传播效率的观点，因为与感染rJ2.2.6的细胞相比，感染rJ2.26的细胞中的病毒RNA和蛋白质水平都有所增加击倒对手（图。​（图3）。三). ORF6蛋白在整个细胞中被检测到，并且与膜相关（图。​（图6），6)，尽管它以最高浓度存在于核周区域，位于与N和M蛋白相同的区域。M蛋白存在于病毒组装部位，而N蛋白几乎完全定位于病毒复制部位(7,18). 因此，ORF6蛋白可能在增强病毒复制或组装方面发挥直接作用。在SARS-CoV感染的细胞中，ORF3a蛋白定位于核周区域并与E、M和S蛋白相互作用，而ORF7a产物在内质网-高尔基体区域检测到(21,33). 在感染性病毒中也检测到ORF3a蛋白(14,40). 确定SARS-CoV复制、组装和传播中ORF3a、-6和-7a的关系显然很重要。未来的工作还将着眼于确认ORF6蛋白在完整SARS-CoV中的重要性，特别是在病毒诱导的呼吸道疾病中。

鸣谢

这项研究部分得到了NIH的资助（PO1 AI060699）。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）