氨酰-tRNA合成酶催化蛋白质合成的第一步，包括tRNAs的氨酰化。最近，我们证明了一种tRNA合成酶-人酪氨酸-tRNA合成酶（TyrRS）-具有新的细胞因子功能及其在蛋白质合成中的作用(1). 这个演示建立了蛋白质合成和信号之间的联系转导。在培养的凋亡条件下，分泌全长TyrRS，然后可以分泌两种不同的细胞因子由细胞外蛋白酶产生，如白细胞弹性蛋白酶(1).而全长酶在多种细胞因子活性，隔离的细胞因子由将天然酶分解成NH2-终端催化片段（称为迷你TyrRS）和一个额外的COOH结构域附加到酶的催化核心（图。). 人类TyrRS的额外COOH结构域具有与成熟人内皮细胞类似的细胞因子活性单核细胞激活多肽II。另一方面，人类迷你TyrRS与CXC-趋化因子受体CXCR1和IL-8紧密结合，作为多形核白细胞（PMN）的化学引诱剂(1).
用于本研究。全长TyrRS和TrpRS的阴影区域表示COOH-和NH2-终端附加域。左侧和右侧的数字对应NH2-以及与人类全长酶相关的COOH末端残基，分别是。TyrRS的COOH域与成熟内皮细胞激活肽II(45). 这个全日空航空公司2TrpRS域与额外的人类GluProRS的结构域（谷胱甘肽和脯氨酸-tRNA的融合合成酶）、MetRS、GlyRS和HisRS(8，10——15).
色氨酸-tRNA合成酶（TrpRS）的催化核心域是TyrRS催化结构域的密切同源性(2——4). 如所示图。，哺乳动物TrpRS具有NH2-终端低等真核或原核TrpRS缺失的延伸(5——7). NH2-终端扩展包含与酵母相比增加了58–78个氨基酸(酵母菌属酿酒)或真细菌TrpRS(热球菌属阿比西半岛)分别是。残留物12-65全日空航空公司2-人类TrpRS的末端延伸是与小麦蛋白-TRP保守结构域蛋白家族同源（pfam00458）(8). 该域具有螺旋-转螺旋结构(9)而且也是甘氨酸、组氨酸和蛋氨酸(10——13). 将此域的三个重复插入融合谷氨酰-脯氨酸-tRNA合成酶的连接区(9，14，15).有趣的是，在组氨酸tRNA合成酶中，这个结构域是主要的肌炎患者自身抗体的抗原表位(13).
在正常细胞中，人类TrpRS以两种形式存在；主要形式是全长蛋白质，另一个是一个截断的TrpRS（mini-TrpRS）哪些是额外的NH2-终端域是由于前mRNA的选择性剪接而删除(16，17)，使用Met-48被推断为NH2-终端残渣小型TrpRS(16). 人类mini-TrpRS的高表达通过添加IFN-γ在人体细胞中刺激(18). 刺激IFN-γ还诱导产生血管抑制性趋化因子IP-10和MIG(19，20)并减弱血管生成性趋化因子的表达白介素-8(21). 牛全长和截断TrpRS，其中额外的全日空航空公司2-蛋白质水解删除末端结构域(5)，在胰腺中高度表达并分泌到胰液(22，23). 各种截断形式的存在性TrpRS以及哺乳动物TyrRS和哺乳动物TrpRS提出了截断的TrpRS具有除氨酰化外的功能(5，24). 我们假设哺乳动物TrpRS可能具有特定的信号转导活性血管生成。
材料和方法
蛋白质生产和生化分析。
包括COOH末端的人全长和截短的TrpRS基因将6个组氨酸标签克隆到质粒pET20b中，并在大肠杆菌菌株BL 21（DE3）（Novagen）诱导用1 mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷4 h。全长人TrpRS编码残基1–471，mini-TrpRS残留物48–471、T1-TrpRS残留物74–471和T2-TrpRS残留94–471.本研究中使用的蛋白质示意图如下如图所示。.使用制造商描述的程序，蛋白质在镍亲和柱上纯化树脂（Novagen）或Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，Chatsworth，CA）]裂解细胞的上清液。蛋白质中的内毒素被去除使用Triton X-114进行相分离的解决方案(25)并且是a测定为<0.01内毒素单位/ml鲎属成釉细胞裂解物凝胶凝块试验（E-Toxate，Sigma）。蛋白质浓度通过BSA Bradford分析测定（Sigma）作为标准（Bio-Read）。所有截断的TrpRS变体，除了T2-TrpRS在色氨酸依赖性焦磷酸盐-ATP中起作用交易所(26，27).
