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BMC癌症。2005; 5: 59.
2005年6月10日在线发布。 数字对象标识：10.1186/1471-2407-5-59
预防性维修识别码：项目经理1177930
PMID：15949035

细胞外超氧化物歧化酶的过度表达可减轻急性放射性肺毒性

扎希德·拉巴尼,1 米切尔·安舍尔,1 罗德尼·J·福尔兹,2 翡翠弓箭手,1 洪晃,1 陈立光,1 玛丽亚·高尔森,2 萨迪斯·萨穆斯基,1 马克·W·德赫斯特,1和泽利科·武贾斯科维奇通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

急性RT诱导的肺损伤以炎症变化为特征，在损伤后期继发纤维化病变。如果炎症/纤维生成介质和氧化应激的来源没有消除或减弱，最终将发生完全的结构消融。因此，本研究的目的是确定小鼠细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）的过度表达是否通过抑制TGFβ1的激活和下调其信号转导途径的Smad3臂来改善急性辐射损伤。

方法

对EC-SOD过表达转基因（XRT-TG）和野生型（XRT-WT）动物进行全胸照射（单剂量，15Gy）。在第1天、第1周、第3、第6、第10和第14周处死小鼠。评估呼吸频率、右肺重量、白细胞总数/差异计数、激活的TGFβ1及其信号转导通路的成分（Smad3和p-Smad2/3），以确定肺损伤。

结果

辐照野生型（XRT-WT）动物的呼吸频率和右肺重量呈时间依赖性增加，而辐照转基因（XRT-TG）小鼠在第3、6、10和14周时，这些参数的增加显著减少（p<0.05）。XRT-WT小鼠出现以巨噬细胞浸润为主的炎症反应。在第1、3、6和14周，XRT-TG动物的急性炎症显著减轻（p<0.05）。在XRT-TG中，激活的TGFβ1的表达及其信号转导途径的成分在随后的时间点显著降低（p<0.05）与。XRT-重量。

结论

这项研究表明，EC-SOD的过度表达对RT诱导的急性肺损伤具有保护作用。EC-SOD似乎部分通过巨噬细胞反应的减弱发挥作用，并通过随后促纤维化TGFβ途径的下调降低TGFβ1的激活。

背景

急性辐射（RT）引起的肺毒性和随后发生的肺纤维化被认为是胸部恶性肿瘤放射治疗的关键剂量限制因素[1]. 亚临床分子和细胞事件在RT治疗期间开始，但临床特征和组织学发现可能在治疗后数月甚至数年内无法显示[2].

在RT诱导的肺损伤中，内皮细胞和上皮细胞的损伤被认为是导致急性肺毒性的最初步骤[三]. 辐射引发的组织损伤和修复与重要生物介质的产生有关，如细胞因子[4]. 这些细胞因子使与RT损伤相关的炎症和纤维生成过程永久化[5]. 细胞因子失调与辐射直接组织损伤在急性和晚期毒性发病机制中的相对作用尚不明确。先前的观察和对这些细胞因子作用的理解的最新进展表明，转化生长因子-β1（TGF-β）是RT诱导的多器官（包括肺）正常组织损伤发展的关键成分[6].

除了细胞因子失调外，下呼吸道的氧化剂/抗氧化剂失衡也被认为是多种炎症性肺损伤的机制[7,8]. 电离RT与自由基生成增加有关[9]氧化损伤的细胞大分子的积累反映了这一点。RT可能通过产生活性氧（ROS）直接损害肺细胞[9]或通过生物介质对实质细胞和炎症细胞的作用间接[4,5]. 这一过程可能会使细胞抗氧化防御能力下降，导致活性氧的毒性水平累积。

细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是自然产生的超氧化物歧化酶的一种亚型，是存在于多种细胞外隔室中的主要抗氧化酶[10]. 这些酶的作用是催化超氧阴离子自由基歧化为氧气和过氧化氢。EC-SOD分泌到细胞外间隙，在肺部主要由肺泡II型肺细胞表达[11]. EC-SOD主要与细胞外基质结合，但也可在血浆中检测到[12]. 这种酶在RT、博莱霉素或高氧诱导的氧化应激性肺损伤中的保护作用已被研究[13-15].

