美国国家科学院院刊。2005年9月6日；102(36): 12873–12878.
阻断蛋白法尼基转移酶改善进展综合征患者成纤维细胞的核形态
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朱莉娅·托思
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
邵海阳
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
辛乔
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
安妮·贝格诺
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
迈克尔·盖尔布
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
凯西·穆尔森
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†华盛顿大学医学院医学系和肾脏科，密苏里州圣路易斯63110
杰弗里·米纳
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
史蒂芬·G·杨
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
洛伦·G·方
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
*加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院内科和心脏科，加利福尼亚州90095；†华盛顿大学化学和生物化学系，西雅图，WA 98195；和†密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院内科和肾脏科，邮编63110
由Richard J.Havel传达，加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学，2005年7月8日
摘要
层粘连蛋白A从其法尼基化前体-前层粘连肽A生物生成的缺陷导致前层粘着肽A在核膜上积聚，导致细胞核畸形，并导致进行性综合征。ZMPSTE24是一种参与前层粘连蛋白A加工的蛋白酶，如果缺乏ZMPSTE24，则会导致前层粘着蛋白A积聚、成熟层粘连膜A缺失、细胞核畸形以及致命的围生期前体综合征：限制性皮肤病（RD）。Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是由一种不能被加工成层粘连蛋白a的突变前层粘连素a引起的。RD和HGPS的标志性细胞异常是细胞核畸形。我们假设前层蛋白A的法尼基化对其靶向RD和HGPS的核膜很重要，阻断法尼基化将改善核形状异常。事实上，当RD成纤维细胞用法尼基转移酶抑制剂（FTI）治疗时，前层蛋白a部分位于核膜之外，核形状异常的频率降低(P（P）<0.0001）。FTI也使前层蛋白A定位错误，核形状改善Zmpste24型-小鼠胚胎成纤维细胞缺陷(P（P）<0.0001）和人类HGPS成纤维细胞核形状的改善(P（P）<0.0001）。最值得注意的是，FTI显著改善了不典型早衰患者的两个成纤维细胞系的细胞核形状，这些患者的层粘连蛋白a错义突变没有前层粘连a积聚(P（P）=0.0003和P（P）<0.0001）。这些发现为改善层相关进行性综合征中最明显的细胞病理学建立了一个范例，并提出了治疗这些疾病的潜在策略。
关键词：衰老、哈金森-吉尔福德早衰综合征、层粘连、限制性皮肤病、ZMPSTE24
T型限制性皮肤病（RD）和Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）这两种人类的早衰疾病是由前层胺A（一种法尼基化前体蛋白）的层胺A生物生成缺陷引起的(1-三). RD是一种致命的围产期进展性疾病，其特征是生长迟缓、皮肤紧绷僵硬、脱发、小颌畸形和其他骨骼异常。RD是由ZMPSTE24中的缺陷引起的(1,2)，一种蛋白酶，用于将前层蛋白a内蛋白水解为成熟层蛋白a(4,5). HGPS的特征是生长迟缓、部分脂肪营养不良、骨质疏松、溶骨性病变、皮肤薄、小颌畸形和过早动脉粥样硬化(三). HGPS是由前层粘连蛋白a（通常称为前体蛋白）的一种突变形式引起的，不能被加工成成熟的层粘连素a(三). 层粘连蛋白A是核膜内的一种关键蛋白质，核膜是内层核膜的中间丝网，为细胞核提供结构支持(6).
