双精氨酸信号肽的预测

正则表达式

允许使用Perl语法正则表达式过滤潜在的Tat信号肽。此外，这有助于用户识别潜在Tat信号肽基序的位置。“RR.[FGAVML][LITMVF]”的正则表达式，其中“.”表示任何氨基酸，默认情况下使用，此正则表达式涵盖训练集中97%的序列。此模式是从阳性训练集的未映射多序列比对中提取的，其中两个精氨酸的位置是固定的。

神经网络体系结构

我们使用两个不同的神经网络来处理Tat信号肽预测问题。一个用于识别裂解位点的网络，一个用于确定给定氨基酸是否属于Tat信号肽的网络（识别）。在以前的论文中已经对神经网络进行了更深入的描述[17,23].

对不同数据集进行了预测方法的性能评估。在该方法的培训过程中，我们使用了与SignalP中相同的性能度量即对训练集进行交叉验证。这意味着将数据集分成五个大小相等的部分，然后对四个部分进行训练，并对其中一个部分进行总共五次测试，直到所有序列分别用于训练和测试。

此外，我们在上述各种独立测试集上评估了该方法。

解理位点网络基于解理位点左侧19个位置和右侧3个位置的不对称窗口。解理位点网络在隐层中有2个单位。使用对称或近对称窗口时，判别网络的性能最佳。这项工作中使用的窗口大小是对称的，覆盖31个位置。识别网络在隐层有3个单元。如前所述，神经网络中包含了成分和定位信息[17].

Sec和Tat信号肽的区分

许多研究使用SignalP预测Tat信号肽。在某种程度上，SignalP能够正确分类Tat信号肽，尽管其准确度低于此处提出的TatP方法。

在本研究中使用的35种已知Tat底物中，只有83%的底物得到SignalP的阳性预测，尽管它们都有一致的模式。这表明SignalP可以用于Tat信号肽预测，但更准确的方法更可取。此处提出的方法（TatP）比上述方法具有更高的精度。TatP方法预测35种已知的Tat底物中91%具有Tat信号肽。这与TATFIND相当，后者积极预测了其中97%。不幸的是，三种已知的Tat底物未被TatP、PHSS_DESBA、YAGT_ECOLI和FHUD_ECOLI正确识别。TATFIND无法正确分类YCDO_ECOLI，因为它没有发现Tat信号肽的一致模体。

除了分类预测外，TatP还报告了Tat信号肽的潜在裂解位点（见图​图2），2)TATFIND未在输出中报告的功能。不幸的是，并不是所有35种已知的Tat信号肽都通过实验验证了切割位点。合并Swiss-Prot和我们策划的大肠杆菌我们希望在所有已知的Tat底物中都有正确的解理位点注释。当使用合并注释时，TatP方法在84%的真阳性预测的Tat底物中具有正确的切割位点预测。

在SignalP 3.0版的训练集上评估TatP和TATFIND是否能够区分Tat信号肽和Sec信号肽。此外，我们评估了TatP和TATFIND在713个细胞质蛋白上的性能，这些细胞质蛋白携带位于最初30个氨基酸中的两个连续的精氨酸。通过仅使用正则表达模式搜索这些数据集，我们发现革兰阳性和革兰阴性蛋白的假阳性率分别为4%和7%。对于最初30个氨基酸中含有两个连续精氨酸的细胞质蛋白，仅正则表达的假阳性率为15%。TATFIND通过在正则表达式之外包含基于规则的分类方案，大大减少了假阳性预测的数量，导致假阳性率为1.4%。在TatP中，我们应用神经网络来识别Tat信号肽中h区的疏水性较小的延伸，假阳性率仅降至0.4%（见表​表1）。1). 事实上，这显示了神经网络的威力，它能够区分Sec/SRP和Tat靶向信号的疏水性。在革兰氏阳性试验数据集中，TatP发现的假阳性仅略多于TATFIND。

应该提到的是，TatP和TATFIND的一些假阳性预测可能代表数据库中的真Tat信号肽。使用的革兰氏阴性和革兰氏阳性数据集是在Tat信号肽注释之前从Swiss-Prot中提取的。此外，这些序列中的许多条目甚至在发现Tat输出途径之前就已输入Swiss-Prot数据库，因此一些Tat信号肽可能被错误注释。

