核酸研究。2005; 33(13): 4023–4034.
紫外线照射后SUMO-1和泛素修饰DNA修复因子XPC
,1 ,1 ,1 ,1 ,1和1中，2,三，*
王启恩
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
朱千正
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
古扎尔·瓦尼
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
穆罕默德·埃尔·马迪
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
李金友
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
阿尔塔夫·瓦尼
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
2俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，地址：103 Wiseman Hall，400 W.12th Avenue，Columbus，OH 43210，USA
三俄亥俄州立大学詹姆斯癌症医院和Solove研究所，103 Wiseman Hall，400 W.12th Avenue，Columbus，OH 43210，USA
1俄亥俄州立大学放射学系，美国俄亥俄州哥伦布第十二大道西400号怀斯曼大厅103号，邮编：43210
2俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，地址：103 Wiseman Hall，400 W.12th Avenue，Columbus，OH 43210，USA
三俄亥俄州立大学詹姆斯癌症医院和Solove研究所，103 Wiseman Hall，400 W.12th Avenue，Columbus，OH 43210，USA
2005年4月25日收到；2005年6月13日修订；2005年6月13日接受。
版权所有©作者2005。牛津大学出版社出版。保留所有权利 本文的在线版本是在开放存取模式下发布的。用户有权出于非商业目的使用、复制、传播或展示本文的开放存取版本，但前提是：原创作者是正确且完全归属的；《华尔街日报》和牛津大学出版社被认为是原始出版地，并提供了正确的引用细节；如果一篇文章随后不是全部复制或传播，而是部分复制或作为衍生作品传播，则必须明确指出。如需商业再使用，请联系groSlanruojpuo@snoissimrep.slanruoj
摘要
核苷酸切除修复（NER）是主要的DNA修复过程，可去除各种DNA损伤，包括紫外线诱导的光产物。NER涉及20多种蛋白质。其中，XPC被认为是第一个在NER亚途径全球基因组修复（GGR）过程中识别DNA损伤的蛋白质之一。为了研究XPC参与GGR的机制，我们研究了哺乳动物细胞中XPC蛋白在紫外线照射下的可能修饰。对在SDS裂解缓冲液中直接煮沸制备的紫外线照射正常人成纤维细胞裂解物进行Western blot分析，显示出几个分子量高于原始XPC蛋白的抗XPC抗体反应带。相互免疫沉淀和siRNA转染分析表明，XPC蛋白被SUMO-1和泛素修饰。通过使用几种NER缺乏的细胞系，我们发现DDB2和XPA是紫外线诱导的XPC修饰所必需的。有趣的是，泛素化的失活和蛋白酶体抑制剂的处理都定量地抑制了紫外线诱导的XPC修饰。此外，在XP-A细胞中，XPC蛋白在紫外线照射后显著降解，其中XPC不发生sumoylation。总之，我们得出结论，XPC蛋白在紫外线照射下被SUMO-1和泛素修饰，这些修饰需要DDB2和XPA以及泛素-蛋白酶体系统的功能。我们的结果还表明，紫外线诱导的XPC酰化至少有一种功能与XPC蛋白的稳定有关。
简介
核苷酸切除修复（NER）是一种通用的DNA修复途径，可消除扭曲双螺旋的各种结构无关损伤，包括紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和嘧啶（6-4）嘧啶酮光产物（6-4PP），以及许多化合物诱导的链内交联和大块加合物(1)。NER有两种不同的亚通路，即全局基因组修复（GGR）和转录偶联修复（TCR）。前者清除整个基因组中的DNA损伤，而后者仅清除转录活性基因转录链中的DNA损坏(2)。NER活性受损与多种人类遗传疾病有关，包括色素性干皮病（XP），已确定7个NER缺陷基因互补XP组（XP-A至-G）。与大多数XP补充组不同，XP-C患者仅在GGR中显示缺陷，但TCR是正常的。XP-C患者中有缺陷的基因编码XPC蛋白，该蛋白存在体内作为hHR23B和中心蛋白2的异源三聚体复合物(三–5)。XPC-hHR23B似乎是GGR的损伤识别因子。一般来说，XPC-hHR23B通过识别和结合病变引入双链DNA的结构异常而发挥作用，而不是识别病变本身的任何结构特征(6,7)。XPC-hHR23B诱导的DNA构象变化有利于其他NER因子如TFIIH、XPA、RPA和两种NER内切酶XPG和ERCC1-XPF的后续结合(6,8,9)。最后，通过双切口去除含有损伤的寡核苷酸，并通过DNA合成和结扎填补缺口。
几项使用小鼠和人类细胞的研究表明，在NER期间XPC蛋白水平的变化。当XPC-GFP融合蛋白在mHR23A/B DKO MEFs（双敲除小鼠胚胎成纤维细胞）和hHR23B中稳定表达时，紫外线照射导致XPC-GFPs大量积累(10)。与外源表达的蛋白质相比，Okuda等. (11)表明内源性小鼠XPC相对稳定，紫外线照射仅在照射后9 h诱导XPC水平增加约10%。然而，Adimoolam和福特的实验(12)结果表明，在几个人类细胞中，紫外线照射后，人类内源性XPC蛋白显著上调，这种反应取决于p53的状态。此外酿酒酵母表明XPC的酵母同源物外显表达Rad4的快速降解似乎是由多泛素化和DNA损伤介导的，DNA损伤暂时稳定了过表达的Rad4(13)。在酵母和哺乳动物系统中，HR23B（在酵母中，Rad23）通过对蛋白酶体降解的部分保护来控制XPC的稳定性，从而在NER中发挥作用(10,13)。然而，在mHR23−/−和DKO细胞中发现紫外线诱导的mXPC适度积累表明存在mXPC积累的其他机制（例如翻译后修饰），而mHR23蛋白并不需要(11).
小泛素相关修饰物（SUMO）是泛素样蛋白家族中最具特征的成员，泛素样蛋白质家族不断壮大，参与翻译后修饰(14–16)。在哺乳动物中，SUMO蛋白家族有三个成员，即SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3，它们与部分重叠但不同的功能有关(17,18)。SUMO通过类似于泛素化的酶级联的活性与其他蛋白质共价连接。只有一种已知的SUMO激活酶E1和一种已知的SUMO偶联酶E2（Ubc9）。SUMO附着的功能后果因底物而异，在许多情况下，这种后果在分子水平上尚不清楚。与泛素化不同，蛋白质的琥珀酰化与蛋白质降解无关。拟议的琥珀酰化功能包括调节蛋白质-蛋白质相互作用和定位、抑制泛素介导的降解以及调节转录(16,19).