一些孕激素综合征是由LMNA公司（层粘连蛋白A和层粘连蛋白C的基因）(7,8). 例如，E578V和R644C突变会导致进行性疾病，并与核形状异常相关(8). 在这些病例中，层粘连蛋白A的结构异常明显足以损害核膜完整性并导致疾病。
Prelamin A终止于民航总局图案(6)触发半胱氨酸的法尼基化（C类的民航总局motif）。法尼基化后，蛋白质的最后三个氨基酸（即美国运通的民航总局基序）由内蛋白酶释放（可能是RCE1和ZMPSTE24的冗余功能）(5,9)新暴露的法尼基半胱氨酸被异戊烯基半胱酸羧基甲基转移酶甲基化(5). 最后，前层胺A（包括法尼基半胱氨酸甲酯）的最后15 aa被ZMPSTE24剪掉，留下成熟的层胺A(4,5,9). 前层胺A的法尼基化是所有后续翻译后处理步骤所必需的，并且被认为对前层胺甲靶向核膜很重要，在核膜上可能释放出层胺甲(10-12). 在没有法尼基化的情况下，前层胺A到达核质，但很少到达核膜，可能是因为法尼基半胱氨酸甲酯对蛋白质靶向内核膜很重要(10-12).
在HGPS中，一个点突变导致前层蛋白a羧基末端内50aa的缺失(三). 删除后民航总局基序完整，因此预计不会影响法尼基化美国运通或甲基化。然而，这种缺失消除了第二次内蛋白裂解的位点，所以突变蛋白（前体蛋白）不能被加工成层粘连蛋白A(三). 人类HGPS成纤维细胞含有严重畸形的细胞核，这是由前体蛋白沿核膜积聚引起的(13,14). 在Zmpste24型-成纤维细胞缺陷(Zmpste24型-/-)，前胺A积聚在核膜上(4,15)导致细胞核畸形，异染色质出现水泡和疝气(4,15).Zmpste24型-/-小鼠表现出一系列类似于前体疾病的表型，这显然是由法尼西基-前体蛋白a的积累引起的(15). 缺乏ZMPSTE24的人RD成纤维细胞也显示前层蛋白A积聚和细胞核畸形(1,2).
我们假设法尼基化对前层蛋白A靶向内核膜至关重要，并且前层蛋白A在核膜上的存在是最显著的细胞病理学（即畸形细胞核）的核心。我们进一步假设，用法尼基转移酶抑制剂（FTI）阻断蛋白法尼基化将减少前层蛋白A靶向核板并改善核形状。此外，我们假设FTI可以有效改善由层粘连A错义突变引起的进行性综合征的核形状异常。在这些情况下，我们怀疑FTI可以通过阻断层粘连蛋白A的生物发生和限制突变层粘连分子A向核膜的传递来改善核形状。在当前的研究中，我们测试了每一个假设。
材料和方法
细胞培养。从胚胎第13.5天开始制备原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）Zmpste24型-/-和Zmpste24型+/+胚胎(5). 参考文献中描述了来自RD患者和对照受试者的人类皮肤成纤维细胞（美国型培养物收藏号CCL-110）。1人HGPS成纤维细胞取自Coriell Cell Repository（储存库编号AG11513和AG01972；均具有G608G突变）(http://locus.umdnj.edu/ccr) (三). 来自层粘连蛋白A中R644C取代的非典型早衰症患者的成纤维细胞和来自层粘连蛋白A中E578V取代的严重非典型沃纳综合征患者的成纤维细胞也从Coriell获得（储存库编号分别为AG00989和AG04110）(8). 两种强效FTI，PB-43和BMS-214662(14,16)使用了。除非另有说明，否则用2.5μM剂量的FTI处理细胞48小时，该剂量对细胞生长几乎没有影响。未经处理的细胞与载体DMSO孵育。