最近，我们报道了转基因小鼠中EC-SOD的过度表达似乎可以保护其免受RT诱导的慢性损伤[13]. 在本研究中，我们从分子和细胞水平分析了早期事件，以阐明EC-SOD过度表达对RT诱导的肺损伤的保护机制。我们假设，放射治疗完成期间和之后，ROS的持续过度生成是RT诱导的肺损伤的发病机制，EC-SOD的持续过度表达可以改善这种损伤。

方法

动物

本研究使用了在肺泡和气道上皮细胞以及野生型（WT）同窝婴儿中过度表达人类EC-SOD（hEc-SOD）的转基因（TG）B6C3小鼠。TG小鼠的产生已经通过Folz等人。[15]. 这些小鼠保持在B6C3背景下。杂合转基因阳性小鼠通常被培育成F1（C57BL/6×C3H）小鼠，转基因阳性幼鼠与其转基因阴性同窝鼠进行比较。对尾部DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析以确认基因型状态。所有这些研究均使用PCR阳性和阴性动物。这些动物在室温下被关在笼子里，12小时的光-暗循环可以获得食物和水随意杜克大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准了该方案。

胸部照射

将动物随机分为四组；未经照射的野生型（Con-WT）、EC-SOD过表达转基因（Con-TG）、经照射的EC-SOD-过表达转基因鼠（XRT-TG）和野生型小鼠（XRT-WT。使用4-MV光子在单个背腹野进行RT，剂量为15 Gy，使用0.5 cm的丸状材料照射整个胸部。在照射后的六个不同时间点（1天、1周、3周、6周、10周和14周）处死小鼠以及匹配的对照组。

呼吸频率

使用全身体积描记室（RM-80型；哥伦布仪器公司，俄亥俄州哥伦布市），通过测量呼吸频率，每周进行肺损伤的功能评估。每只动物在每个时间点读取四个读数，并将平均值用于分析。

支气管肺泡灌洗液

通过腹腔注射戊巴比妥（50μg/g）麻醉小鼠。在充分麻醉开始后，暴露气管，并用20号针穿刺气管，然后用21号钝针代替。气管上系着一条丝质结扎带以固定针头。使用1ml注射器用1ml PBS进行支气管肺泡灌洗（BAL），并重复一次。收集的液体立即进行如下处理。对BAL液（300μL）进行细胞离心，并使用白细胞抑素染色试剂盒进行染色（美国宾夕法尼亚州匹兹堡费希尔科学公司）。随后对至少300个细胞进行计数，以获得不同的细胞计数。细胞BALF（30–50μL）用台盼蓝染色，并用Neubauer血细胞仪（Reichert，Buffalo，New York，USA）手动获得细胞总数。剩余的BALF在1800时离心克在4°C下放置5分钟，倒出上清液并在12000℃下再次离心克在4°C下保持10分钟。收集上清液并保存在-80°C下以供进一步分析，将造粒细胞在液氮中快速冷冻并存储在-80℃下。

湿肺重量

牺牲时，取出右肺，轻轻吸干，并记录湿重。右肺在液氮中快速冷冻，然后储存在-80°C的冰箱中。

组织病理学

各组和每个时间点的小鼠左肺通过气管内滴注4%多聚甲醛于20 cm H的PBS原位固定以进行显微镜检查2O型加压10分钟，然后从胸部取出并浸入额外的固定剂中4-6小时。这些组织被石蜡包埋、切片，并用苏木精和伊红染色。如前所述，肺损伤的组织病理学证据按0分（正常）到4分（最严重）评分[16]. 评估的参数包括血管充血程度、肺泡壁增厚（水肿）、远端气道透明膜形成和炎症细胞积聚。

组织TGF-β1活性

冷冻肺组织在室温下解冻，然后根据重量（每1 mg组织10μL缓冲液）放入含有0.5 mM EDTA的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。通过超声波将样品国产化，然后在4°C下以15000 rpm旋转30分钟。上清液用于夹心酶联免疫吸附试验（ELISA），以量化TGF-β1。为了测定活性TGF-β1，分别用抗TGF-α1单克隆抗体和生物素化抗TGF--β1抗体作为捕获抗体和探针抗体。使用与链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶结合生物素，然后使用底物试剂和停止溶液（所有产品均来自明尼阿波利斯R&D Systems Inc，Minneapolis，MN）。为了量化总TGF-β1，通过向0.1 ml样品中添加0.1 ml 2.5 N酸/10 M尿素激活潜在TGF-α1，并通过添加0.1 ml 2.7 N NaOH/1 M Hepes中和。