在当前的研究中，我们已经表明XPC蛋白在紫外线照射后被共价修饰。相互免疫沉淀（IP）和RNA干扰研究表明，紫外线诱导的XPC修饰是SUMO-1和泛素结合的。我们还提供证据表明，紫外线诱导的XPC修饰与包括DDB2和XPA在内的几种NER因子以及泛素-蛋白酶体系统有关。
材料和方法
细胞培养和蛋白质提取
表达野生型p53的正常人皮肤成纤维细胞（OSU-2）如前所述建立并维持在培养基中(20)。Li-Fraumeni综合征（LFS）成纤维细胞041细胞系（p53-Null）由Michael Tainsky博士（德克萨斯州奥斯汀MD Anderson癌症中心）提供。这两种细胞系都是在37°C的DMEM中生长的，DMEM补充有10%的小牛胎血清（FCS）和抗生素，湿度为5%CO2原代NER缺陷成纤维细胞系GM05509A（XP-A）、GM15983（XP-C）、GM 01389A（XP-E）、GMO 04313E（XP-F）和GM03021B（XP-G）购自NIGMS人类遗传细胞库（新泽西州卡姆登Coriell医学研究所），并在MEM中用2×必需氨基酸生长，2×非必需氨基酸和2×维生素，添加15%FCS和抗生素。人肺上皮H460细胞和表达XPA siRNA的H460淋巴细胞[通过感染编码XPA特异性发夹形成siRNA的pRETRO-XPA逆转录病毒载体获得(21)]来自Anatoly Zhitkovich博士（罗得岛州普罗维登斯布朗大学）。小鼠胚胎成纤维细胞ts20（对E1泛素激活酶具有温度敏感性）及其亲本细胞系A31N由Harvey L.Ozer博士（UMDNJ-新泽西医学院）提供。两种细胞系均在含10%FCS和抗生素的50%F-10+50%DMEM培养基中培养，培养温度为32°C，湿度为5%CO2(22)。必要时，在处理和实验开始前16 h将细胞转移至限制温度（39°C）。杀菌灯以1.0 J/m的剂量率进行紫外线照射2/s由Kettering 65型辐射计（伊利诺伊州弗农希尔科尔帕尔默仪器公司）测量。在每个时间点，收集细胞并在SDS裂解缓冲液（62.5 mM Tris–HCl，pH 6.8，10%甘油，2%SDS和蛋白酶抑制剂）中直接煮沸制备细胞裂解物。
抗体和表达结构
用与人类XPC蛋白C末端相对应的合成肽（KTKREKKAAASHLFPFEKL）免疫兔子，并用肽（马萨诸塞州霍普金顿市BioSource）纯化亲和力，从而产生抗XPC抗体（XPC-2）。该抗体不仅能识别人类，还能识别小鼠XPC蛋白。日本大阪大学的Fumio Hanaoka博士慷慨提供了另一种针对XPC蛋白全长的多克隆抗XPC抗体。用与人DDB2蛋白N末端相对应的合成肽（KRPETQKTSEIVLRPRNKR）免疫家兔，并用肽（BioSource）纯化亲和力，产生抗-DDB2抗体（DDB2-A）。多克隆抗XPA（FL-273）、抗XPB（S-19）、抗SUMO-1（FL-101）、抗泛素（FL-76）、抗拉明B（C-20）、抗Ubc9（H-81）和单克隆抗p53（DO-1）抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc（加州圣克鲁斯）；兔抗SUMO-2/3来自Zymed（加利福尼亚州南旧金山）；单克隆抗肌动蛋白来自Neomarkers（Fremont，CA）；单克隆抗FLAG来自Stratagene（加州La Jolla）；单克隆抗HA来自BD Bioscience（加州圣何塞）。通过将XPC和XPA cDNA分别亚克隆到pcDNA3.1/V5-His载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，生成pcDNA3.1/XPC-V5-H和pcDNA3.11/XPA-V5-H表达结构。FLAG-tagged DDB2结构（pBJ5-DDB2）由Gilbert Chu博士（加利福尼亚州斯坦福大学）提供。用ClaI和HindIII从SUMO-FLAG的基于pRK的表达载体（由贝勒医学院冯新华博士慷慨提供）中切下SUMO-FLA，然后亚克隆到pcDNA3.1载体（Invitrogen）。野生型p53表达载体由Bert Vogelstein博士（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）善意提供。Ub-HA的表达载体来自Dr Dirk Bohmann（德国海德堡欧洲分子生物学实验室）。根据制造商的说明，使用FuGene 6（印第安纳波利斯罗氏）或Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行细胞转染。
免疫沉淀和免疫印迹
对全细胞裂解物进行IP。在SDS裂解缓冲液中直接煮沸制备的细胞裂解液用RIPA缓冲液（50 mM Tris–HCl，pH 7.4，1%NP40，0.25%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA和150 mM NaCl）稀释10倍。在用30μl蛋白G plus/A琼脂糖珠（癌基因研究产品，加利福尼亚州圣地亚哥）进行预处理后，将2 mg总蛋白与所需抗体在4°C下孵育过夜，然后用50μl蛋白质G plus/A琼脂糖珠子在4°C下再孵育1 h。用RIPA缓冲液洗涤珠子四次，然后在2×SDS样品缓冲液中煮沸。然后对免疫沉淀物进行SDS–PAGE，用所需抗体进行免疫印迹检测特定蛋白，如前所述(23).