西部印记。成纤维细胞用SDS洗涤和溶解；蛋白质在4-12%梯度聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移到硝化纤维素膜上进行Western blots。抗体稀释液为1:5000兔抗鼠前层蛋白A抗血清（一种针对羧基末端前层蛋白A-肽LLGNSSPRSQSSQN的抗血清；该抗体不能结合成熟的层蛋白A或层蛋白C）(13,15)，1:400抗层粘连A/C小鼠IgM单克隆抗体（层粘连C/C单克隆抗体）（sc-7293，圣克鲁斯生物技术），1:400抗体层粘连AC-兔IgG（层粘稠A/C多克隆抗体），1:1000抗层粘连蛋白B（sc-6217，圣克鲁斯生物技术）、1:1000抗肌动蛋白山羊IgG（sc-1616，圣克鲁兹生物技术）和1:500抗HDJ-2/DNAJ Ab-1小鼠IgG1（MS-225-P0，加利福尼亚州弗里蒙特Lab Vision Corporation），1:6000辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗羊IgG（sc-2020，Santa Cruz Biotechnology），1:4000 HRP标记的抗鼠IgM（sc-2064，Santa Cruz Bietchnologies），1:4000HRP标记抗鼠Ig（NA931V，Amersham Biosciences），和1:6000 HRP标记的抗兔IgG（NA934V，Amersham Biosciences）。用ECL-Plus增强化学发光系统（Amersham Biosciences）检测抗体结合并暴露于x射线胶片。
北方斑点。用三试剂（Sigma）从细胞中提取RNA。在1%琼脂糖凝胶上对RNA（5μg）进行分级，并转移到Nytran增压膜上。A类32P标记的270-bp探针，来自Lmna公司cDNA用于检测前层蛋白A和层蛋白C的转录物。
免疫荧光显微镜。在24孔板中，成纤维细胞以每孔约25000个细胞的速度贴在盖片上。成纤维细胞固定在3%多聚甲醛中，用0.2%Triton X-100渗透，用0.2%BSA/10%FBS封闭。用抗前层蛋白A（兔抗鼠前层蛋白A-抗血清）（1:5000）、层蛋白A抗体（sc-20680，Santa Cruz Biotechnology）（1:200）或层膜相关蛋白2（LAP2；目录号611001，BD Biosciences，San Jose，CA）（1:400）。清洗后，用1:800抗兔Cy3-结合二级抗体（目录号711-166-152，Jackson ImmunoResearch）、1:600抗鼠Alexa Fluor 488（A21202，Molecular Probes）和DAPI对成纤维细胞进行染色，以显示DNA。获得的图像如参考文献所述。14两名完全失明的观察者在层粘连蛋白a或LAP2染色的细胞中统计正常核（光滑卵圆形核）和异常核（泡状核、极不规则核或多折叠核）的数量。用χ计算统计差异2统计的。
结果和讨论
确定FTI、RD和野生型人类成纤维细胞是否可以改善RD成纤维细胞的核形状异常(1)用强效FTI PB-43治疗。正如预期的那样，PB-43阻断了野生型成纤维细胞的法尼基化，这是根据前胺A的积累和40-kDa法尼基的HDJ-2电泳迁移率的延迟来判断的民航总局通过阻断法尼基化抑制电泳迁移的蛋白质(). 未经处理的RD成纤维细胞显示前层粘连蛋白A积聚，成熟层粘连膜A完全缺失，这与ZMPSTE24型不足(4,5). FTI治疗并没有影响野生型或RD成纤维细胞中“前层粘连蛋白A”或“前层粘蛋白A”的总量（即，FTI治疗后的成纤维细胞的前层粘稠蛋白A的总量与未治疗成纤维细胞内的前层黏连蛋白A或前层粘连蛋白A的总量相似，这是由带有层粘连蛋白酶A/C抗体的Western blots判断的）(). FTI处理的RD细胞中的前层蛋白A在SDS/聚丙烯酰胺凝胶上的迁移速度略慢于未处理细胞中的前层蛋白A(). FTI处理后电泳迁移率也略有下降Zmpste24型-/-MEF公司(). 蛋白质法尼基化增加Ras蛋白质的电泳迁移率(17)因此，未经治疗的RD成纤维细胞中前层蛋白A的迁移速度更快也就不足为奇了。此外，未经处理的RD成纤维细胞中的前层粘连蛋白A可能比FTI处理的细胞中的前层粘连蛋白A短3个氨基酸，因为RD成纤维细胞中法尼酰前层粘连蛋白A的最后3个氨基酸可能会被特异性的异戊二烯基蛋白剪切掉CAAX公司内蛋白酶RCE1(5).