人类全长TrpRS的PMN弹性蛋白酶裂解在蛋白酶：37°C下PBS（pH 7.4）中1:3000的蛋白质比例。劈开通过SDS/12.5%PAGE和Western blot分析对产品进行评估用anti-His6-标签抗体（Invitrogen）。埃德曼对PMN弹性蛋白酶裂解产物进行降解，以确定其NH2-终端序列，使用蛋白质和核酸核心的ABI 494型测序器斯克里普斯研究所设施。
体外试验人脐静脉内皮细胞（HUVEC）化验。
HUVEC从Clonetics（圣地亚哥）获得并保存在EGM-2中BulletKit培养基（Clonetics），5%的空气一氧化碳2根据供应商的说明。人血管内皮生长因子-165（VEGF165)（生物资源国际、加州卡马里洛）和人类IP-10（研发系统）在几个实验中使用。
使用改良的Boyden进行HUVEC迁移测定小室（48孔小室）（NeuroProbe，Cabin John，医学博士）聚碳酸酯膜（8.0μm孔径）（Costar）如下(28，29). 这些微孔涂有25μg/ml的人纤维连接蛋白（Biosource International）在PBS中隔夜晾干。HUVEC悬浮在含有0.1%BSA的DMEM（GIBCO/BRL）中（Sigma）并以2×105每个孔的细胞数。趋化刺激，血管内皮生长因子165（0.5 nM），放置在下部培养箱中，细胞在37°C的温度下迁移6小时5%一氧化碳2孵化器。对于抑制分析，在放置前30分钟，上下腔室以及HUVEC在试验箱中。孵育后，非迁移细胞从用棉签擦拭膜的上表面。迁移细胞（那些固定在甲醇中，并用血色染色仪（EM Diagnostic Systems，Gibbstown，NJ）。在高功率场中对迁移细胞进行计数。
使用CellTiter 96水溶液进行HUVEC增殖试验一个溶液细胞增殖检测试剂盒（Promega）。组织培养处理板（96周）（康宁）涂有0.1%明胶（Sigma）过夜。HUVEC的播种密度为5×10三DMEM中每孔的细胞数（GIBCO/BRL）含有热灭活FBS（10%，Sigma）、青霉素（100单位/ml，西格玛）和链霉素（100μg/ml，西格玛）第0天涂胶板。第二天，对细胞进行处理增殖刺激（VEGF165，2 nM）。培养72小时后，HUVEC的增殖程度为根据套件提供的方法进行测量。抑制通过添加抑制剂（全长TrpRS或添加增殖刺激。抑制试验以百分比表示VEGF的净增殖（2 nM）。
在体内血管生成分析。
三种不同的血管生成检测方法用于检测TrpRS活动体内(30——34). 鸡绒毛尿囊按说明进行膜（CAM）分析(35，36)10天从麦金太尔家禽（加利福尼亚州湖滨）获得的鸡胚。可的松用20μl的血管内皮生长因子165PBS中的（1 pmol）被放置在凸轮轴。抑制剂和对照样品[PBS单独，IP-10（120 pmol），添加了mini-TrpRS（60 pmol）或全长TrpRS连续3天局部涂抹在滤盘上。72小时后，采集与滤盘相关的CAM组织在奥林巴斯模型SZH10上以10倍放大率拍摄立体显微镜。通过分析数字量化血管生成每个椎间盘区域内的分支血管。