RNA干扰
Ubc9 siRNA的靶序列为GCAGAGCCCTACACGATTTAC（Dharmacon Research，Lafayette，CO），对应于人类Ubc9编码区C末端的核苷酸391-411。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将siRNA转染到OSU-2细胞中。转染siRNA 48小时后，以20J/m的紫外线照射细胞2并再孵育1小时。通过在SDS裂解缓冲液中直接沸腾制备细胞裂解物，并将相同量的裂解物加载到4–12%的梯度凝胶上进行SDS–PAGE和蛋白质印迹。
结果
紫外线处理诱导XPC的一系列新型共价修饰
在SDS裂解缓冲液中直接煮沸制备的紫外线照射正常人成纤维细胞OSU-2细胞裂解物的Western blotting显示，存在至少三种蛋白质与XPC特异性多克隆抗体相互作用，这些蛋白质在125kDa和145-220kDa迁移()。主要的125kDa带被建立来代表内源性XPC蛋白。然而，145-220kDa蛋白质（离散带用X、X′和X〃表示）的特性尚不清楚，其强度随着紫外线处理剂量的增加而增强。此外，我们的结果表明，在5到50 J/m的剂量范围内，紫外线照射1 h后，125kDa XPC的量减少2在一个延长的时间过程实验中，XPC的高分子量形式在20 J/m后的5分钟内出现2紫外线处理1小时达到最高水平，8小时后不再检测到()。在几种不同人类细胞系的提取物中，如HeLa、WI38、HCT116（数据未显示）以及小鼠细胞的提取物中也检测到相同的紫外线辐射诱导的XPC变体模式（见下文结果）。最重要的是，这些蛋白物种以及内源性XPC在XP-C细胞中未检测到（数据未显示），但在体外表达XPC-V5-His的XP-C电池中可以检测到（见下面的结果），进一步证实145-220kDa蛋白代表内源性XPC的变异。
XPC的多个高分子量条带是正常人细胞紫外线照射的结果。以0、5、10、20和50 J/m的紫外线照射OSU-2细胞2孵育1小时(A类)或以20焦耳/米的速度照射2并孵育指定时间(B类)。细胞裂解物在SDS裂解缓冲液中煮沸制备，如材料和方法所述。将总蛋白（50μg）载入SDS–PAGE，并用兔抗XPC抗体（XPC-2，1:5000）进行免疫印迹检测。
紫外线辐射诱导的XPC的高分子量形式是SUMO-1和泛素共轭
由于在变性条件下（在SDS裂解缓冲液中煮沸）检测到了紫外线诱导的高分子量形式的XPC，我们认为XPC是共价修饰的。蛋白质的常见共价修饰包括磷酸化、乙酰化、泛素化和sumoylation等。由于修饰后的XPC具有比天然XPC至少多20kDa的高分子量，我们推测这些修饰可能是泛素化或sumoylation。为了表征这种修饰，我们用抗SUMO-1、抗SUMO-2/3或抗泛素抗体对紫外线处理和模拟处理的OSU-2细胞的裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀用兔抗XPC抗体进行免疫印迹分析。如所示模拟处理样品（通道1）的裂解液中未检测到高分子量形式的XPC，而紫外线处理样品的裂解液（通道5）中检测到不同的高分子量XPC。抗SUMO-1、抗SUMO-2/3和抗泛素抗体并没有降低模拟处理样品中任何可检测到的XPC变体（2-4道）。相反，在抗SUMO-1的免疫沉淀物中清楚地检测到这些XPC变体，但在紫外线处理的样品（通道6和7）中没有检测到抗SUMO-2/3抗体，这表明紫外线诱导的XPC共价偶联物可能是SUMO-1。紫外光照射后，XPC似乎也被泛素修饰，因为我们也在用抗泛素抗体衍生的免疫沉淀物中修饰的XPC位置检测到微弱的抗XPC反应带（与通道6相比）。为了证实这些结果，我们进行了一个相互的IP实验，其中我们免疫覆盖了裂解物中的XPC蛋白，并检测到SUMO-1或泛素结合蛋白。由于我们的抗XPC抗体被认为不适合IP，我们在XP-C细胞中表达带有V5和His标记的XPC蛋白以及SUMO-1-FLAG或泛素-HA，然后对转染细胞进行紫外线照射。用Ni-NTA琼脂糖珠纯化XPC蛋白，用western blotting检测XPC蛋白的抗XPC、sumoylated XPC的抗FLAG和泛素化XPC的抗HA。如所示，在紫外线照射后异位表达XPC-V5-His的XP-C细胞中可以检测到修饰的XPC蛋白(，车道1、2、5和6）。在同时转染XPC和SUMO-1-FLAG的XP-C细胞中，可以通过紫外线处理而非模拟处理样品中的抗FLAG抗体检测到修饰XPC位置的高分子量条带(，车道3和4）。同样，在同时转染XPC和泛素HA的XP-C细胞中，在紫外线处理但非模拟处理的样品中，也可以通过抗HA抗体检测到修饰XPC位置的高分子量条带(，第7和第8车道）。这些结果进一步证实，紫外线照射后，SUMO-1和泛素都可以修饰XPC蛋白。
紫外线诱导的XPC高分子量带是SUMO-1共轭的(A类)以20 J/m的紫外线照射OSU-2细胞2并培养1h。细胞裂解物在SDS裂解缓冲液中通过直接裂解制备，并在RIPA缓冲液中稀释，如材料和方法所述。用抗SUMO-1、抗SUMO-2/3或抗泛素抗体对总蛋白（2 mg）进行IP处理。用抗XPC抗体免疫印迹法检测沉淀蛋白。将全细胞裂解物（50μg）加载到SDS-PAGE上作为输入。(B类)用XPC-V5-His加SUMO-1-FLAG或XPC-V5-His加Ub-HA转染XP-C细胞，然后以20 J/m的紫外线照射2并允许修复1 h。使用总蛋白（2 mg）与Ni-NTA琼脂糖珠下拉。用抗XPC、抗FLAG或抗HA抗体检测沉淀蛋白。
为了进一步测试紫外线诱导的XPC修饰之一是否是sumoylation的结果，我们试图评估干扰内源性Ubc9表达对紫外线诱导XPC修饰的影响。由于Ubc9是SUMO家族成员修饰的唯一E2酶，抑制其表达会破坏其底物的sumoylation。我们使用了一种针对人类Ubc9编码区的21 nt siRNA，并检测了其在沉默OSU-2细胞中Ubc9表达方面的有效性及其对紫外线诱导的XPC修饰的影响。用siRNA转染48小时后，OSU-2细胞表达的Ubc9蛋白水平显著降低(，车道3、4、7和8）。相反，用不相关的对照siRNA处理OSU-2细胞并没有降低Ubc9蛋白的水平(，车道2和6）。正如预期的那样，无论siRNA转染如何，在模拟处理的OSU-2细胞中均未检测到较高分子量的XPC。相反，紫外线照射确实诱导了较高分子量的XPC，并且在转染Ubc9 siRNA的细胞中XPC修饰形式的数量显著减少，但没有控制siRNA(，车道5-8）。与未转染细胞相比，修饰形式的相对抑制测量表明，转染50和100 nM Ubc9 siRNA的细胞分别减少了约20%和60%(，第7和第8车道）。这些结果进一步证实，XPC的紫外线诱导修饰至少部分是磺酰化。有趣的是，Ubc9 siRNA的转染也导致紫外线照射后XPC水平下降，转染100 nM Ubc9 siRNA的细胞减少50%(表明Ubc9可能通过将SUMO偶联到XPC蛋白，在紫外线照射后充当XPC蛋白的稳定剂。