野生型和RD成纤维细胞的Western blot分析。(A类)PB-43存在和不存在时野生型和RD成纤维细胞的蛋白质印迹。从顶部凝胶开始，使用的抗体是抗前层胺A、抗层胺A/C单克隆、抗层明A/C多克隆、抗HDJ-2和抗肌动蛋白。(B类)RD成纤维细胞和Zmpste24型-/-带有前胺A抗体的MEF显示，在PB-43存在下，前胺A的电泳迁移略有延迟。
通过免疫荧光显微镜，在未经处理的野生型成纤维细胞中未检测到前层蛋白A。然而，在FTI处理的野生型成纤维细胞中，前层蛋白A染色强烈，主要位于核质中(). 当使用层粘连蛋白a抗体（结合层粘连肽a和前层粘连素a，但不结合层粘着蛋白C）时，FTI处理的细胞中的荧光主要位于核质中(). 在未经处理的RD细胞中，前层蛋白A沿着核边缘和核质染色强烈(). 与PB-43孵育48小时后，RD细胞中的前层蛋白a更均匀地分布在核质中；核边缘的染色不太强烈，但在一些细胞中仍然可见(). 两名观察者在两项独立实验中判断，对RD成纤维细胞进行FTI治疗可降低细胞核畸形（细胞核有气泡、褶皱或形状粗大不规则）的成纤维细胞百分比(P（P）< 0.0001) (). RD细胞的共焦显微镜显示，前层蛋白a（红色）和LAP2（绿色）沿核边缘和核质中的分布极不规则(). 在FTI的设置中，层粘连蛋白A和LAP2在超过一半的RD细胞中分布更均匀().
FTI对前层蛋白a定位和野生型和RD成纤维细胞核形状的影响。(A类和B类)显示FTI PB-43对野生型前层蛋白A和层蛋白A定位（红色）的影响的表观荧光图像(A类)和RD(B类)成纤维细胞。用DAPI（蓝色）观察DNA。在野生型和RD成纤维细胞中，FTI在一小部分细胞中诱导了一个圆环状细胞核（数据未显示）。(C类)野生型和RD成纤维细胞中畸形细胞核的频率。条形图显示畸形核的平均频率。每个棒内记录畸形核的数量和检查的核总数。条形图总结了两个独立实验的数据，但每个实验都产生了显著差异(P（P）< 0.0001).
共焦图像显示，未经治疗的RD成纤维细胞的细胞核中前层蛋白a（红色）和LAP2（绿色）（一种内核膜蛋白）的分布极不规则。FTI处理后，前层蛋白A和LAP2在大量细胞中分布更均匀。
进一步探讨FTI对Zmpste24型-缺乏细胞，我们检测了原代Zmpste24型-/-和Zmpste24型+/+MEF公司。在野生型MEF中，FTI阻断Hdj-2的法尼基化并导致前层胺a的积累(). 与野生型人类细胞的结果相反，根据层粘连蛋白A/C抗体的Western blots判断，经FTI处理的野生型MEF中前层粘连素A的数量低于未经处理的MEF中层粘连肽A的数量(). FTI没有干扰层粘连蛋白C或层粘连蛋白质B1的水平。同样，FTI明显减少了Zmpste24型-/-MEF，根据两种不同的层粘连蛋白A/C抗体的Western blots判断，不影响层粘连蛋白质C或层粘连B1水平(). 有趣的是，前胺A的减少在使用前胺A肽抗体的蛋白质印迹中无法检测到，这与前胺A/C抗体明显相关，可能是因为前胺A羧基末端的肽抗体与非肉桂酰化前胺A结合，亲和力高于法尼酰化前明A。在BMS-214662中观察到几乎相同的结果，这是一种不同的FTI(). 我们考虑了FTI通过减少前层蛋白A mRNA的数量来降低MEF中前层蛋白AmRNA水平的可能性；然而，Northern杂交显示前层粘连蛋白A或C的表达没有变化().