使用动态微孔板阅读器（v-max；Molecular Devices，Menlo Park，CA）在外径450 nm处读取了90个六孔微孔板。通过比较过氧化物酶活性和已知的纯化TGF-β1浓度（明尼阿波利斯R&D Systems Inc），测定TGF-？1的水平（总量和活性）。

免疫组织化学(Smad3和p-Smad2/3)

如前所述进行免疫组织化学[17]. 简单地说，石蜡包埋组织切片厚度为5μm，并使用二甲苯溶液和分级乙醇脱蜡和水合。在室温下使用3%过氧化氢的内源性过氧化氢封闭溶液20分钟，然后在去离子水中冲洗。然后将切片置于Biogenex（加州圣拉蒙）柠檬酸盐缓冲液的抗原回收溶液中。将溶液在微波炉中加热3-4分钟，冷却2-3分钟，然后再次在微波炉中加热。在室温下冷却20分钟后，用去离子水冲洗切片。接下来，在室温下将切片在10%的驴血清和磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育25分钟，以减少抗体的非特异性结合。然后用1X PBS将切片冲洗三次，用抗Smad 3和p-Smad 2/3的一级抗体覆盖（稀释1:200，Santa Cruz Biotechnology），在37°C的湿度室中培养60分钟。用1%PBS冲洗三次后，按照制造商说明（314KLD，Innovex，Richmond，CA）将二级和三级抗体添加到切片中，并在37°C的湿度室中培养30分钟。在1%PBS中再次冲洗切片三次，然后在室温下用3，3'-二氨基联苯胺四氯化钠（西格玛，圣路易斯，密苏里州）在过氧化物酶底物溶液中培养2分钟。将载玻片在去离子水中清洗三次，每次10分钟，并用苏木精进行复染。在用去离子水再次冲洗后，切片在分级乙醇和二甲苯中脱水，然后安装。使用正常血清作为每组染色的对照。

阳性细胞评分

对肺标本进行盲法评估。在扫描整个肺切片并计算肺实质损伤程度后，选择4个有代表性的区域（40X物镜）进行分析。对形态学变化进行初步定性评估后，记录RT暴露于Smad-3和p-Smad-2/3抗体后出现染色的细胞。将四个字段的测量值之和相加，并计算算术平均值。阳性细胞计数表示为每个场的平均细胞数。将辐照动物肺部的平均值与对照动物的相应值进行比较。

统计方法

学生的t吨测试和单因素方差分析用于测试各组之间每次差异的显著性。p值≤0.05被认为具有统计学意义。所有数据均表示为平均值（±95%置信区间）。

结果

呼吸频率

通过连续14周每周监测呼吸频率来评估动物的肺功能。与对照动物相比，XRT-WT小鼠在照射3周后的呼吸频率逐渐增加（图​（图1）。1). 与XRT-WT小鼠相比，XRT-TG动物的功能性肺损伤发生延迟（3周），呼吸频率显著降低（p<0.05）。在14周的随访期间，两个对照组的平均呼吸频率与基线值相比没有变化（249±2.5与。251 ± 2).

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呼吸频率随时间变化的比较XRT-WT和XRT-TG组单剂量全身照射15Gy后呼吸频率的变化。XRT-WT组呼吸频率显著增加与.XRT-TG，第3、6、10和14周*第页< 0.05. 误差线代表95%的置信区间。

右肺湿重

RT引起的急性肺损伤量通过右肺湿重的增加来测量，右肺湿重量是肺水肿和肺实变的指标。RT治疗导致XRT-WT组右肺湿重显著增加（图​（图2）。2). 与同窝XRT-WT小鼠相比，XRT-TG小鼠品系在3周至14周期间的湿重增加显著减少（p<0.05）。

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右肺湿重随时间变化的比较.暴露于辐射1天、1、3、6、10和14周时的肺重量。辐射暴露3周后，观察到XRT-WT肺湿重显著增加与.XRT-TG，第3、6、10和14周*第页< 0.05). 误差线代表95%的置信区间。

