分子生物学细胞。2002年6月；13（6）：2069–2079。
人类9、12和15号染色体含有应力诱导核体
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马可·德内格里
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
丹妮拉·莫拉利
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
玛丽亚诺·罗基
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
马可·比吉奥格拉
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
埃琳娜·雷蒙迪
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Biologia Cellulare和工作室中心帕维亚大学国家理工学院顾问，27100帕维亚，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，70127巴里，意大利
法比奥·科比安奇
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
路易吉·德卡利
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
西尔瓦诺·里瓦
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Anatomia Patologica和Genetica二分之一，意大利巴里70127
朱塞佩·比亚蒙蒂
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
约瑟夫·加尔，监控编辑器
*国家委员会遗传研究所（Istituto di Genetica Molecolare del Consiglio Nazionale delle）Ricerche，27100 Pavia，意大利；†遗传研究所微生物学“A.Buzzati-Traverso”，以及‡动物生物学双学位，实验室Iistochimica del生物细胞和中心工作室帕维亚大学国家理工学院顾问，27100 Pavia，意大利；和§Sezione di公司Genetica–Patologica和Genetica解剖学研究所，意大利巴里70127
2001年12月4日收到；2002年2月22日修订；2002年3月14日接受。
摘要
我们之前报道了一种新型核子的鉴定在我们称之为热休克HeLa细胞中可检测到的隔室有丝分裂核体（SNB）期间应激诱导的Src激活。这个结构是热休克因子1和丝氨酸精氨酸亚群中RNA加工因子的数量剪接因子。在本文中，我们表明应力诱导的SNB在人体中可检测到，但在仓鼠细胞中无法检测到。通过以下方式仓鼠>人类细胞杂种，我们已经鉴定出三条人类染色体（9、12和15）分别能够指导仓鼠细胞中的应激体。与应力诱导SNB类似小体是hnRNP A1相互作用蛋白和热休克因子1，通常与核仁相关，由染色质周围颗粒簇。我们证明了人类9号染色体足以指导应激的形成仓鼠体内>人类细胞杂种。现场荧光杂交实验表明，近着丝粒9号染色体的异色q12带及其着丝粒区人类12号和15号染色体与应激诱导的SNB共定位细胞。我们的数据表明，人类第9、12和15号染色体包含热冲击HeLa细胞中应力体的成核位置。
简介
压力处理引发复杂的修改细胞新陈代谢，包括DNA复制受阻，转录、RNA处理和翻译。同时，他们激活少量普遍存在的热休克的合成细胞生存所必需的蛋白质(林奎斯特，1986年;森本茂，1993). 在形态层面上，这种深刻的变化细胞的新陈代谢伴随着核结构(奥基夫等。, 1994;塔尼et（等）等。, 1996).
在热休克细胞中发生的重排中，我们和其他人之前曾报道过新型核隔间的形成称为应激体或hnRNP A1相互作用蛋白（HAP）主体(乔利等。, 1997;基奥迪等。2000年).HAP小体通常位于核仁附近，并不重合与其他核隔室，如核仁、Cajal小体，动粒、早幼粒细胞白血病小体或拼接因子丰富的斑点(乔利等。, 1997,1999;基奥迪等。2000年). 虽然据了解，这些核隔间在很大程度上仍不明确它们含有热休克因子1（HSF1）和许多RNA结合蛋白质，包括异质核核糖核蛋白（hnRNP）有丝分裂期间激活的HAP、hnRNP M、Src（Sam68）和SR的一个子集（丝氨酸-精氨酸）剪接因子(乔利等。, 1999;地磅等。, 1999;德内格里等。, 2001). 收件人说明了与Sam68核体（SNB）的密切关系在非应激细胞中检测到，我们最近提议将HAP重命名身体“应激性SNB”(德内格里等。, 2001).虽然应力诱导SNB的出现在时间上与随着热休克基因的表达，它们不是转录(乔利等。, 1997,1999;基奥迪et（等）等。2000年). 然而，RNA合成是形成的必要条件事实上，hnRNP HAP的招募通过放线菌素等RNA聚合酶抑制剂有效预防D和5,6-二氯苯并咪唑核苷(地磅等。,1999). RNA的作用进一步表明应激诱导的SNB对应于染色质周围颗粒簇，即高度堆积的核糖核蛋白复合物(法坎，1994)从整个核质中招募的(基奥迪et（等）等。2000年). 另一方面，并非所有这些组件身体以转录依赖的方式被募集。这是HSF1的情况，已经证明即使在转录不活跃的有丝分裂细胞(乔利等。,1999). 与间期细胞相反，间期细胞中存在大量的细胞对细胞观察到HSF1小体数量的变化，有丝分裂细胞始终显示大小在0.3到1.4之间的四个HSF1实体微米。这些小体与有丝分裂染色体相关，表明尽管尚未确定，但这种特定的染色体位点可能作为HSF1的招聘中心(乔利等。, 1999).