分析FTI对Zmpste24型-/-MEF公司。(A类和B类)野生型和Zmpste24型-/-在FTI PB-43缺席和在场的情况下的MEF(A类)和BMS-214662(B类). 从顶部开始，使用的抗体是抗前层胺A、抗层胺A/C单克隆抗体、抗层明A/C多克隆抗体、抗体B、抗HDJ-2和抗肌动蛋白抗体。(C类)Northern印迹分析Zmpste24型-/-PB-43（1和10μM）和a5′存在和不存在时的MEFLmna公司探查。
通过免疫荧光显微镜，在野生型MEF中检测不到前层蛋白A，但在FTI处理的MEF的核质中容易检测到(). 在缺乏FTI的情况下，在年的核边缘检测到大量前层蛋白aZmpste24型-/-MEF公司(). 然而，在用FTI孵育48小时后，大多数前层蛋白a被错误定位于核质，很少定位于核边缘(). FTI处理Zmpste24型-/-MEF导致畸形细胞核（主要是有气泡的细胞核）明显减少。在两个实验中（每个实验由两名观察者评分，每个实验涉及每个基因型的两个独立MEF细胞系），FTI降低了Zmpste24型-/-具有畸形核的MEF(P（P）<0.0001）().
FTI对前层蛋白a定位和核形状的影响Zmpste24型-/-MEF公司。(A类和B类)表观荧光显微镜图像显示PB-43对野生型前层蛋白A定位的影响(A类)和Zmpste24型-/-(B类)MEF公司。用抗前层粘连蛋白A和前层粘着蛋白A的抗体（红色）观察前层粘稠蛋白A和后层粘连肽A；用DAPI（蓝色）观察DNA。(C类和天)野生型和非野生型独立实验中畸形核的频率Zmpste24型-/-在PB-43缺席或在场的情况下举行会议。条形图显示畸形核的平均频率；记录每个棒内的畸形核数和总核数；黑色圆圈表示每个基因型的独立细胞系的频率。
在人类RD细胞中，FTI介导的核形状改善发生在细胞中前层蛋白A水平没有降低的情况下。因此，我们怀疑，对RD细胞畸形核频率的有利影响主要是由于前层蛋白A远离核膜的部分定位错误。在Zmpste24型-/-MEFs，FTI可能通过双重机制改善了核的形状。与人类RD细胞一样Zmpste24型-/-MEF被错误定位在远离核膜的地方。然而，除此之外，FTI降低了Zmpste24型-/-MEF公司。在早期的一项研究中Zmpste24型-/-MEF公司(15)，将前层蛋白A水平降低50%（使用Lmna公司基因敲除等位基因）显著减少核泡。
FTIs改善了RD成纤维细胞和Zmpste24型-/-MEF促使我们确定FTI是否可以改善人类HGPS成纤维细胞的核形状异常。根据Western blots判断，FTI对前体蛋白水平几乎没有影响，但导致野生型前层蛋白A的积累(). 经过7天的FTI处理，两种不同的HGPS成纤维细胞系中具有畸形细胞核的HGPS细胞百分比降低(P（P）<0.0001）().
FTI对HGPS成纤维细胞和其他进展综合征成纤维细胞畸形核频率的影响。(A类)在无或有PB-43的情况下对HGPS成纤维细胞进行Western blot分析。使用的抗体是抗层粘连蛋白A/C多克隆（顶部凝胶）、抗前层粘连蛋白A（中间凝胶）和抗肌动蛋白（底部凝胶）。(B类)表观荧光显微镜图像显示PB-43对人HGPS成纤维细胞中层粘连蛋白A（红色）定位的影响。箭头显示气泡。(C类)FTI对两种不同HGPS细胞系（AG11513和AG01972）畸形核频率的影响。(天)FTI对R644C和E578V突变的成纤维细胞畸形细胞核频率的影响。这是两个独立实验中的第一个。另一名独立观察者获得了类似的结果，但在统计上存在显著差异(P（P）=0.0059，对于E578突变和P（P）R644C突变<0.0001）。条形图显示畸形核的平均频率；每个棒内记录畸形核数和总核数。
如前所述，人类的一些进行性综合征是由层粘连蛋白A的错义突变引起的，例如R644C和E578V(8). R644C和E578V成纤维细胞没有前层蛋白A的积累（数据未显示），但含有畸形细胞核，可能是因为层蛋白A在结构和功能上异常。我们预测，FTI可能会有效改善R644C和E578V成纤维细胞的核形状，因为FTI会阻止成熟层粘连蛋白a的生物生成，并且非淀粉化前层粘连肽a主要位于核质中。事实上，FTI降低了R644C成纤维细胞畸形核的频率(P（P）=0.0003和P（P）=0.002（在两个独立实验中）(). 同样，FTI治疗降低了E578V成纤维细胞畸形细胞核的频率(P（P）<0.0001，在两个独立实验中）().