支气管肺泡灌洗液细胞计数

照射后1天，XRT-WT和XRT-TG小鼠的总细胞计数没有差异（图​（图3a）。3a年). 然而，与XRT-TG小鼠相比，XRT-WT小鼠的总细胞计数在1周内显著增加，并在14周前保持升高（p<0.05）。

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支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数的比较来自暴露于辐射的XRT-WT和XRT-TG小鼠。(一)细胞总数。以及(b条)暴露于辐射1天、1、3、6、10和14周时的巨噬细胞计数。细胞和巨噬细胞总数均显著增加(*第页<0.05）随XRT-WT动物暴露时间的变化(c（c）)与XRT-TG小鼠相比，XRT-WT组BALF中的淋巴细胞计数显著增加了3周与.XRT-TG，第3周和第10周*第页< 0.05). 误差线代表95%的置信区间。

BALF细胞计数的增加主要是由于巨噬细胞数量的增加（图​（图3b）。3亿). 从1周开始，XRT-WT小鼠的巨噬细胞显著增加，并在整个观察期内持续存在（XRT-WT与.XRT-TG，在第1、3、10和14周时，p<0.05）。

从3周开始，XRT-WT动物的淋巴细胞计数也显著增加（图​（图3c）3立方厘米)与XRT-TG动物（XRT-WT与.XRT-TG，在3周和10周时，p<0.05）。

组织病理学

照射后3周，XRT-WT小鼠的H&E染色肺切片显示肺顺应性降低，表现为水肿加重、肺泡壁增厚、血管和间质充血以及弥漫性炎性细胞浸润，并随着时间的推移而加重（图。4C、E). 3周后，在XRT-TG小鼠中也观察到组织学变化（图。​（图4D）；4D（四维）); 然而，与XRT-WT动物相比，它们的程度和分布较少（图。​（图4C）。4摄氏度). 在随后的时间点，与XRT-TG动物相比，XRT-WT组的损伤程度和严重程度更大（图4E、F).

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苏木精和伊红染色切片的光学显微镜检查来自对照组的代表性肺部(A、 B类)和治疗组（XRT-WT与.XRT-TG）在3周时(C、 D类)和14周(E、 F类). XRT-WT暴露于3周辐射的代表性肺切片显示，辐射后3周出现轻度至中度损伤(C类)，随着损伤时间的推移逐渐增加，14周时随着肺泡壁增厚和主要由巨噬细胞和其他炎性细胞组成的浸润增强而变为中重度(E类). 而XRT-TG小鼠的肺泡间隔厚度适中，肺泡巨噬细胞和其他炎性细胞数量较少(D、 F类). 放大倍数×400。

转化生长因子β活性

定量评估肺组织中TGFβ1活性和总蛋白表达水平的结果如图所示​图5。5对照动物未受照射的肺组织表达较低水平的TGFβ1。胸部照射后，XRT-WT中活性TGFβ1的肺组织水平在第一周内升高。6周后，TGFβ1活性水平显著升高。与XRT-WT小鼠相比，XRT-TG动物表现出明显更少的TGFβ1激活与XRT-TG，在第6、10和14周时，p<0.05，图​图55).

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照射后肺组织TGFβ1活性的比较1周后开始增加活性TGFβ1的表达。到6周时，与XRT-TG动物（灰三角形）（XRT-WT与.XRT-TG，第6、10和14周，#第页< 0.05). XRT-WT（黑色方块）与XRT-TG动物（黑色三角形）在晚期时间点的总TGFβ1水平显著增加与在10周和14周时*第页< 0.05). 误差线代表95%的置信区间。

信号转导

XRT-WT动物肺实质中Smad 3的免疫反应在1周时明显增强，并且在3-14周时稳定增加。与XRT-WT（XRT-WT与.XRT-TG，在第3、6、10和14周时，p<0.05，图​图6a）第6页)（照射后3周和14周的XRT-WT与XRT-TG的代表性图像如图所示7摄氏度-华氏度).