众所周知，许多核子域是动态关联的具有特定的遗传位点。协会就是一个例证在核仁和包含核糖体基因。在人类中，核糖体基因分布在五个染色体位点称为核仁组成区或NOR，它们是位于肢端中心的短臂上智人（HSA）染色体（HSA13、14、15、21和22）(亨德森等。,1972). 有丝分裂退出时，单个NOR周围形成小核仁然后融合成大核仁，包括活性核仁和沉默核仁NOR标准(10月等。, 1985;沙利文等。, 2001).卡哈尔天体提供了另一个核身体和特定基因位点。事实上，卡哈尔的尸体最近显示与组蛋白基因簇结合(弗雷和马特拉，1995年)和编码U1、U2和U3 snRNA的基因簇(马特拉，1998). 在所有情况下，这种关联都是由新生转录物介导的(弗雷等。, 1999). 特定的Colocalization一些人的染色体结构域也有报道转录因子。确实，转录因子X连锁a-地中海贫血/精神发育迟缓与端粒周围共同定位异染色质和短臂顶着丝粒染色体(麦克道尔等。, 1999)，而PSE结合转录因子和Oct1转录因子优先与6号染色体上和7号染色体上的一个小区域细胞周期相关方式(蓬博（Pombo）等。, 1998). 它有有人认为，与核仁类似，这些结构域可能会带来特定基因到适当转录和加工因子集中，从而促进基因表达式。
在本文中，我们调查了应激诱导的SNB和染色质结构域，我们确定了三个参与这些细胞核形成的人类染色体身体。此外，我们还表明，应力诱导的SNB与人类第9、12和15号染色体上的异色区域。
材料和方法
单元格行
HeLa细胞在DMEM（西格玛，圣路易斯，密苏里州）中生长，10%胎儿牛血清、50μg/ml庆大霉素和2 mM我-谷氨酰胺。B14-150，中国仓鼠卵巢细胞，仓鼠>人体细胞杂种在RPMI-1640（Sigma）、10%胎牛血清、50μg/ml庆大霉素和2 mM我-谷氨酰胺。仓鼠>人类体细胞杂种列于表中(罗基等。, 1986).通过反向绘制细化了杂种的特征(安冬娜琪等。, 1995). 仓鼠细胞含有单个人类多余染色体单体杂种的拷贝（MCH细胞）如前所述(雷蒙迪et（等）等。, 1991). 我们通过荧光原位杂交进行了验证（FISH）是否存在正确的人类染色体单色体仓鼠>人类细胞杂种（我们未发表结果）。热冲击（42°C下1h，然后在37°C）在补充有40mM HEPES的完全培养基中进行缓冲区（Sigma）。
表1
| 混合的 | 染色体
| 数量身体
|
|---|
| 1 | 2 | 三 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | X（X） | Y（Y） | 0 | 1 | >1 |
|---|
| B14-150型 |
| HY-166T4型 | X（X） | | | | | X（X） | X（X） | | | | | X（X） | | | X（X） | | | | | | X（X） | | | | 19 | 54 | 27 |
| HY-8F6型 | | | X（X） | X（X） | X（X） | X（X） | X（X） | | | X（X） | X（X） | X（X） | | | | X（X） | X（X） | | X（X） | | | X（X） | | | 49 | 23 | 28 |
| YXY-95S型 | | o个 | o个 | | | | | | | | | | o个 | | | | | | | | o个 | | o个 |
| HY-3124E型 | | | | | X（X） | | | X（X） | | | X（X） | X（X） | | X（X） | | | | | | | X（X） | | X（X） | | 14 | 40 | 46 |
| HY-1916年 | | | | | | | | | | X（X） | | X（X） | X（X） | X（X） | X（X） | | | X（X） | | X（X） | | | X（X） | | 23 | 17 | 60 |
| HY-75E1型 | | | | X（X） | X（X） | | | | X（X） | | | X（X） | | | | | | | | | | X（X） | X（X） | | 15 | 26 | 59 |
| GM-10501号 | | | | | | | | X（X） | | | | X（X） | X（X） | X（X） | X（X） | | X（X） | X（X） | | | X（X） | | X（X） | | 25 | 40 | 35 |
| GM-10662A公司 | | | | | | o个 | o个 | o个 | | | | | | o个 | | o个 | | | | | o个 | | o个 |
| GM-10156C公司 | | | | | | | o个 |
| GM-10479A公司 | | | | | | | | | | | | | | o个 |
| 通用-11010A | | | | | | | | | | | | | | | | | | o个 |
| 通用-13140 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | o个 |
| GM-10611A公司 | | | | | | | | | X（X） | | | | | | | | | | | | | | | | 35 | 65 |