Ubc9 siRNA敲低Ubc9的表达并破坏紫外线诱导的XPC高分子量条带。将对照siRNA或靶向Ubc9的siRNA瞬时转染OSU-2细胞48 h。细胞以20 J/m的紫外线照射2然后再孵育1 h。细胞裂解物进行SDS–PAGE，并用抗XPC、抗Ubc9或抗Actin抗体进行蛋白印迹检测。每个带的强度通过密度测定法确定，并计算每个带的相对强度，作为未转染对照。
紫外线诱导XPC修饰需要DDB2
我们的研究和其他研究表明，DDB2是调节CPD GGR的关键因素，可能是通过XPC募集到DNA损伤位点(24–26)。此外，p53可能通过反式激活DDB2蛋白的表达参与GGR(27)。因此，我们测试了DDB2或p53是否参与紫外线诱导的XPC修饰。对正常人成纤维细胞OSU-2细胞、p53缺失的041细胞和DDB2缺失的XP-E细胞用20J/m2紫外线和修复1小时后，细胞裂解物的Western blot分析显示041细胞中XPC的修饰非常微弱，但紫外线照射后XP-E细胞中没有修饰(，3–6道），而紫外线处理后，OSU-2细胞中的这种修饰非常明显(，车道1和2）。似乎p53和DDB2都是UV诱导的XPC修饰所必需的。为了进一步证明这一结果，我们将p53或DDB2 cDNA转染到041细胞中，以确定紫外线诱导的XPC修饰是否可以在这些蛋白质恢复时显现。众所周知，041细胞中DDB2缺乏是由于其上游转录因子p53缺乏所致(27)。因此，仅体外表达DDB2的041细胞可用于研究DDB2功能，而不受p53的干扰。转染后48小时，在转染的041细胞中确认了p53或DDB2蛋白的表达。如所示，041细胞中未检测到p53和DDB2水平（通道1）。然而，p53的转染不仅恢复了p53的表达，而且增加了内源性DDB2水平（通道2）。相反，转染DDB2只恢复了DDB2的表达，而p53仍无法检测到（第3条线）。因此，这些细胞系可用于研究p53或DDB2在紫外线诱导的XPC修饰中的作用。如所示，瞬时转染p53结构（p53+，DDB2+）的041细胞显示恢复了紫外线诱导的XPC修饰(，车道6与车道4）。此外，仅转染DDB2结构（p53−，DDB2+）的041细胞也显示了紫外线诱导的XPC修饰的恢复(，第8车道对第4车道）。因此，紫外线诱导的XPC的sumoylation和泛素化似乎需要正常的DDB2基因产物。
p53和DDB2参与SUMO-1和泛素对紫外线诱导的XPC修饰(A类)将OSU-2、p53缺陷型041和DDB2缺陷型XP-E细胞以20 J/m的紫外线照射2将细胞裂解物与抗XPC抗体进行western印迹。(B类)和(C类)用p53或DDB2-FLAG构建物瞬时转染041细胞株48 h。细胞以20 J/m的紫外线照射2用抗p53或抗DDB2蛋白进行western blotting检测分离蛋白，以确认转染物中的异位表达(B类)。用兔抗XPC抗体检测XPC及其修饰(C类).
XPA需要用于紫外线诱导的XPC修饰以及防止紫外线导致的XPC降解
众所周知，GGR中有六个核心修复因子，例如XPC-hHR23B、TFIIH、XPA、RPA、ERCC1-XPF和XPG(28–31)在切除修复过程中，这些因子在损伤部位依次组装(9)。其中，XPA被视为另一个损伤识别因素，以验证损伤，其招募到损伤点需要XPC(6,9)。ERCC1-XPF和XPG是切割含有损伤位点的寡核苷酸所需的两种核酸内切酶，在后期被招募到损伤位点。为了确定紫外线诱导的XPC修饰是否需要这些相对较晚的聚集因子中的任何一个，我们分析了几个细胞系中XPC的修饰，包括XPA缺乏的XP-A细胞系、XPF缺乏的XP-F细胞系和XPG-缺乏的XP-G细胞系。Western blotting清楚地表明，紫外线照射XP-A细胞后不会诱导XPC修饰(，通道4），而在紫外线处理后的XP-F细胞中可以检测到大量XPC修饰(，车道6）。相反，在XP-G细胞中检测到非常强的紫外线诱导的XPC修饰信号，与正常OSU-2细胞中的信号相似(，泳道8）。有趣的是，紫外线照射后XP-A细胞中XPC的稳态水平显著降低(，车道3与车道4）。这些结果表明，XPA是紫外线诱导XPC修饰所必需的，并且在没有XPA蛋白的情况下，紫外线照射似乎会降解更多的XPC蛋白。为了验证XPA参与紫外线诱导的XPC修饰，我们将XPA cDNA转染到该XP-A细胞中。正如预期的那样，转染不仅恢复了XPA的表达，还恢复了XP-A细胞中紫外线诱导的XPC修饰(，车道3和4与车道1和2）。此外，XPA的表达也降低了紫外线诱导的XPC降解。我们进一步测试了另一对仅在XPA表达水平上不同的同基因H460细胞系。以XPA为靶向的控制载体或siRNA稳定转染H460细胞，以20 J/m的紫外线照射2用抗XPA抗体进行Western blotting检测发现，稳定转染XPA siRNA的H460细胞中XPA蛋白水平显著降低()。XPC的免疫印迹分析表明，紫外线诱导的XPC修饰量也随着该细胞系中XPA的减少而减少()。同时，在表达XPA siRNA的H460细胞中，紫外线照射后XPC的稳态水平略有下降，而在转染对照载体的H460细胞中，XPC水平没有明显变化。这些数据进一步表明XPA是紫外线诱导XPC修饰的关键决定因素，XPA可能是NER期间XPC蛋白的稳定剂。
紫外线诱导的XPC修饰在XP-A细胞中受到损害(A类)以20 J/m的紫外线照射OSU-2、XP-A、XP-F和XP-G细胞2再孵育1 h。对蛋白质进行SDS–PAGE，并用抗XPC和抗XPB（负载控制）抗体进行检测。(B类)用空载体或pcDNA3.1/XPA瞬时转染XP-A细胞48 h，紫外线照射20 J/m2然后再孵育1 h。对蛋白质进行SDS-PAGE，并用抗XPC、抗XPA和抗Actin（负载控制）抗体进行检测。(C类)以20 J/m的紫外线照射H460细胞（表达对照载体或靶向XPA的siRNA）2然后再孵育1 h。对蛋白质进行SDS-PAGE，并用抗XPC、抗XPA和抗XPB抗体进行检测。
紫外线诱导的XPC修饰需要泛素-蛋白酶体系统