我们检测到的错义突变R644C和E578V位于层粘连蛋白A的羧基末端，该区域不与层粘连蛋白质C共享。我们认为，重要的是首先进行层粘连蛋白酶A的特异性突变，因为层粘连酶A的生物发生（而非层粘连素C的合成）直接受FTI的影响。然而，在1-566氨基酸中也发现了导致核畸形的进行性综合征的突变，该氨基酸是层粘连蛋白A和层粘连蛋白质C共有的结构域(7,8). 此外，残基1-566中的错义突变会导致一系列其他“层粘连病”，例如，伴有传导系统疾病的心肌病、几种形式的肌营养不良、部分脂肪营养不良、Charcot-Marie-Tooth神经病变和下颌骨发育不良(6). 一些但不是全部的层粘连蛋白A/C错义突变导致细胞核畸形(18). 我们预测，FTI最终将被证明能改善层粘连蛋白A/C错义突变细胞的核形状异常，因为至少FTI有望减少到达核层的成熟层粘连蛋白质A的数量。然而，一种可能性是，FTI对层粘连蛋白a/C突变的益处不太显著，因为该药物对突变的层粘连蛋白质C没有直接影响。
变形核是RD和HGPS的主要细胞病理学，FTI明显改善了变形核。重要的问题是，FTI对椎板相关的进行性综合征以及其他椎板病是否有效？没有人知道这个问题的答案，但我们认为测试FTIZmpste24型-/-老鼠(5)或HGPS基因靶向小鼠模型(14)当然是有保证的。此外，我们认为考虑对HGPS患者进行临床试验是合理的，特别是考虑到该病的致命性以及FTI是耐受性良好的口服药物这一事实(19).
我们谨慎乐观地认为，FTI将是人类进展综合征的有效治疗方法，这仅仅是因为“细胞病理学”的改善将在组织或器官水平上改善疾病表型，这一点具有直观的意义。此外，核板的结构异常使成纤维细胞更容易凋亡(20)细胞死亡似乎是HGPS中某些疾病表型的基础。因此，任何改善核板完整性的药物干预都可能导致细胞死亡和疾病表型的改善。乐观的另一个原因是，在最近的一项研究中，细胞核形状和“全动物”表型是相关联的Zmpste24型-/-老鼠(15). 在那项研究中，将层粘连蛋白A的表达水平降低一半，导致畸形细胞核和早衰症样疾病表型的平行减少。此外，疾病表型的显著改善发生在法尼酰前层蛋白a仅减少50%的情况下。因此，即使法尼酰转移酶的抑制和前层蛋白a的错误定位不完全，FTIs也可能对人类有帮助。
相反，悲观主义者会辩称，进行性疾病中的某些疾病表型可能与核膜结构异常无关。例如，部分性脂肪营养不良表型可能部分与甾醇调节元件结合蛋白转录因子的干扰处理有关(21). 目前尚不清楚FTI是否会有利地影响每一种可能的疾病机制，例如转录因子功能的改变。此外，非淀粉化前层蛋白A（或非淀粉化的前体蛋白）仍然是结构异常的蛋白质，我们不能忘记，层蛋白的微小结构变异会导致许多人类遗传病(6). 因此，非淀粉化前胺A可能有毒，导致不同的疾病表型。未来，在基因靶向小鼠模型中评估非甲酰化前胺A的毒性可能是有用的（即，通过创建一个小鼠，其中C类的民航总局图案改为丝氨酸）。