| Y-E210TC型 | | | | | | | | | | | | X（X） | | | | | | | | | | | | | 17 | 83 |
| 通用-11418 | | | | | | | | | | | | | | | X（X） | | | | | | | | | | 25 | 75 |
间接免疫荧光
盖玻片上生长的细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS），在4%甲醛中固定7分钟，然后在0.5%Triton X-100中在冰上渗透7分钟。在PBS中以工作浓度稀释初级抗体含5%脱脂牛奶（Difco，Detroit，MI），然后添加到盖玻片。使用的主要抗体是亲和纯化兔抗HAP多克隆抗体(Weighardt公司等。, 1999)、和大鼠抗HSF1单克隆抗体（mAb）10H8（NeoMarkers，Fremont，加利福尼亚州）。在37°C的湿度室中放置1小时后，盖滑倒用PBS清洗三次。使用的二级抗体为罗丹明结合山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫杰克逊免疫研究实验室）和荧光素异硫氰酸盐（FITC）结合山羊抗鼠IgG抗体（Sigma）。次级抗体以最终浓度稀释供应商在PBS中推荐使用5%脱脂牛奶，并添加盖玻片。在37°C的湿度室中放置1小时后，盖滑倒用PBS清洗三次，冲洗，然后装在90%的甘油中共聚焦显微镜使用TCS-NT数字扫描共焦显微镜(莱卡牌手表，Deerfield，IL）配备63X/NA=1,32油浸物镜。我们使用488纳米激光FITC激发线（在500 nm处检测<λFITC公司<540 nm）和543 nm激光线罗丹明荧光（检测波长>590nm）。针孔直径保持在1μm。图像已导出到Adobe Photoshop（加利福尼亚州山景城Adobe Systems）。
电子显微镜分析
HeLa细胞和单色体GM-10611A仓鼠>人细胞含有HSA9的杂交后代立即用胰蛋白酶消化法收获固定在培养基中4%甲醛中（4°C下2小时），以及然后在2%OsO中培养41小时室温。将细胞颗粒包埋在琼脂中（2%H（H）2O） ，用S-rensen缓冲液冲洗数次（pH 7.2），并在乙醇中脱水。最后，细胞被植入在LR白色树脂中，在60°C下聚合24小时将甲醛固定细胞的切片收集在镍网格上用Formvar-carbon薄膜覆盖并用EDTA技术染色(伯恩哈德，1969年). 用EM900电子观察样品配备30微米物镜的显微镜（德国耶拿蔡司）孔径和在80 kV下运行。
Western Blot分析
对制备的总提取物进行Western blot分析来自人类HeLa和仓鼠B14-150和HY-1916细胞前面描述过(蒙特库科等。, 2001)使用亲和纯化抗HAP兔抗体(地磅et（等）等。, 1999)和GTU-88 mAb结合γ-微管蛋白（Sigma）。主要辣根过氧化物酶结合山羊抗体检测抗兔抗体和增强化学发光系统（Amersham，英国白金汉郡）。BenchMark预应变蛋白质阶梯（寿命Technologies，Milano，Italy）用作分子量标记。为了更好地理解分子大小、蛋白质的差异在7.5%SDS-PAGE上进行解析。竞争实验是按所述执行萨姆布鲁克等。(1989)使用表达谷胱甘肽的细菌S公司-转移酶-23用于生产抗HAP抗体的重组抗原(地磅等。, 1999).
鱼类
使用了以下探针：卫星专用pHuR98HSA9上的III DNA亚家族(罗基等。, 1991)；pDMX1，pBR12和pMC15与α-卫星序列杂交X染色体；HSA12；和HSA15(巴尔迪尼等。, 1990;Archidiacono公司等。, 1995). 探针标记有生物素化-16-dUTP（罗氏分子生物化学公司，印第安纳波利斯）根据供应商提供的协议。重新悬浮标记的探针杂交缓冲液（50%甲酰胺，10%硫酸右旋糖酐，1×丹哈特溶液，0.1%十二烷基硫酸钠，40 mM纳2高性能操作4pH 6.8，2×SSC）的最终浓度为5μg/ml，并在70°C持续10分钟。
中期传播的FISH基本上与之前一样进行已报告(雷蒙迪等。, 1996). 对于FISH分析间期热休克HeLa细胞，用PBS和室温下，在4%甲醛中固定15分钟。清洗后在PBS中，在室温下各进行三次15分钟，细胞用0.5%Triton X-100在4°C下渗透7分钟。幻灯片是在PBS中冲洗两次，风干，70%的细胞变性甲酰胺/2×SSC。杂交在42°C温度下进行一夜含有5μg/ml变性探针的20μl杂交缓冲液。在42°C的50%甲酰胺/2×SSC中进行严格清洗，60°C时为0.1×SSC。原位杂交后，清洗细胞在PBS中培养三次，并与抗HAP多克隆抗体和与FITC-结合亲和素DCS（Vector Laboratories，Peterborough，UK）在室温下放置1小时PBS提炼出5%脱脂牛奶。然后在PBS中冲洗细胞，然后与罗丹明结合的抗兔IgG山羊抗体孵育（杰克逊免疫研究实验室）与生物素偶联的抗生物素D抗体（Vector Laboratories），最后与FITC-偶联阿维丁。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚对载玻片进行复染（0.01μg/ml），并安装在含有2%DABCO的PBS中90%的甘油中抗褪色[1,4重氮双环-（2.2.2）辛烷；西格玛]。共焦显微镜采用TCS-NT数字扫描共焦显微镜显微镜(莱卡牌手表).