按照以下修改(34). 皮下植入患有哮喘的wehi小鼠含400μl生长因子缺失基质凝胶（Becton Dickinson）含有8 pmol的VEGF。腹腔注射mini-TrpRS（1nmol）或全长TrpRS（1 nmol）在第2、3和4.第5天，向小鼠静脉注射荧光标记内皮结合凝集素Griffonia（Bandeiraea）单叶菊I、isolectin B4（载体实验室）和基质凝胶栓塞被切除。采集了分段插头的荧光图像使用荧光奥林巴斯模型SZH10共焦立体显微镜。这个用分光光度法定量每个插头的荧光素含量研磨RIPA缓冲液（10 mM钠）中的塞子后进行分析磷酸盐，pH 7.4/150 mM氯化钠/1%Nonide P-40/0.5%脱氧胆酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠）。
通过以下方法进行小鼠视网膜血管生成测定方法。出生后（P0），视网膜血管系统实际上是老鼠不在。出生后2周（P14），视网膜获得与发病相符的成人视网膜血管模式视觉效果。视网膜的生理血管化发生在这一时期通过一种典型的双相发展模式血管生成。最初，辐条状乳头周围血管呈放射状生长从视网膜中央动脉和静脉由它们之间形成的毛细血管丛相互连接。这个视网膜浅血管层（初级层）在区域内生长，体积和复杂性，离心作用下，如神经内的单层纤维层在出生后的前9天。第二阶段视网膜血管形成开始于出生后第8天（P8）和第10天（P10），当侧支从浅丛并穿透视网膜分支并横向吻合以形成平面深血管层（第二层），由P12–P14就位。定性评估化合物对血管生成的影响可以通过简单的拍摄第一层和第二层并确定深层完全形成的眼睛百分比或部分抑制（完整信息请参见随附文章此模型的描述）。
迷你TrpRS（0.5μl中5 pmol）或全长TrpRSμl）在出生后一天通过玻璃体内注射到新生小鼠体内7或8，在P12或P13采集视网膜。血管通过用兔抗小鼠染色视网膜来观察IV型胶原抗体（Chemicon，封闭缓冲液中1:200稀释：10%山羊血清/PBS中的3%BSA）在4°C下放置18小时。Alexa Fluor公司594-结合山羊抗兔IgG抗体（分子探针，1:200在封闭缓冲液中稀释）与视网膜孵育2小时温度为4°C。根据注射蛋白质对视网膜深（继发）血管形成的影响层，并与玻璃体内注射0.5μl PBS进行比较。无本研究中使用的蛋白质对初级层。
结果
用信号转导技术鉴定TrpRS片段活动。
Mini-TrpRS是TrpRS的截断版本，缺少47个全日空航空公司2-终端残留物，由选择性剪接（IFN-γ诱导）(18). 单独，既不是TrpRS也不是mini-TrpRS诱导HUVEC迁移。然而，当细胞用VEGF诱导165并用mini-TrpRS治疗，迁移被抑制（图。一个). 相反，全长TrpRS对VEGF无影响165-刺激HUVEC趋化性。诱导HUVEC增殖血管内皮生长因子165也被mini-TrpRS抑制，而全长TrpRS没有影响（图。B类).