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a） ：照射后Smad3表达。两名盲法观察者在四个随机区域中以40倍放大率对表达Smad3的细胞进行计数。每只动物的Smad3阳性细胞计数是所有八个读数的平均值。在1周时，XRT-WT肺中Smad3的表达明显增加，并在3-14周时稳定增加。XRT-TG的短暂增加明显低于XRT-WP（XRT-WG）与在第3、6、10和14周时*第页< 0.05).b） ：辐射后p-Smad2/3的表达对p-Smad2/3，以40倍计数细胞阳性，并取每只动物的平均值。在XRT-WT肺中，照射后3周p-Smad2/3表达显著增加。随着时间的推移，XRT-TG动物中阳性染色细胞的比例也增加，但与XRT-WT（XRT-WP）相比，该组的表达水平显著降低与.XRT-TG，第3、6、10和14周*第页< 0.05). 误差线代表95%的置信区间。

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Smad3免疫组化的代表性图像控件的(A、 B类)和XRT-WT与.XRT-TG组，第3周(C、 D类)和14周(E、 F类). 对于Smad3，大多数阳性染色细胞出现在XRT-WT肺损伤区域，与XRT-TG动物相比，显示出显著增加的细胞阳性。XRT-WT的p-Smad2/3免疫组化的代表性图像与XRT-TG组，第3周(G、 H（H）)和14周(一、 J型)辐照后。与XRT-TG小鼠相比，XRT-WT动物的p-Smad2/3阳性率显著增加。有关详细信息，请参阅结果部分。放大倍数×400。

在XRT-WT小鼠中，照射后3周p-Smad2/3阳性率显著增加（XRT-WT与.XRT-TG，在第3、6、10和14周时，p<0.05，图​图6b）。6b条). 随着时间的推移，XRT-TG动物中阳性染色细胞的比例也增加，但与XRT-WT相比，p-Smad2/3的表达显著降低。因此，RT不仅增加了TGFβ的表达和活化，而且增加了纤维化途径下的信号转导。ECSOD的过度表达显著减弱了这种作用。（照射后3周和14周的XRT-WT与XRT-TG的代表性图像如图所示7G–J型).

讨论

目前的证据表明，RT诱导的急性肺损伤以炎症变化为特征，炎症变化在晚期发展为纤维化病变。如果炎症/纤维生成介质和氧化应激的来源没有消除或减弱，最终将发生完全的结构消融[13]. 我们的数据表明，小鼠肺中ECSOD的过度表达似乎通过减少炎症反应、减少TGFβ1的激活，从而降低TGFβ信号转导通路，从而保护小鼠免受急性RT损伤。

我们实验室之前的工作表明，EC-SOD对慢性RT诱导的肺损伤具有保护作用，但我们无法区分急性期炎症反应（肺炎/肺泡炎）和肺照射引起的纤维化反应，因为只研究了一个延迟时间点[13]. 为了回答这个问题，我们使用了肺泡和气道上皮细胞过度表达EC-SOD的TG小鼠。因此，通过使用这种TG小鼠模型，我们能够增强细胞外肺小室的抗氧化能力，其中抗氧化储备可能在保护肺功能免受早期RT损伤方面发挥关键作用。

肺是电离辐射最敏感的器官之一。电离辐射长期以来被认为会在受照组织内引起炎症反应[18-22]. 强有力的证据表明炎症在放射性肺损伤的发展中起着关键作用[23]. 抑制这种急性炎症可能会减少随后的纤维化。

RT诱导的肺损伤中炎症反应的潜在机制是复杂的。内皮细胞损伤导致白细胞粘附并迁移到组织中。炎症细胞是ROS的已知来源[24,25]. 这些细胞还可以释放炎症和纤维生成细胞因子[26]通过向损伤部位募集更多炎性细胞，进一步导致损伤[5]. 本研究中XRT-WT动物下呼吸道炎症细胞募集的时间过程表明炎症在早期辐射损伤中的重要作用。在存在有效的抗炎刺激物（即EC-SOD）的情况下，XRT-TG动物受RT诱导的肺损伤显著减少。

EC-SOD的抗炎作用似乎也降低了继发性纤维化的风险。转基因小鼠中EC-SOD水平的升高已被证明对多种刺激物引起的肺纤维化的发展具有保护作用，包括RT、高氧和博莱霉素诱导的肺纤维化[13-15]. EC-SOD TG小鼠被证明能更好地耐受高氧，部分原因是减少了炎症细胞过度涌入肺部[15]. 在流感病毒诱导的肺炎小鼠模型中，EC-SOD的过度表达显著改善了肺部的炎症和氧化反应[27]. EC-SOD的这种保护作用归因于对一系列炎症介质的抑制作用。在外源性施用SOD后也观察到类似的效果[28,29]流感致肺损伤。