结果
人类染色体赋予仓鼠细胞形成能力应力诱导核体
应激诱导的SNB只在人类细胞中检测到。事实上，我们在许多非人类细胞系，包括绿猴Cos7和小鼠NIH-3T3细胞（我们未发表的结果），表明特定的人类DNA序列或基因可能参与这些基因的形成身体。我们决定利用这种物种特异性，通过仓鼠>人类体细胞杂种的手段，人类染色体能够指导仓鼠细胞中应力体的组装。为了澄清，以下我们将使用“压力诱导SNB”和“压力“身体”是指分别在人体内可检测到的结构细胞和仓鼠>人类细胞杂种。
我们最初在西部地区测试了兔抗人类HAP抗体地鼠B14-150细胞提取物的印迹分析。如图所示，这些抗体识别单个表观分子量为～110 kDa的蛋白质带，显著小于人类HAP（～150 kDa，917氨基酸）(地磅等。, 1999). 认可度很高因为它被重组谷胱甘肽竞争S公司-转移酶-HAP抗原（图). 尽管我们目前还不知道这种大小差异的原因具有与仓鼠相同电泳迁移率的小条带在HeLa细胞中也可以检测到蛋白质，这增加了它的可能性可能来源于选择性剪接。与人类HAP相似仓鼠蛋白（HAP*）在细胞中有间断分布细胞核中没有核仁（图). 然而，在B14-150仓鼠细胞中，无中度热休克（42°C下1h后1h37°C下的回收率，图)也不是更剧烈的治疗（1小时45°C，我们未公布的结果）导致HAP的招募*给身体施加压力。
仓鼠B14-150细胞的免疫印迹分析带有抗HAP抗体。（左面板）人类HeLa总提取物细胞（H）仓鼠B14-150细胞（B）和仓鼠>人体细胞杂交HY-1916在7.5%SDS-PAGE上进行分馏，并在免疫纯化多克隆抗体导向的Western blotting对抗重组人HAP蛋白(地磅et（等）等。, 1999). HY-1916细胞在（−）和（+）热冲击后。（右面板）为了证明抗体的特异性，B14-150细胞的Western blotting分析也在纯化重组抗原缺失（−）或存在（+）（见“材料和方法”）。同一过滤器与将G.T.U-88 mAb与γ-微管蛋白结合，作为蛋白质负荷的对照。这个抗体-抗原复合物与过氧化物酶偶联抗兔抗体和增强化学发光体系。显示了分子质量标记。
热冲击引起的HAP在仓鼠细胞中的重新分布需要特定的人染色体。人类HeLa细胞、仓鼠B14-150受体细胞和HY-8F6、HY-1916和HY-75E1多染色体仓鼠>人类细胞杂种用甲醛固定，并通过间接分析抗HAP兔多克隆抗体的免疫荧光。这个抗原-抗体复合物与罗丹明结合绵羊抗兔二级抗体。HAP分布由无应力（37°C）和热冲击（42°C）电池。
接下来我们分析了是否可以用仓鼠抗HAP抗体>人体细胞杂交种。我们最初测试了一组八个多染色体细胞杂种总共占人类染色体的总数（表).与热休克HeLa细胞中观察到的核体相似，在42°C下孵育1小时的6个细胞杂种中检测到允许在37°C下恢复1小时。我们得出结论，人类其余两个杂种YXY-95S和GM-10662A中的染色体，即HSA 2、3、6、7、8、13、14、16、21和X无法指挥这些结构的形成（表). 然而，差异，6个阳性杂种之间存在数量和大小的差异压力体，表明一些染色体组与这些结构的形成相适应。特别是HAP*在两个杂交克隆HY-1916中的招募非常有效和HY-75E1，其中大多数单元格（图). 值得注意的是，这两个克隆都没有包含HSA19，其中单个人类HAP基因已被定位(杜邦公司等。, 1997)排除了压力体的形成是由于人类的表达仓鼠细胞中的蛋白质。事实上，蛋白质印迹分析表明在B14-150和YH-1916，不受应力影响（图).