我们已经证明泛素-蛋白酶体系统影响XPC募集到损伤部位，参与哺乳动物细胞的NER(32)。在这里，我们评估泛素-蛋白酶体系统是否也参与紫外线诱导的XPC修饰。我们首先使用含有温度敏感性泛素激活酶（E1）的小鼠ts20细胞系测试泛素化在紫外线诱导的XPC修饰中的作用。E1泛素激活酶在允许温度（32°C）下活性，而在限制温度（39°C）时不活性，从而损害泛素化功能。在母代A31N细胞中，紫外线照射能够在32和39°C下诱导XPC修饰，这表明紫外线诱导的XPC修饰也可能发生在小鼠细胞中(，1-4车道）。同样，紫外线照射也会导致32°C培养的ts20细胞发生XPC修饰，尽管修饰比A31N细胞弱(，车道6）。相反，在39°C培养的ts20细胞中，可以观察到紫外线诱导的XPC修饰显著减少(，车道8）。这些结果表明泛素化参与了紫外线诱导的XPC修饰。我们通过使用20S催化亚基、MG132和乳酸菌素的特异抑制剂，进一步研究了26S蛋白酶体在紫外线诱导的XPC修饰中的参与。有趣的是，用MG132处理OSU-2细胞在紫外线照射后的不同时间完全消除了紫外线诱导的XPC修饰(，3–8车道）。类似地，用另一种更为特异的20S抑制剂，乳酸菌素进行治疗，该抑制剂显著降低了紫外线诱导的XPC修饰(（第4车道与第2车道）进一步加强了26S蛋白酶体在紫外线诱导XPC修饰中的参与作用。综上所述，结果表明，紫外光照射后XPC修饰需要泛素-蛋白酶体系统。
泛素-蛋白酶体系统参与紫外线诱导的XPC修饰。(A类)ts20及其亲代细胞系A31N在32°C下培养或转移到39°C培养16小时，然后以20J/m的紫外线照射2并在32°C或39°C下进一步培养1小时。用抗XPC抗体免疫印迹法检测XPC蛋白及其修饰。(B类)用10μM MG132处理OSU-2细胞或模拟处理1 h，并以20 J/M的紫外线照射2在紫外线处理后的指定时间点制备细胞裂解物并进行分析。(C类)用10μM乳酸菌素或模拟物处理OSU-2细胞1 h，并以20 J/M的紫外线照射2进一步孵育1h后制备细胞裂解物，并用抗XPC抗体检测蛋白。
讨论
SUMO翻译后修饰了许多蛋白质，在包括转录调节、染色质结构和DNA修复在内的多种过程中发挥了作用(19)]. 许多与DNA复制和修复相关的因子和酶，包括酵母PCNA、解旋酶WRN、拓扑异构酶I和II以及胸腺嘧啶-DNA糖苷酶，都被SUMO翻译后修饰[有关综述，请参阅(19,33)]. SUMO修饰已被证明可以调节亚核定位、蛋白质-蛋白质相互作用和基因组维持中许多因素的活性。泛素化也被认为参与DNA修复，即NER(32,34–36)。据报道，紫外线照射后，NER因子DDB2和Rad4泛素化(13,37)。此外，在审查这份手稿时，Sugasawa等. (38)据报道，XPC蛋白是NER中的一个初始损伤识别因子，在紫外线照射下泛素化。在本研究中，我们证明XPC蛋白不仅被泛素修饰，还被紫外线照射后的SUMO-1修饰。这一发现拓展了SUMO共轭的底物，并首次在NER现象中引入SUMO修饰。此外，我们还提供了哺乳动物细胞中XPC泛素化的直接证据。
各种NER因子在紫外线诱导XPC sumoylation和泛素化中的作用
虽然本文描述的结果为紫外线诱导的XPC琥珀酰化和泛素化提供了非常明确的证据，但我们尚未完全理解其在作用机制中的意义或作用。在我们的研究中，我们已经表明，包括DDB2和XPA在内的几种修复因子对于紫外线诱导的XPC修饰是必需的。DDB2作为受损DNA结合复合体（DDB）的一个亚单位，被认为与NER有关[有关综述，请参阅(39)]、转录、细胞周期(40,41)和p53介导的紫外线照射后细胞凋亡(42)。在NER期间，DDB2被认为是第一个DNA损伤识别因子，甚至在紫外线诱导的CPD的GGR期间是XPC之前，并且是XPC招募到DNA损伤位点所必需的(24–26)。因此，我们推测DDB2在紫外线诱导的XPC修饰中的作用是帮助XPC募集并结合到损伤部位，从而实现其sumoylation和泛素化。一些研究表明DDB2在与损伤部位结合后通过泛素蛋白酶体途径降解(43,44)。在缺乏泛素化或蛋白酶体降解功能的情况下，DDB2不能被消除，XPC对损伤位点的补充将受到影响，同时伴随着NER效率的降低(32)。因此，XPC修饰的基本前提是DDB2最初会被招募到损伤部位，可能是为了打开局部染色质或扭曲局部DNA结构，然后被泛素-蛋白酶体途径降解。此后，XPC将被招募到这些破坏地点，并允许对其进行修改。DDB2本身可能作为XPC sumoylation的SUMO连接酶，这一看似合理的替代物尚待研究。例如，Sugasawa等. (38)已经表明，DDB2通过与DDB1、Cullin 4A和Roc1的复合物，对XPC泛素化显示E3连接酶活性。这种复合物是否也能合成相互作用的XPC蛋白仍然是一个悬而未决的问题。
众所周知，DDB2并不是紫外线诱导XPC修饰所需的唯一因素。我们的结果表明，即使XPC定位在损伤部位，在没有XPA的情况下也不会被修改。众所周知，NER因子在损伤部位的组装是有序的，XPC-hHR23B是主要的DNA损伤结合蛋白，对其他NER成分补充到DNA损伤部位至关重要。XPA对DNA损伤的补充需要功能性XPC，而XPA不需要在DNA损伤部位累积XPC(9)。然而，Sugasawa等. (38)结果并没有显示XPA参与紫外线诱导的XPC修饰。目前，这两项研究之间的明显差异只能归因于使用不同的细胞系统。首先，两个XP-A细胞系来自不同的个体。第二，本研究中使用的XP-A细胞是未转化的，而Sugasawa使用的细胞等研究是一种SV40转化细胞系。像苏加萨瓦等我们也无法在另一个SV40转化细胞系XP12RO中看到修饰反应（数据未显示）。我们不能排除在固定步骤中某些XPA功能被其他因素替代的可能性。值得注意的是，SV40转化的细胞系比未转化细胞系显示出更高的非特异性XPC抗体交叉反应带(38)。然而，在本研究中，XPA蛋白修复实验和XPA siRNA敲除实验都表明，XPA对紫外线诱导的XPC修饰是绝对必要的。因此，我们假设只有当XPA蛋白被招募到损伤部位时，XPC才会被修饰。
XPC酰化在NER中的作用
根据目前对所涉及过程的理解和我们的结果，可以推测XPC聚合的功能方面。研究表明，XPC及其酵母同源物Rad4可以通过泛素-蛋白酶体途径降解(10,13)。我们的结果表明，紫外线照射可以引发XPC的轻微降解，这发生在NER的早期阶段，即照射后1-2小时。然而，在紫外光照射下，很少或没有XPC sumoylation的细胞，如XP-A细胞、表达XPA siRNA的H460细胞和转染Ubc9 siRNA的OSU-2细胞，XPC蛋白水平显著降低。很明显，SUMO修饰靶蛋白的一个功能是通过阻断泛素通常附着在蛋白质上的赖氨酸残基来阻止泛素化，从而稳定靶蛋白(45–48)。因此，我们认为紫外线诱导的XPC sumoylation可以抑制其降解。离开NER复合体后，XPC蛋白仍保持功能活性，以启动新一轮DNA损伤识别。然而，如果XPC没有被修饰，它将通过泛素-蛋白酶体系统被降解。在酵母中的一项研究已经表明，在ubc9号机组敲除细胞，表明Ubc9可能通过结合SUMO修饰在稳定Rad4的途径中发挥作用(49).