人类TrpRS在HUVEC上构建的活动。(一个)人类TrpRS构建物抑制HUVEC迁移。平均数量每个高功率场的细胞迁移对刺激的响应细胞培养基，血管内皮生长因子（0.5 nM），血管内皮细胞生长因子（0.5nM）+全长TrpRS（500 nM），血管内皮生长因子（0.5 nM）+小TrpRS（500 nM）。(B类)抑制人TrpRS构建的内皮细胞增殖。人TrpRS在HUVEC细胞上检测（2μM）血管内皮生长因子165（2 nM）。单元格增殖以净增长率表示血管内皮生长因子165-诱导（2 nM）增殖。值表示五个实验的平均值±标准偏差。
在牛胰腺中，TrpRS片段存在于胰腺中分泌物(22，23)，提高了蛋白水解形成TrpRS除了可选的拼接变体外，可能还具有生物活性。因为PMN弹性蛋白酶可以释放活性细胞因子mini-TyrRS与内皮细胞激活全长TyrRS中多肽II样COOH结构域(1)，我们检测了全长TrpRS的PMN弹性蛋白酶裂解。重组全长TrpRS的PMN弹性蛋白酶消化（54 kDa）产生两个片段：指定的47和44 kDa片段分别为T1-TrpRS和T2-TrpRS。这些碎片在尺寸至最小TrpRS（49 kDa）（图。).测序表明NH2终点为SNHGP和SAKGI，证明碎片始于Ser-71和Ser-94，分别是。用针对COOH终端His6-重组体标签蛋白质表明这两个片段都有伊斯6-在COOH码头贴上标签。因此，只有NH2TrpRS末端被移除。要检查弹性蛋白酶裂解产物T1-TrpRS的活性最接近我们制备了重组蛋白并进行了测试在HUVEC迁移和细胞增殖试验中。T1-TrpRS堵塞血管内皮生长因子165-诱导HUVEC趋化性并抑制血管内皮生长因子165-诱导的HUVEC增殖（数据不显示）。
人TrpRS的蛋白水解裂解使用1:3000。解理在37°C的PBS（pH 7.4）中进行，时间为0分钟（车道1）、15分钟（车道2）、30分钟（车道3）或60分钟（车道4）。样品在SDS/12.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。分子的左边是尺寸标记（单位为千道尔顿）。
CAM分析中TrpRS片段的血管抑制活性。
进行鸡CAM分析以测试TrpRS.血管内皮生长因子165-CAMs中诱导的血管生成是被mini-TrpRS或T1-TrpRS明显抑制（图。)而人类全长TrpRS无明显的血管抑制活性（数据未显示）。作为控制血管抑制性CXC-趋化因子IP-10用于抑制血管生成VEGF刺激165。它导致了类似的抑制血管生成，mini-TrpRS和T1-TrpRS也是如此。
鸡绒毛尿囊膜检测中人TrpRS的活性。数据表示为血管分支的平均数每个样本中5-8个胚胎的±标准偏差。(一个)人类TrpRS片段的血管抑制活性。PBS、，血管内皮生长因子165（1 pmol），血管内皮生长因子165（1 pmol）+IP10（120pmol）、VEGF165（1 pmol）+全长TrpRS（60 pmol），血管内皮生长因子165（1 pmol）+迷你TrpRS（60 pmol），或血管内皮生长因子165（1 pmol）+T1-TrpRS（60 pmol）。血管内皮生长因子165在第0天添加；连续三次添加IP10和TrpRS从第1天开始的天数。(B类)的数字图像显示血管生成的代表性滤盘（CAM测定）VEGF刺激165并被mini-TrpRS抑制。
小鼠基质塞试验。
为了将这些研究扩展到哺乳动物系统，TrpRS的活性在小鼠基质凝胶塞试验中进行了检测(34). 静脉注射时，含有血管生成刺激物的基质凝胶形成一个栓塞血管可以迁移。介绍血管内皮生长因子165进入matrigel塞诱导血管生成（图。).血管内皮生长因子165-诱导的血管生成被静脉注射阻断。注射mini-TrpRS（图。). 类似的血管生成抑制当mini-TrpRS被直接纳入基质凝胶塞中时出现就像用静脉注射的时候一样。在上未发现任何影响注入全长TrpRS（数据未显示）。