个体人类染色体指导应激体的形成仓鼠细胞内
上一节的分析表明人类染色体组可以赋予仓鼠细胞以下能力形成应力体以应对热冲击。我们接下来进行了调查单染色体是否也能得到同样的结果。
我们观察到，所有表现出应激的杂交种都共享HSA12身体。为了评估这条染色体是否对组装这些结构，我们分析了Y-E210TC细胞包含HSA12的单一拷贝，作为唯一的人类染色体。如图所示在表中，83%的热休克患者可检测到应力体Y-E210TC电池。然而，与观察到的情况相反多染色体仓鼠>人类细胞杂种，单体在Y-E210TC细胞中检测到，表明染色体可能参与HAP*的再分配。要验证这个假设，我们分析了HAP*在许多单色体细胞杂交（表). 未观察到应力体在分别含有HSA7的GM-10156C和GM-10479A细胞中和HSA14，即根据分析排除的两条染色体在上一节中。此外，未观察到HAP*的再分配在含有HSA18和HSA20（GM-11010A和GM-13140）的杂种中而是出现在多染色体仓鼠>人体中得分为阳性的细胞杂种（表). 相反，压力大多数含有单一HSA15拷贝的细胞中都有小体出现或HSA9（表中的GM-11418和GM-10611A)，两条染色体存在于仓鼠>具有多个身体的人类杂种中。尽管GM10501和HY1916细胞中不同数量的应力体（表)含有HSA12和15，似乎表明额外染色体的参与，我们的分析表明至少三条人类染色体（HSA9、12和15）可以单独存在指导HAP*的招募以应对热休克后的身体压力。
仓鼠的应激体>人类细胞杂种与压力诱导的SNB
了解仓鼠的应激体是否>人类杂交种与在人类中观察到的应激诱导的SNBs相当细胞，我们更详细地研究了这些结构的性质。我们初步确定了另一种蛋白质HSF1的分布招募到应激诱导的SNB(乔利等。, 1997;地磅等。, 1999). 如图所示，HSF1分布于亲代B14-150仓鼠细胞前后的核体积热休克。因为HSF1在HAP之前被招募到应激诱导的SNB中(乔利等。, 1999;地磅等。, 1999),这个结果表明仓鼠细胞对整个结构的形成并不仅仅是为了招聘HAP*。仓鼠>人类杂种中HSA9的存在（GM-10611A图)足以指导向压力体招募HSF1和HAP*。相同的结果用含有HSA12或HSA15（我们的未公布的结果），表明这三个结果中的每一个染色体提供了形成这些结构。
人类9号染色体指导HAP的招募和HSF1对仓鼠细胞中应激诱导的SNB。无应力（37°C）和热休克（42°C）受体B14-150仓鼠细胞和单倍体GM-10611A仓鼠>含有HSA 9的人类细胞杂种用抗HSF1 10H8的间接免疫荧光分析单克隆抗体和抗HAP多克隆抗体。HSF1和FITC-偶联山羊抗鼠IgG显示HAP蛋白抗体和罗丹明结合山羊抗兔IgG抗体，分别是。相同GM-10611A细胞染色的共焦激光图像显示了抗HSF1和抗HAP抗体。
人体应力体的超微结构分析细胞和仓鼠>人类细胞杂交。HeLa细胞和GM-10611A仓鼠>人类杂交种在42°C下热休克1小时在37°C下恢复1小时后，用甲醛固定，EDTA染色，电镜分析。应力体的密集“核心”和在两种细胞系中均可检测到染色质周围颗粒。比例尺，0.1微米。
接下来我们分析了GM-10611A中出现的尸体的超微结构含有HSA9的细胞。如图所示，类似于应力诱导HeLa细胞中的SNB(基奥迪等。2000年)，它们包括染色质周围颗粒簇。这些结构也可检测到含有HSA12或HSA15的细胞内杂种，但在亲代B14-150仓鼠细胞（我们未公布的结果）。
因此，我们的分析表明，至少有三种不同的人类染色体可以单独赋予仓鼠细胞以下能力形成具有相同蛋白质组成的核应激体人类细胞中应激诱导SNB的超微结构。
压力诱导的SNB与周着丝粒结合HSA9异染色质
为了更精确地定义与应力体的形成，我们分析了两个包含，分别是HSA9的大部分长臂和p13-cen区域（图中的RH-9L159)或整个短臂和q13-cen区域（图中的RH-9L132)的同一染色体。热休克后，在这两种细胞杂交，从而将参与这一过程的区域映射到两个染色体片段共享的HSA9的p13至q13（我们的未发布的结果）。为了证实这一结论，我们采取了人类超多迷你染色体的优势跨越9p13-q13区域之前在我们的实验室(雷蒙迪等。, 1991). MCH细胞含有作为人类唯一染色体的单个微染色体(雷蒙迪等。, 1996)因此受到了挑战热冲击后形成应力体。如图所示，间接免疫荧光分析表明，应激体确实，在MCH细胞中可检测到。