细胞中XPC蛋白的基本量对于有效去除紫外线诱导的光产物显然很重要。埃默特等. (50)显示部分校正的XP-C细胞（XPC蛋白水平可检测但低于正常水平）对CPD有正常修复，但对6-4PP的修复最小。最近的一项研究表明，敲除mHR23A和mHR23B基因会显著降低MEF中XPC的稳态水平，然后表现出与XP-C细胞相似的修复缺陷(10)。此外，XPC的异位表达绕过了这些细胞的修复缺陷。我们还试图通过将Ubc9 siRNA转染到具有修复能力的OSU-2细胞中来抑制这一过程，从而确定紫外线诱导的XPC sumoylation在NER中的作用。然而，我们没有发现转染细胞和未转染细胞在去除CPD和6-4PP方面存在任何差异（数据未显示）。这可以解释为siRNA转染部分降低了靶蛋白的水平，并且残余表达可能足以实现正常的修复功能。如以下结果所示，Ubc9 siRNA转染抑制了60%的紫外线诱导的sumoylation。然而，这种水平的SUMO修饰介导的抑制只导致细胞XPC降解50%。剩余的XPC蛋白必须足以进行新一轮的损伤识别，因此，无法检测到对修复的影响。然而，与此相反，对酵母的研究表明ubc9-1Δ菌株（Ubc9缺失）的Rad4水平较低，因此与正常菌株相比，紫外线敏感性增加(49)。因此，很明显，必须等待一种新的、更有效的方法来消除sumoyalization，才能对紫外线诱导的XPC sumoyalization在哺乳动物细胞中的功能进行确切的描述。
SUMO的另一个公认功能是可以改变与其他大分子的底物相互作用(16)。SUMO对生物分子相互作用的影响也因不同底物而异。例如，sumoylation使RanGAP1与核孔复合物蛋白RanBP2/Nup358紧密结合(51,52)而SUMO修饰的胸腺嘧啶-DNA糖苷酶对DNA底物的亲和力降低(53)。Wakasugi和Sancar发现XPC-hHR23B参与了切除核酸酶的初始组装，但在最终的双切口复合物中不再存在(54)。可能在收集了TFIIH、XPA和/或RPA等因子后不久，XPC-hHR23B就离开了复合体。如使用胆固醇源性病变的研究所示，NER反应的后段至少可以在体外，在没有XPC的情况下进行(55)。因此，我们认为XPC sumoylation的一个功能可能是降低结合XPC分子对受损位点的亲和力，并在完成后续因子（例如XPA和ERCC1-XPF）的招募后促进其离开NER复合体。然而，这一假设必须通过未来的实验加以证实。
XPC泛素化在NER中的作用
在这项研究中，我们还发现XPC在紫外线照射后在哺乳动物NER-profective细胞中泛素化。通常，泛素化蛋白质以蛋白酶体为目标进行降解(56)。然而，泛素化蛋白通常具有独立于蛋白水解的调节功能。我们的结果显示了一个有趣的现象，即紫外光照射后，与修复缺陷的XP-a细胞相比，修复缺陷的OSU-2细胞显示出更高水平的紫外线诱导泛素化XPC，但XPC降解更少。看起来，这种紫外线诱导的XPC泛素化主要不是为了降解，而泛素化的XPC由于其快速转换而无法被检测到。菅泽等还发现，紫外线诱导的XPC泛素化并没有通过26S蛋白酶体诱导降解，并且表明这种泛素化改变了XPC的DNA结合特性，这可能影响了无细胞NER切口(38).
总之，我们已经证明，在紫外线照射下，NER因子XPC可以被SUMO-1和泛素修饰。修改需要其他功能NER因子，包括DDB2和XPA。泛素-蛋白酶体系统的关键相互作用影响XPC修饰和基因组内损伤部位的生产性修复。紫外线诱导的XPC sumoylation的功能可能与XPC蛋白的稳定和XPC与受损DNA的结合亲和力降低有关。未来的工作需要绘制XPC蛋白中的sumoylation位点，并阐明XPC sumoylationandubiquitylation在NER调节中的精确功能作用。
致谢
我们感谢Michael Tainsky博士、Bert Vogelstein博士、Anatoly Zithkovich博士、Fumio Hanaoka博士、Gilbert Chu博士、Xin-Hua Feng博士和Dirk Bohmann博士提供了宝贵的细胞和试剂。我们还感谢罗伯特·斯内普卡博士的有益讨论和艾哈迈德·贾马对实验的帮助。这项工作得到了NIH向A.A.W.拨款ES6074、ES12991和CA93413的支持。美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）为支付本文的开放获取出版费用提供了资金。
利益冲突声明。未声明。
参考文献
1De Laat W.L.、Jaspers N.G.、Hoeijmakers J.H.核苷酸切除修复的分子机制。基因发育。1999;13:768–785.[公共医学][谷歌学者] 2Hanawalt P.C.核苷酸切除修复的亚途径及其调控。致癌物。2002;21:8949–8956.[公共医学][谷歌学者] 三。Masutai C.、Sugasawa K.、Yanagisawa J.、Sonoyama T.、Ui M.、Enomoto T.、Takio K.、Tanaka K.、Van der Spek P.J.、Bootsma D.等人。涉及着色性干皮病C组蛋白和酵母RAD23人类同源物的核苷酸切除修复复合物的纯化和克隆。EMBO J。1994;13:1831–1843. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Shivji M.K.K.，Eker A.P.M.，Wood R.D.C组着色性干皮病DNA修复缺陷和来自HeLa细胞的补充因子。生物学杂志。化学。1994;269:22749–22757.[公共医学][谷歌学者] 5Araki M.、Masutai C.、Takemura M.、Uchida A.、Sugasawa K.、Kondoh J.、Ohkuma Y.、Hanaoka F.中心体蛋白中心蛋白2/caltractin 1是启动全球基因组核苷酸切除修复的着色性干皮病C组复合体的一部分。生物学杂志。化学。2001;276：18665–18672。[公共医学][谷歌学者] 6Sugasawa K.，Okamoto T.，Shimizu Y.，Masutani C.，Iwai S.，Hanaoka F.一种用于全局基因组核苷酸切除修复的多步骤损伤识别机制。基因发育。2001;15:507–521. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Sugasawa K.、Shimizu Y.、Iwai S.、Hanaoka F.色素沉着性干皮病C组蛋白复合物识别DNA损伤的分子机制。DNA修复（金额）2002;1:95–107.[公共医学][谷歌学者] 8Sugasawa K.、Ng J.M.Y.、Masutai C.、Iwai S.、Van der Spek P.、Eker A.、Hanoaka F.、Bootsma D.、Hoeijmakers J.H.J.色素沉着症C组复合物是全球基因组核苷酸切除修复的发起人。分子细胞。1998;2:223–232.[公共医学][谷歌学者] 9Volker M.、Mone M.J.、Karmakar P.、Van Hoffen A.、Schul W.、Vermeulen W.、Hoeijmakers J.H.、Van Driel R.、Van-Zeeland A.A.、Mullenders L.H.核苷酸切除修复因子的序列组装体内.分子细胞。2001;8:213–224.