骨疾病（骨骼生长迟缓、小颌畸形、溶骨性病变和骨质疏松症）是HGPS的一个衰弱特征(三). 如果一个人能够仅仅治愈HGPS中的骨病，那么它肯定会对受影响患者的生活产生非常积极的影响。在这方面，我们已经考虑了双膦酸盐药物的可能性，该药物用于数百万人治疗骨质疏松症(22). 含氮的双膦酸盐药物，都是焦磷酸的类似物，阻断法尼基二磷酸合成酶的活性，法尼基二磷酸酶是一种产生法尼基磷酸的酶，是蛋白质法尼基转移酶的共基质(22-24). 阻断法尼基二磷酸合成酶有望抑制蛋白质的丙氨酰化和胆固醇的生物合成(22,24). 事实上，双膦酸盐对蛋白质香叶基香叶酰化的抑制作用被认为在提高骨密度方面很重要(22,24). 二膦酸盐与骨骼紧密结合(22)并且被成骨细胞和破骨细胞吸收，但对其他组织几乎没有影响。
我们假设二膦酸盐药物会干扰前胺A到层粘连蛋白A的过程。事实上，阿仑膦酸钠（一种含氮的二膦酸盐）部分阻断了层粘连肽A的生物生成，并导致前胺A在野生型和HGPS成纤维细胞中积聚(). 由于双膦酸盐在骨中的浓度很高，这些药物很可能会干扰HGPS患者前体蛋白的法尼基化。如果是这样的话，人们可以想象这些药物可能对HGPS的骨病产生有利的影响。
野生型和HGPS成纤维细胞在阿仑膦酸钠（一种二膦酸盐药物）存在下孵育3天的Western blot分析。所用抗体为抗层粘连蛋白A/C多克隆（顶部凝胶）、抗前层粘连肽A（中间凝胶）和抗肌动蛋白（底部凝胶）。
HGPS患者应该用二膦酸盐治疗吗？我们会争辩说，不，还没有。尽管这些药物在治疗“跑步”骨质疏松症方面是安全有效的，但它们在HGPS中的疗效和安全性尚未确定。再次测试这些药物对骨质疏松症和骨质溶解性病变的影响Zmpste24型-/-老鼠(5)或HGPS小鼠(14)会有帮助的。此外，我们怀疑在未来几年内，对HGPS患者进行FTI的临床试验可能会开始，如果所有受试者都服用双膦酸盐，这些试验的解释可能会模糊不清。双膦酸盐在骨中滞留数月甚至数年，因此这些药物的存在可能使人们难以确定FTI对骨疾病是否有良好的疗效。
致谢
我们感谢Sandy Chang女士、Ellen Fitzmorris女士和Stephanie Young女士为畸形细胞核评分；Brian Young先生协助制作艺术品；Leslie Gordon博士就HGPS患者的潜在FTI试验进行了有益的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院CA099506、AR050200和AI054384以及Progeria研究基金会的资助。
笔记
作者贡献：J.I.T.、S.G.Y.和L.G.F.设计的研究；J.I.T.、S.H.Y.、X.Q.和L.G.F.进行了研究；A.P.B.、M.H.G.、C.L.M.和J.H.M.贡献了新的试剂/分析工具；J.I.T.、S.G.Y.和L.G.F.分析数据；J.I.T.、S.G.Y.和L.G.F.撰写了这篇论文。
缩写：RD，限制性皮肤病；HGPS、Hutchinson-Gilford早衰综合征；蛋白法尼基转移酶抑制剂；小鼠胚胎成纤维细胞；LAP2，叶片相关蛋白2。
工具书类
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