HSA9的象形字。不同的染色体GM-10611A、RH-9L132、RH-9L259和MCH中存在的碎片仓鼠>人类细胞杂种。在图的右侧显示了MCH细胞的共焦激光显微镜图像无应力（37°C）或热休克（42°C），用抗HAP染色抗体和罗丹明结合山羊抗兔IgG抗体。
HSA9这一部分的一个显著特征是存在形成近着丝粒q12带的扩展异色区由不同类型的卫星DNA阵列组成(菲内利等。, 1996). 因为卫星DNA是进化中的不同序列，我们假设它们可以对应形成所需的缺失遗传元素仓鼠细胞中的应激体。此外，考虑到异色区域被认为是转录沉默的事实应激诱导的SNB与转录(基奥迪等。2000年)，我们推断着丝粒周围异色区可以作为组装这些结构。为了验证这一假设，我们研究了HSA9的q12频带（7–8 Mb）相对于应激诱导的SNBs。HeLa细胞受到热休克并与指向卫星III DNA亚家族的生物素化pHuR98探针对HSA9的异色区具有特异性(罗基et（等）等。, 1991). 在有丝分裂染色体扩散中，这个探针正如预期的那样，HSA9的着丝粒周围区域被特别修饰(罗基等。, 1991)和大多数细胞（87%）包含该染色体的两个或三个拷贝（未显示）。细胞与抗HAP抗体共染色，并通过共聚焦显微镜进行分析激光显微镜（见“材料和方法”）。在大多数单元格（表中得分为阳性)，于与应力体共定位的至少一个杂交信号，以及通过连续光学部分延伸的共定域（图). 在剩余的单元格中杂交信号既没有嵌入也没有靠近应力因此，这些细胞被评为阴性（表).方格检验表明HSA9和压力诱导的SNB在零50%关联的假设。作为对照，我们研究了HAP小体与X染色体着丝粒区的关系基于表中数据的染色体，似乎没有参与这些机构的形成。如图所示，大多数用pDMX1探针获得的杂交信号，针对X染色体特异性α卫星(Archidiacono公司等。, 1995)，不与应激诱导的SNB共存。表中数据的显著卡方检验，相同如上所述的零假设，证实了共定位的缺失在X染色体和应激体之间。
表2
| 染色体 | 探查 | 与的关联应激诱导的SNB（细胞百分比）
|
|---|
| + | − | n个 |
|---|
| 9 | 坐三 | 75一 | 25 | 279 |
| 12 | 坐α | 70b条 | 30 | 64 |
| 15 | 坐α | 80c（c） | 20 | 58 |
| X（X） | 坐α | 24d日 | 76 | 96 |
应力诱导SNB与HSA9的着丝粒周围异染色质和HSA12和15。HeLa细胞在42°C下热休克1 h在37°C下恢复1小时。固定后甲醛，细胞与生物素化探针杂交HSA9的卫星III DNA和X染色体上的α-卫星序列，HSA12和HSA15（见“材料和方法”）。细胞是与抗HAP多克隆抗体联合检测应激诱导的苏格兰国家银行。HAP和生物素化探针的分布是通过与罗丹明结合的间接免疫荧光显示山羊抗兔抗体和FITC-结合亲和素（参见“材料和方法”）。激光共焦扫描显微镜拍摄杂交细胞的图像以揭示HAP的分布（红色）和生物素化探针（绿色）。图像已合并到检测卫星DNA序列和压力之间的共定位身体。左边是四张共焦激光显微镜图像相同的连续光学截面（I–IV，深度0.5μm）细胞杂交到识别近着丝粒的探针（pHuR98）HSA9的异染色质。在右边，细胞杂交的图像HSA12、HSA15和X染色体α卫星特异探针。
因此，将X染色体获得的结果视为染色体结构域之间随机关联的参考值和应力诱导SNBs，一个基于对比HSA9和X染色体获得的数据证实了这一结论HSA9和应力诱导体之间的特定关联（单尾叉方[1]=78.597；P（P）≪ 0.0001).
应力诱导SNB与HSA12和HSA15
上一节的结果表明，尽管具有统计学意义的是，着丝粒周围HSA9和应力诱导SNB的区域不完整。的确，HSA9未能在25%的细胞中与应激诱导的SNB共定位（参见表)好像这条染色体并不总是参与这些结构的形成。另外两个证据支持这一点解释。首先，即使在得分为阳性的细胞中，我们也很少观察到所有杂交信号与应力的共定位身体。其次，压力体的数量通常超过HSA9同源物。事实上，大多数细胞都含有两到三份HSA9，而应力体的数量在1到7之间，细胞两具、三具、四具和五具尸体的情况大致相同频率（～17%）。我们想知道额外的染色体能够指导仓鼠细胞中应激体的形成，即HSA12和15可与HeLa细胞中应激诱导的SNB共定位。