[公共医学][谷歌学者] 10Ng J.M.、Vermeulen W.、Van der Horst G.T.、Bergnik S.、Sugasawa K.、Vrieling H.、Hoeijmakers J.H.色素沉着干皮病C组蛋白损伤诱导和依赖RAD23稳定的DNA修复新调节机制。基因发育。2003;17:1630–1645. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Okuda Y.、Nishi R.、Ng J.M.、Vermeulen W.、Van der Horst G.T.、Mori T.、Hoeijmakers J.H.、Hanaoka F.、Sugasawa K.两种哺乳动物Rad23同源物的相对水平决定了着色性干皮病C组蛋白复合物的组成和稳定性。DNA修复（金额）2004;三:1285–1295.[公共医学][谷歌学者] 12Adimoolam S.、Ford J.M.p53和DNA损伤诱导的着色性干皮病C组基因表达。程序。美国国家科学院。科学。美国。2002;99:12985–12990. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Lommel L.、Ortolan T.、Chen L.、Madura K.、Sweder K.S.26 S蛋白酶体对核苷酸切除修复蛋白的蛋白酶解。货币。遗传学。2002;42:9–20.[公共医学][谷歌学者] 14Melchior F.SUMO-非经典泛素。每年。Rev.细胞发育生物学。2000;16:591–626.[公共医学][谷歌学者] 15SUMO改良Hay R.T.蛋白质。趋势生物化学。科学。2001;26:332–333.[公共医学][谷歌学者] 16SUMO对Johnson E.S.蛋白进行修饰。每年。生物化学评论。2004;73:355–382.[公共医学][谷歌学者] 17Saitoh H.，Hinchey J.小泛素相关蛋白修饰剂SUMO-1与SUMO-2/3的功能异质性。生物学杂志。化学。2000;275:6252–6258.[公共医学][谷歌学者] 18Tatham M.H.、Jaffray E.、Vaughan O.A.、Desterro J.M.、Botting C.H.、Naismith J.H.、Hay R.T.SUMO-2和SUMO-3的聚合物链通过SAE1/SAE2和Ubc9与蛋白质底物结合。生物学杂志。化学。2001;276:35368–35374.[公共医学][谷歌学者] 19吉尔·G·SUMO和细胞核中的泛素：不同的功能，相似的机制？基因发育。2004;18：2046–2059。[公共医学][谷歌学者] 20Venkatachalam S.、Denissenko M.F.、Wani A.A.人类细胞中的DNA修复：通过非竞争性免疫分析对大量抗BPDE DNA加合物进行定量评估。致癌。1995;16:2029–2036.[公共医学][谷歌学者] 21Reynolds M.，Peterson E.，Quievryn G.，Zhitkovich A.人类核苷酸切除修复有效去除铬-DNA磷酸加合物并保护细胞免受铬酸盐毒性。生物学杂志。化学。2004;279:30419–30424.[公共医学][谷歌学者] 22Chowdary D.R.，Dermody J.J.，Jha K.K.，Ozer H.L.泛素途径缺陷的突变细胞系中p53的积累。分子细胞生物学。1994;14:1997–2003. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Wani M.A.，Zhu Q.Z.，El Mahdy M.A.，Wani A.A.p53抑癌蛋白对人类细胞DNA修复和凋亡反应的影响。致癌。1999;20：765–772。[公共医学][谷歌学者] 24Wang Q.E.，Zhu Q.，Wani G.，Chen J.，Wani A.A.紫外线辐射诱导染色质内XPC易位是由受损DNA结合蛋白DDB2介导的。致癌。2004;25:1033–1043.[公共医学][谷歌学者] 25Fitch M.E.、Nakajima S.、Yasui A.、Ford J.M。体内通过DDB2基因产物向紫外线诱导的环丁烷嘧啶二聚体招募XPC。生物学杂志。化学。2003;278:46906–46910.[公共医学][谷歌学者] 26Fitch M.E.、Cross I.V.、Turner S.J.、Adimoolam S.、Lin C.X.、Williams K.G.、Ford J.M.。DDB2核苷酸切除修复基因产物p48增强了p53缺陷人类成纤维细胞的全球基因组修复。DNA修复（金额）2003;2:819–826.[公共医学][谷歌学者] 27Hwang B.J.、Ford J.M.、Hanawalt P.C.、Chu G第48页着色性干皮病基因是p53依赖性基因，参与全球基因组修复。程序。美国国家科学院。科学。美国。1999;96:424–428. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Araujo S.J.、Tirode F.、Coin F.、Pospiech H.、Syvaoja J.E.、Stucki M.、Hubscher U.、Egly J.M.、Wood R.D.DNA与重组人类蛋白质的核苷酸切除修复：最小因子集的定义、TFIIH的活性形式和CAK的调节。基因发育。2000;14:349–359. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Aboussekhra A.、Biggerstaff M.、Shivji M.K.K.、Vilpo J.A.、Moncollin V.、Podust V.N.、Protic M.、Hubscher U.、Egly J.-M.、Wood R.D.用纯化蛋白成分重建的哺乳动物DNA核苷酸切除修复。单元格。1995;80:859–868.[公共医学][谷歌学者] 30Guzder S.N.、Habraken Y.、Sung P.、Prakash L.、Parkash S.用纯化的Rad蛋白、复制蛋白A和转录因子TFIIH重建酵母核苷酸切除修复。生物学杂志。化学。1995;270:12973–12976.[公共医学][谷歌学者] 31Mu D.，Park C.-H.，Matsunaga T.，Hsu D.S.，Reardon J.T.，Sancar A.在高度定义的系统中重建人类DNA修复切除核酸酶。生物学杂志。化学。1995;270:2415–2418.[公共医学][谷歌学者] 32Wang Q.E.、Wani M.A.、Chen J.、Zhu Q.、Wani G.、El-Mahdy M.A.、Wani A.A.细胞泛素化和蛋白酶体功能积极调节哺乳动物核苷酸切除修复。摩尔致癌物。2005;42:53–64.[公共医学][谷歌学者] 33Muller S.、Ledl A.、Schmidt D.SUMO：基因表达和基因组完整性的调节器。致癌物。2004;23:1998–2008.[公共医学][谷歌学者] 34Watkins J.F.、Sung P.、Prakash L.、Parkash S.The酿酒酵母DNA修复基因RAD23型编码含有生物功能所需的泛素样结构域的核蛋白。分子细胞。生物。