血管生成小鼠基质凝胶模型中人类TrpRS的活性。将400μl生长液注入患有哮喘的wehi小鼠皮下含有血管生成刺激物的因子缺失基质凝胶。第2天腹腔注射mini-TrpRS，3和4。第5天，给小鼠静脉注射荧光标记内皮结合凝集素Griffonia（Bandeiraea）单叶菊I，isolectin B4。塞子被切除并溶解，用分光光度法测定荧光素含量。(一个)切除基质凝胶的相对荧光素含量用培养基VEGF处理的塞子165（8 pmol），血管内皮生长因子（8 pmole）+i.p.注射mini-TrpRS（1 nmol）、VEGF165（8百万摩尔）+mini-TrpRS（1 nmol，包括在基质凝胶中）。(B类)共聚焦显微镜下切除基质凝胶栓的荧光图像显微镜检查。VEGF对血管生成的刺激作用165和抑制VEGF165-mini刺激血管生成TrpRS。在没有VEGF的情况下，图像与右边。
抑制小鼠视网膜血管化。
因为TrpRS能有效抑制VEGF165-诱发的CAMs和小鼠基质凝胶分析中的血管生成，这是令人感兴趣的检测TrpRS对内源性小鼠视网膜的血管生成(37).小TrpRS在新生血管形成过程中的玻璃体内应用血管生成抑制深部新生血管的形成（次生）血管层对之前没有任何不利影响浅（初级）血管层中形成的血管（图。). 完全抑制次级在8.2%中观察到分层(n个=73）PBS处理眼（数据未显示），11.0%的全长TrpRS治疗眼(n个=18），以及28%的小TrpRS治疗眼(n个= 75). 全长TrpRS的作用类似与PBS对照注射相比，无显著差异出现抑制。
TrpRS片段抑制出生后小鼠的血管生成视网膜模型。表层（初级）和玻璃体腔注射后视网膜深层（第二层）血管的观察微量TrpRS注射(上部)或全长TrpRS(下部). 出生后第8天，眼睛接受了玻璃体内注射PBS、人全长TrpRS（5 pmol），或mini-TrpRS（5 pmol）和视网膜在出生后第12天或13.用抗胶原蛋白IV染色后，血管可见抗体。视网膜血管形成的定性图像分析在P8和P12之间，在28%的眼睛用迷你TrpRS治疗。全长TrpRS没有效果第二层的形成。请注意，主层是不受迷你型或全长TrpRS的影响。
讨论
TrpRS的天然小TrpRS片段具有抑制活性在几个不同且不相关的分析中，包括HUVEC迁移和增殖、鸡胚绒毛尿囊膜、小鼠基质凝胶和小鼠视网膜血管生成测定。全长蛋白是无活性的，因此表明选择性剪接或解理对于激活血管抑制活性。全长蛋白质是非活性与TrpRS的血管抑制活性一致碎片是特定生物机制的一部分，而不是与TrpRS相关的副现象就其本身而言.
尽管mini没有进行剂量-反应研究TrpRS，随附的文章描述了此类调查较小的T2-TrpRS(参见上文). 例如，T2-TrpRS是在剂量反应滴定中显示为血管生成抑制剂活性在0.1至10 nM范围内（直接在小鼠中使用T2-TrpRS基质凝胶塞）(37). 有趣的是，即使是静脉注射。注射，迷你TrpRS可以阻止血管内皮生长因子165-刺激血管发育鼠标（图。). 该观察结果表明，游离mini-TrpRS是足够稳定体内作为血管抑制因子在其生产地的远端。尽管知之甚少关于TrpRS的分泌，先前的结果显示细胞凋亡过程中培养细胞的TyrRS(1)、和初步研究表明，在类似条件下（K.W。，未发表的意见）。总的来说，这些结果表明用于天然系统的血管生成途径中的TrpRS。进一步验证这种作用需要鉴定相关的内皮细胞受体。
在一些细胞系中，血管抑制性小TrpRS高度表达在抗肿瘤IFN-γ的存在下表达(18，38——41),其中，可以通过选择性拼接前信使核糖核酸(16，17). 如上所述，IFN-γ的刺激也诱导生成血管抑制性趋化因子。拆卸全日空航空公司2-人TrpRS末端结构域的前mRNA研究选择性剪接或通过PMN弹性蛋白酶裂解产生血管抑制TrpRS的版本。最近，PMN弹性蛋白酶被证明存在于人类结直肠癌在肿瘤-宿主界面(42). 还有乳腺癌和非小细胞肺癌已知细胞分泌PMN弹性蛋白酶在体外(43，44).可能，凋亡细胞分泌的人类TrpRS可能是在肿瘤-宿主界面被PMN弹性蛋白酶裂解。被劈开的酶可以作为一种血管抑制因子来减弱肿瘤入侵。