根据HSA9的结果，我们假设这两条染色体的着丝粒异染色质可能含有这些结构集合的招聘中心，可以与压力体共存。因此，HeLa细胞被杂交分别含有α-卫星DNA的pBR12或pMC15HSA12和15上独有的序列(巴尔迪尼et（等）等。, 1990;Archidiacono公司等。, 1995). 分析有丝分裂扩散显示大多数细胞有两到三个拷贝HSA12和15（分别为78%和83%，我们的未出版结果）。指数增长的HeLa细胞受到热休克，与两个探针中的任何一个杂交，然后用抗HAP抗体。如图所示，两个着丝粒区域与应激诱导的SNB共定位，且关联性为统计显著（表). 然而，与用HSA9观察，每个染色体与应力诱导SNB（见图). 这种现象尤其明显在含有三个以上小体的细胞中明显可见。
为了使我们的分析更加定量，我们计算了每一个染色体（HAS9、12、15和X）杂交信号的数量与应激诱导的SNB共定位。我们考虑了两组细胞：含有一个或两个应力诱导SNB的细胞（图A） 以及其中两个以上尸体是可以检测到的（图B） ●●●●。如图所示，大多数用X染色体特异探针获得的信号没有与应激诱导的SNB共存，无论其在单元格。HSA 9、12和而与应激诱导的SNB相关。然而，作为如图所示A、 在最多包含两个应力诱导的细胞中SNB，通常每个染色体只有一个同源物与压力机构，意味着这两个机构的招聘中心位于不同的染色体上（例如HSA9和HSA15）。虽然这两个染色体同源物的这种不对称行为是在具有两个以上应力体的单元中标记较少（图B） ，它在HSA9的案例中仍然很明显。该结果表明两种同源物染色质结构的差异，至少对于什么与应力诱导SNB的成核位置有关。在结论，该分析表明人类染色体的一个子集，包括HSA9、12和15，包括应力诱导SNB的形成。
共定位的定量分析在特定染色体和应激诱导的SNB之间。热曲棍球赫拉细胞与生物素化探针进行独立杂交HSA9（pHuR98）、HSA12（pBR12）、HSA15（pMC15）的异色区，和X染色体（pDMX1）。用抗HAP多克隆抗体对细胞进行联合染色检测应激诱导SNB的抗体。HAP和通过间接免疫荧光法发现了生物素化探针的与罗丹明结合的山羊抗兔抗体和FITC-结合亲和素。共聚焦激光显微镜图像，对于每条染色体，我们计算杂交信号的数量与压力体共存。（A） 使用一个或两个应力诱导SNB。我们分析了68个细胞（其中25个具有单体）染色用于HSA9，17个细胞染色用于HSA12、HSA15染色的15个细胞（7个为一体）和16个细胞（6个为一体染色体X染色（B）两个以上的细胞应力诱导SNB的分析与A中相同。我们分析了211个细胞HSA9、HSA12的47个细胞、HSA15的43个细胞和80个细胞X染色体。▪、，HSA9.▴、HSA12.●、HSA15.○和虚线，X染色体。
讨论
在本文中，我们利用了物种特异性应激诱导的单核苷酸多态性，以识别人类染色体热休克仓鼠细胞中应力体的形成。通过方式多染色体和单染色体仓鼠>人体细胞杂种，我们已经鉴定出三条人类染色体，HSA9、12和15，单独赋予受体仓鼠细胞形成压力体。我们的分析证实了以下结论：具有人类细胞中所描述的应激诱导SNB的相同特征(地磅等。, 1999;基奥迪等。2000年;德内格里等。, 2001). 事实上，类似于压力诱导SNB是hnRNP HAP和HSF1的聚集位点因素。此外，它们通常与核仁和由高度堆积的核糖核蛋白簇组成复合物，染色质周围颗粒。
特定的染色体结构域参与压力诱导的SNB
可以提出两个替代假设来解释事实上，至少有三条人类染色体可以单独帮助仓鼠>人类细胞杂种中应激体的形成。根据一种假设是，啮齿动物细胞无法形成应激体，因为它们缺乏由基因编码的特异性反作用因子在不同的人类染色体上。有几个考虑因素反对这种可能性。最令人信服的论点是，这两者在人类身上在仓鼠>人类细胞杂种中，应激体的数量为与染色体数目有关(乔利等。, 1997，以及本文）。此外，鉴于高度进化哺乳动物编码基因组的保护，似乎不太可能存在于至少三条不同人类染色体上的基因参与了几个RNA加工因子的再分配仓鼠细胞中的对应物。由于这些考虑，我们支持HSA9、12、，和15将为应力诱导SNB。这种可能性与以下事实一致：，如本文所示HSA9和HSA12和15的着丝粒区域与HeLa细胞中的应力诱导SNB（图). 此外，在这种情况下对于HSA9，我们已经证明了近着丝粒异色性q12带（7–10 Mb）是染色体最短部分的一部分（p13-q13；20–25 Mb）能够指导应力体的形成仓鼠细胞（图).