1993;13:7757–7765. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Ikehata H.、Kaneda S.、Yamao F.、Seno T.、Ono T.、Hanaoka F.在非容许温度下孵育会在表达温度敏感的泛素激活酶（E1）的小鼠突变细胞中诱导紫外线抗性不足和诱变分子细胞。生物。1997;17:1484–1489. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Schauber C.、Li C.、Tangoankar P.、Vega I.、Lambertson D.、Potts W.、Madura K.Rad23将DNA修复与泛素/蛋白酶体途径联系起来。自然。1998;391:715–718.[公共医学][谷歌学者] 37Matsuda N.、Azuma K.、Saijo M.、Iemura S.、Hioki Y.、Natsume T.、Chiba T.、Tanaka K.、Tanake K.DDB2是着色性干皮病E组基因产物，由基于Cullin 4A的泛素连接酶复合物直接泛素化。DNA修复（金额）2005;4:537–545.[公共医学][谷歌学者] 38Sugasawa K.、Okuda Y.、Saijo M.、Nishi R.、Matsuda N.、Chu G.、Mori T.、Iwai S.、Tanaka K.、Tanaka K.等。UV DDB泛素连接酶复合物介导的XPC蛋白的UV诱导泛素化。单元格。2005;121：387–400。[公共医学][谷歌学者] 39唐杰、朱刚、着色性干皮病互补组E和紫外线损伤的DNA结合蛋白。DNA修复（金额）2002;1:601–616. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Hayes S.、Shiyanov P.、Chen X.、Raychaudhuri P.DDB是一种假定的DNA修复蛋白，可以作为E2F1的转录伙伴发挥作用。分子细胞。生物。1998;18:240–249. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Shiyanov P.、Hayes S.A.、Donepudi M.、Nichols A.F.、Linn S.、Slagle B.L.、Raychaudhuri P.。DDB的天然突变体在刺激p125亚单位的核输入和E2F1激活的转录方面受到损害。分子细胞。生物。1999;19:4935–4943. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Itoh T.、Cado D.、Kamide R.、Linn S.DDB2基因的破坏会导致皮肤肿瘤，并且在紫外线照射下不会导致细胞凋亡，但不会导致化学致癌物。程序。美国国家科学院。科学。美国。2004;101:2052–2057. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Fitch M.E.、Cross I.V.、Ford J.M.p53反应性核苷酸切除修复基因产物p48和XPC（而非p53）定位于紫外线诱导的DNA损伤部位，体内.致癌。2003;24:843–850.[公共医学][谷歌学者] 44Rapic-Orin V.、McLenigan M.P.、Bisi D.C.、Gonzalez M.、Levine A.S.紫外线照射后早期事件紫外线DNA损伤结合因子的顺序结合和p48亚基的降解。核酸研究。2002;30:2588–2598. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Hoege C.、Pfander B.、Moldovan G.L.、Pyrowolakis G.、Jentsch S.RAD6依赖性DNA修复与泛素和SUMO修饰PCNA有关。自然。2002;419:135–141.[公共医学][谷歌学者] 46Desterro J.M.、Rodriguez M.S.、Hay R.T.SUMO-1对IkappaBalpha的修饰抑制NF-kappaB活化。分子细胞。1998;2:233–239.[公共医学][谷歌学者] 47Lin X.，Liang M.，Ling Y.Y.，Brunicardi F.C.，Feng X.H.SUMO-1/Ubc9促进肿瘤抑制因子Smad4的核积累和代谢稳定性。生物学杂志。化学。2003;278:31043–31048.[公共医学][谷歌学者] 48Lee P.S.、Chang C.、Liu D.、Derynk R.Sumoylation of Smad4，转化生长因子-β家族信号的常见Smad介体。生物学杂志。化学。2003;278:27853–27863.[公共医学][谷歌学者] 49Ramsey K.L.、Smith J.J.、Dasgupta A.、Maqani N.、Grant P.、Auble D.T.。NEF4复合物调节Rad4水平，并利用Snf2/Swi2-related ATP酶活性进行核苷酸切除修复。分子细胞。生物。2004;24:6362–6378. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Emmert S.、Kobayashi N.、Khan S.G.、Kraemer K.H.色素沉着性干皮病C组基因导致环丁烷嘧啶二聚体的选择性修复，而非6-4光产物。程序。美国国家科学院。科学。美国。2000;97:2151–2156. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Mahajan R.、Delphin C.、Guan T.、Gerace L.、Melchior F.一种小的泛素相关多肽，参与将RanGAP1靶向核孔复合物蛋白RanBP2。单元格。1997;88:97–107.[公共医学][谷歌学者] 52Matunis M.J.、Coutavas E.、Blobel G.一种新型泛素样修饰调节Ran-GTP酶激活蛋白RanGAP1在胞浆和核孔复合体之间的分配。J.细胞。生物。1996;135:1457–1470. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 53Hardeland U.，Steinacher R.，Jiricny J.，Schar P.泛素样蛋白修饰人类胸腺嘧啶DNA糖苷酶促进酶促转换。EMBO J。2002;21:1456–1464. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 54Wakasugi M.、Sancar A.人类DNA修复切除核酸酶的组装、亚单位组成和足迹。程序。美国国家科学院。科学。美国。1998;95:6669–6674. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Mu D.，Hsu D.S.，Sancar A.人类DNA修复切除核酸酶的反应机制。生物学杂志。化学。1996;271:8285–8294.[公共医学][谷歌学者] 56Hochstrasser M.泛素依赖性蛋白质降解。吉恩牧师。1992;30：405–439。[公共医学][谷歌学者] 