与EC-SOD过度表达的动物相比，EC-SOD-基因敲除小鼠显示出对高氧暴露的敏感性增加，与野生型小鼠相比，炎症反应和间质水肿的出现更早[30]. 在另一项研究中，EC-SOD阴性小鼠表现出对炎症和肺纤维化的敏感性增加。根据这些结果，作者提出EC-SOD保护肺纤维化的一种机制是抑制炎症[31]. 这似乎也是辐射后的情况。

EC-SOD减轻肺部炎症的一种方法是通过抑制巨噬细胞的活化和募集。辐照后不久，巨噬细胞数量增加，并已被证明能产生广泛的细胞因子，刺激成纤维细胞增殖和细胞外基质的产生[32]. 其中包括血小板衍生生长因子（PDGF）[33]白细胞介素-1（IL-1）[34]，肿瘤坏死因子α（TNFα）[35]碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）[36]，和转化生长因子β[37]. 这些细胞因子不仅调节成纤维细胞功能和胶原合成，还招募其他炎症细胞，并参与急性和晚期RT损伤的发病机制[38]. 本研究中XRT-TG小鼠在不同时间点的巨噬细胞计数显示，与XRT-WT相比，其巨噬细胞数量显著减少。该观察结果支持EC-SOD的保护作用是通过其减弱巨噬细胞内流的能力来介导的这一观点。

一些证据支持使用针对TGFβ1的治疗策略来预防各种器官的纤维增生性疾病[三]. 由于其在肺纤维化形成中的意义，阻断TGFβ途径被认为是改善肺纤维化的分子策略，因此具有潜在的临床意义[39]. Wang使用可溶性TGFβII型受体等[40]研究发现，给予博莱霉素后，仓鼠的肺纤维化，包括过量的胶原蛋白积累，大大减少。同样，我们发现，可溶性TGFβII型受体基因治疗可显著减少照射后4周大鼠的急性RT诱导的肺损伤[41]. 对TGFβ信号转导途径的干扰也被证明可以防止纤维化的形成。最近，在气管内注射过表达Smad7的重组腺病毒的小鼠中，一种TGFβ信号的细胞内拮抗剂Smad7能够减轻博莱霉素诱导的肺纤维化[42]. Smad3基因敲除小鼠已被证明能保护其免受RT诱导的软组织损伤[43]. Smad3的丢失干扰了中性粒细胞、巨噬细胞、角质形成细胞和成纤维细胞对TGFβ的趋化反应[44-47]. 损伤部位TGFβ的上调也是Smad3依赖性的[43].

我们的数据进一步支持了这样一种观点，即TGFβ1通过Smad 3途径发出信号对RT诱导的损伤的发展至关重要。EC-SOD的过度表达导致该信号通路的下调，Smad3的表达和磷酸化都证明了这一点。抑制Smad3，甚至部分降低其活性，可以保护其免受辐射毒性的影响。综上所述，这些结果表明，消除TGFβ信号可能足以保护肺纤维化。

总之，本研究表明EC-SOD的过度表达可保护机体免受RT诱导的急性肺损伤。EC-SOD似乎在一定程度上通过巨噬细胞反应的减弱起作用。此外，持续的EC-SOD表达降低了TGFβ的激活，随后降低了纤维化前TGF-β途径的调节。因此，肺细胞外室中的EC-SOD是正常组织对急性辐射损伤的复杂反应的重要调节剂。

缩写

转化生长因子β1：转化生长因子β

EC-SOD公司：细胞外超氧化物歧化酶

RT公司：辐射

XRT-WT公司：辐照野生型

XRT-TG公司：辐照转基因

ROS公司：活性氧

BALF公司：支气管肺泡灌洗液

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

ZNR公司进行研究（呼吸频率、湿肺重量、IHC、数据统计分析）并起草手稿。RJF公司和MG公司提供动物并协助BALF细胞计数分析。每个和液晶显示器帮助组织学/IHC并协助开展研究。电视对动物进行了全胸照射。HH执行TGF-βELISA。随钻测量帮助编辑手稿。ZV公司和海事局构思研究，参与设计和协调，并协助编辑手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

发布前历史记录

本论文的出版前历史可从以下网址获取：

http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/59/prepub

致谢

由国家癌症研究所拨款CA98452支持。

工具书类

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