存在分布在不同地区的多个招聘中心染色体可以解释在HeLa细胞中应激诱导的SNBs的数量通常超过单个染色体。我们的分析表明，数字和身份作为招募中心激活的染色体结构域在细胞。尽管指导此选择的参数仍然是发现，在细胞周期中，当细胞受到压力时压力处理的持续时间和强度一个角色。
HSA9的q12异色带是最大的人类基因组的未排序部分(联合体，2001年). 它是然而，已知它由tandemly重复的数组组成卫星DNA，包括α、β和卫星III(菲内利et（等）等。, 1996). 类似的异色区域出现在HSA上靠近NOR的顶着丝粒染色体（如HSA15）1，在Y染色体上(菲内利等。, 1996)，全部已经证明与核仁有关(曼努埃利迪斯和Borden，1988年;沙利文等。, 2001). 不是所有的与核仁相关的染色体能够指导形成应力诱导SNB，事实上，类似结构在仓鼠>人类单色体细胞杂种中检测不到肢端着丝粒HSA14。然而，HSA9的行为表明招聘中心的活动与染色体的核位置。事实上，与所发生的情况相反对于HSA15和12，只有一个HSA9同源物优先与应力诱导的SNB（图). 有趣的是，我们观察到与应力体相关的同源物通常位于核仁，而另一个核仁的位置更可变。这个两个HSA9同源物的不同分布，一个总是在核仁上分隔开，第二个相邻核仁或核膜附近，已经已报告(曼努埃尔迪斯和波登，1988年). 投机很诱人两个HSA9同源物以不同的染色质构象存在，其中之一优先与应激诱导的SNB相关。
组成着丝粒异染色质的特征是独特的高阶染色质结构(吉尔伯特和艾伦，2001年)由于大量的坦德姆利火山的存在甲基化卫星DNA(伯德，1992年;费斯坦斯坦等。,1999). 最近的研究已经确定了一些蛋白质招募到细胞核的异色结构域。其中，最具特征的是异染色质蛋白1（HP1），最初确定于果蝇属并保存在从裂变酵母到人类的进化(琼斯等。2000年).HP1被视为参与装配的结构适配器染色质中的大分子复合物。有人建议HP1在将着丝粒周围异染色质靶向特异性核隔间。事实上，作为对抑制剂治疗的反应组蛋白去乙酰化酶，着丝粒周围异色区丢失它们与HP1蛋白的结合并特异性地向核外围(塔代伊等。, 2001). 组蛋白脱乙酰化和甲基化对HP1的结合很重要异染色质。有趣的是，乙酰化组蛋白H4被发现仅在DNA时期异染色质区域短暂富集中S阶段的复制(塔代伊等。, 1999)然后是从染色质的活性中去乙酰化甲基结合蛋白(朗特里等。2000年). 这个S中期乙酰化组蛋白的存在可能与应激诱导的SNB的形成，可以解释我们的观察结果组装这些结构所需的间隔为S中期比细胞周期的其他时刻短(Weighardt公司等。, 1999). 我们推测DNA复制，通过干扰染色质结构，可以提供第一步为后续工作建立适当的配置应力诱导SNB的组装。
众所周知，热休克和其他应激疗法效果显著影响核结构和蛋白质的分布，例如核仁蛋白(Daniely和Borowiec，2000年;王等。, 2001),通常存在于特定的核隔间中。这是可以想象的，因此，压力治疗也可能引发复杂的异色纤维的重排，产生位移一些因素和其他因素的约束，包括HSF1。HSF1可能是第一批被招募到应激体的蛋白质之一。然而，它的压力体中的存在似乎不足以HAP和可能的其他RNA加工因子的招募渗透胁迫可以诱导HSF1招募(乔利等。, 1999)但不是HAP（我们的未发布的结果）。我们认为一些独特的，仍然未知的需要HSA9、12和15的异色区域的特征用于向应激诱导的SNB招募RNA加工因子。事实上，特定异色区域的招募作用核因子子集中心已经提出。对于例如，在许多人类细胞系中，Polycomb组（PcG）复合物形成了独特的离散结构，称为PcG体。这些身体与大的着丝粒周围紧密相连1号染色体上的异染色质区域（1q12）(绍林et（等）等。, 1998)并且可能表示存储域，其中多余的PcG蛋白被储存起来，直到细胞需要。最近建议，与PcG体类似，应激诱导的SNB将是仓库针对HSF1和许多RNA加工因子(乔利et（等）等。, 1999;基奥迪等。2000年).
另一方面，应激诱导的SNB似乎来源于预先存在的SNB，可能对应于抄本沿着它们通往核膜的路径(陈等。, 1999). 热休克，通过改变转录物，将诱导应激诱导SNB的出现。虽然SNB和应激诱导的功能澄清SNB仍值得进一步调查，可以想象核糖核蛋白复合物向这些核结构域的募集可以对正确处理成绩单很重要。在这个透视图，我们发现特定的异色区域可以发挥作用在应激诱导SNB组织中的作用揭示了一个先前的低估异染色质在细胞核组织中的作用隔间和底层功能。
致谢
我们感谢帕维亚大学的Centro Grandi Strumenti共焦显微镜设备。这项工作得到了拨款的支持意大利联合会（Associaziona Italiana per la Ricerca sul Cancro）（致G.B.）由爱尔兰理工大学部长授予e Technologica-Consiglio Nazionale delle Ricerche“生物分子”根据L.95/95，以及Progetto的拨款，向umana致敬Strategico Tecnologie di base della postgenomica（转至F.C.）。医学博士由国家咨询委员会（Consiglio Nazionale delle Ricerche）提供支持。这个作者感谢A.Lisa和G.Zei的统计分析和D。技术援助竞技场。
脚注
DOI:10.1091/mbc.01–12–0569。
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