正氨基酸残基对跨膜螺旋具有拓扑效应[26]. 有趣的是，TatP和TATFIND是否能够区分跨膜螺旋和Tat信号肽。在最初的30个氨基酸中，分析了632个携带跨膜结构域和两个连续的精氨酸的蛋白质。我们发现22种蛋白质被预测含有Tat信号肽，而TATFIND鉴定出46种。其中许多确实是金属蛋白，但具有跨膜结构域注释，而不是Tat信号肽注释。原因可能与上述相同。Rieske蛋白通过类囊体中未分离的Tat信号序列固定在膜上[27]这也被认为是原核生物的情况，因为蛋白质的Fe-S簇必须到达膜的跨侧。此跨膜数据集中真实Tat信号肽的确切数量未知。然而，它显示了TatP识别假定的Tat底物的能力，这些假定的Tat-底物被错误地注释为跨膜螺旋。TATFIND似乎过度预测了具有两个连续精氨酸的跨膜蛋白，因为46个预测的蛋白中有一些是伴侣蛋白，不太可能携带Tat信号肽。由于缺乏大量Tat底物的实验证据，我们研究了22个细菌基因组，其中编码Tat易位系统成分的基因未能根据同源性进行鉴定[21]. 理想情况下，通过任何Tat信号肽预测方法都不应在这些基因组中发现Tat底物。在这22个细菌基因组中，TATFIND鉴定出20个Tat底物，而TatP仅鉴定出4个。

克里斯托巴尔等。[8]表明Tat信号肽通常比Sec信号肽和SRP信号序列的疏水性都低。他们证明大肠杆菌TMAO还原酶（TorA）可以在不改变RR基序的情况下转化为Sec信号肽，但可以用取自Sec信号多肽的更疏水的区域取代疏水的h区域。TorA信号肽突变体和野生型Tat信号肽都具有一致模式。根据神经网络的疏水性判别，正确预测野生型TorA通过Tat途径分泌。TorA[10:10]信号肽突变体比野生型疏水性更强，但长度相同，被错误地预测为阳性，而TorA+19:10]信号肽突变体疏水性更强且更短，被正确地预测为阴性。TATFIND也有类似的结果。

枯草杆菌中的Tat信号肽

Jongbloed等人[24]编制了一份69人的名单枯草芽孢杆菌具有潜在Tat信号肽的蛋白质。鉴于上述突变研究表明，在某些情况下，第一个精氨酸可以被赖氨酸取代，而不会失去Tat依赖性，他们考虑了RR-和KR-motifs。从基因组序列中选择所有带有RRXΦΦ或KRXΦΦ（其中Φ表示疏水残基）和疏水区的序列。随后，作者在枯草芽孢杆菌分泌组。引人注目的是，69种蛋白质中只有一种是Tat依赖性的，即磷酸二酯酶PhoD。TatP对此做出了积极预测。发现有13种其他蛋白分泌，但也由塔特缺失突变，表明Sec依赖性。所有这13个蛋白质都带有与一致模体匹配的序列，但在应用神经网络分析这些信号肽的疏水性后，所有13个蛋白质均得到TatP的否定和正确预测。13种蛋白质中的三种，LipA、WapA和YolA，进一步显示依赖SecA[24]. TATFIND做出了一个假阳性预测，但也能够正确预测12个Sec依赖蛋白不携带Tat信号肽。使用SignalP 3.0版（无截断）预测上述序列均含有Sec信号肽，PhoD除外（见表​表2）。2). 因此，在枯草芽孢杆菌，假定的Tat信号肽都被SignalP正确地归类为Sec信号肽，并且没有一个得到TatP的阳性预测，这表明基于正则表达式的搜索也结合了用于疏水性识别的神经网络的能力。

最近，在枯草芽孢杆菌.YwbN被发现以严格依赖Tat的方式分泌[25]. TatP对YwbN进行了积极而正确的预测。

在枯草芽孢杆菌基因组，TATFIND预测7种Tat信号肽[21]，而使用默认正则表达式的TatP预测五个。如果我们遵循Jongbloed等人的想法，允许KR-和RR-motifs（但保持正则表达式的其余部分不变），则阳性预测的数量为10。然而，这种生物体中Tat底物的确切数量必须等待实验验证。

变异Tat信号肽

无正则表达（或有变异正则表达）的TatP可能预测无典型双精氨酸的变异Tat信号肽。TtrB亚单位肠道沙门菌在Tat信号肽基序的第一个位置携带赖氨酸而不是精氨酸的四硫代酸还原酶（Genbank AC：{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_805056”，“term_id”：“409994504”，“term_text”：“NP_805066”}}NP_805056) [11]如果正则表达式在第一个位置使用赖氨酸进行扩展，则TatP会正确且积极地预测。TATFIND不直接允许使用不同的正则表达式（一致模），但如果具备基本编程技能，则可以进行更改。因此，TtrB亚单位受到TATFIND的负面预测。此外，Stanley产生的突变Tat信号肽等。[13]布坎南等。[15]、Ize等。[14]和DeLisa等。[16]如果用户修改正则表达式以允许在RR位置进行相关替换，则TatP很容易预测。然而，Ignatova报道的天然变异Tat信号肽等。[12]不幸的是，TatP没有做出积极预测。

我们没有专门研究与异源乘客蛋白融合的Tat信号肽[5,28]. 然而，由于预测方法主要使用蛋白质序列的N末端区域，我们预计这些融合蛋白中的大多数能够得到正确的预测（但需要注意的是，乘客蛋白能够通过Tat途径输出）。