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基因发育。2005年7月1日；19(13): 1581–1595.
数字对象标识：10.1101/gad.1286905
预防性维修识别码：项目经理1172064
PMID：15998811

mSin3A辅阻遏物调节调节正常和肿瘤生长和生存的多种转录网络

简·赫曼·丹纳伯格,1,4 格雷戈里·戴维,1,三，4 盛中,2 杰科·范德托雷,1 王永雄,2和罗纳德·德皮尼奥1,5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

mSin3A是一种具有相关组蛋白脱乙酰酶（HDAC）酶活性的大型多蛋白共抑制复合物的核心成分。mSin3A与许多序列特异性转录因子的物理相互作用将mSinAA-辅阻遏物复合物与多种信号通路和相关生物过程的调节联系在一起。为了剖析mSin3A作用的复杂性，我们监测了条件mSin5A缺失对发育、细胞生物学和转录水平的影响。mSin3A在早期胚胎发育、原代细胞、永生化细胞和转化细胞的增殖和存活中发挥着重要作用。遗传和生化分析确定了mSin3A/HDAC在p53脱乙酰化和活化中的作用，尽管p53的基因缺失不足以减弱mSin3A无效细胞致死表型。与mSin3A除了调节p53通路之外的广泛生物活性一致，mSin3A-缺失后的时间进程基因表达谱显示，参与细胞周期调节、DNA复制、DNA修复、凋亡、染色质修饰和线粒体代谢的基因被解除调控。使用基于知识的数据库对mSin3A转录组进行计算分析，发现mSin5A影响基因表达的几个节点，包括Myc-Mad、E2F和p53转录网络。进一步验证这些节点来自于显示Myc-Mad、E2F和p53富集的硅启动子分析顺式-mSin3A缺失后上调基因调控区的调控元件。值得注意的是，在硅启动子分析中也揭示了特定的顺式-结合转录激活物Stat和ISWI ATP依赖性核小体重塑因子Falz的调控元件，从而进一步扩展mSin3A调控因子网络。综上所述，这些综合遗传、生物化学和计算研究表明，mSin3A参与调节控制正常和肿瘤生长和生存的许多方面的不同途径，并为分析具有不同生物功能的基本基因提供了一个实验框架。

关键词：组蛋白修饰、敲除、mSin3复合物、mSin3A、转录调控、肿瘤发生

染色质动力学几乎影响所有已知的控制哺乳动物正常发育以及原代细胞和癌细胞生长和存活的生物过程。组蛋白是染色质的核心结构元素，它们的N末端尾部受到组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）以及其他酶活性的相反作用的共价修饰。这种可逆的乙酰化，连同其他组蛋白修饰，改变了局灶或全局染色质结构域，从而影响基因转录的激活或抑制、修复DNA机制的活性、其他生物过程中正确染色体分离所需结构的形成（综述见Fischle等人，2003年以及其中的参考）。

这些生物过程受到组蛋白修饰酶的影响，这些酶的活性通过与共表达支架分子的结合而靶向DNA上的特定位点，这些共表达支架可以被序列特异性结合蛋白（如转录因子）招募。哺乳动物Sin3蛋白，mSin3A和mSin3B，代表了最初通过与Myc家族网络的序列特异性转录阻遏物Mad1和Mxi1的直接相互作用而发现的原型共抑制分子(Ayer等人，1995年;Schreiber-Agus等人，1995年;Laherty等人，1997年)后来发现在一个大的多蛋白复合物中与HDAC1和HDAC2相关，即Sin3/HDAC辅抑制复合物（有关综述，请参阅Schreiber-Agus和DePinho 1998年;艾尔1999; Knoepfer和Eisenman，1999年；Silverstein和Ekwall 2004). 随后的研究还表明，mSin3/HDAC蛋白被一系列主要参与转录调控的因素所招募，其中包括p53(Murphy等人，1999年)、伊卡洛斯(Koipally等人，1999年)，休息(Huang等人，1999年)和E2F4(Rayman等人，2002年)有助于抑制其靶基因。

mSin3A和mSin3B蛋白在其四对双亲螺旋（PAH）蛋白相互作用域中具有广泛的相似性。哺乳动物和其他物种中存在两种高度相关的mSin3同源物(Dang等人，1999年;Silverstein和Ekwall 2004)，表明每个mSin3同源物都具有可分离的功能。mSin3协同升压复合物的中心酶活性通过其I类HDAC成分HDAC1和HDAC2获得。mSin3相关HDAC活性的维持依赖于另一个组成成分mSds3，其正交酿酒酵母对酵母具有上位性正弦3p和HDAC直方图(Vannier等人，1996年;Alland等人，2002年). 其他核心mSin3/HDAC蛋白包括视网膜母细胞瘤相关蛋白RbAp46和RbAp48，它们被认为可以稳定与mSin3复合体和核小体、mSin3相关蛋白（SAP:SAP18、SAP30、SAP130和SAP180）、RBP1、p33ING1b和BRMS1的相互作用，通过生物化学手段分离出来的细胞仍然是正在进行的功能研究的重点（有关综述，请参阅Ayer 1999年;Kuzmichev等人，2002年;Lai等人，2001年;Skowyra等人，2001年;Fleischer等人，2003年;Meehan等人，2004年).

正如最初报道的Mad家族，mSin3/HDAC复合物还驱动了许多其他序列特异性转录因子的抑制活性，这些转录因子的列表在过去几年中已大大扩展。在那些招募mSin3/HDAC复合物的因素中，有几个与细胞生存和凋亡有关，从而将这种复杂的活动与癌症相关的过程联系起来。例如，肿瘤抑制蛋白，包括p53(Murphy等人，1999年)，pRb(Brehm等人，1998年;Luo等人，1998年;Magnaghi-Jaulin等人，1998年;Lai等人，2001年)和梅宁(Kim等人，2003年)已证明通过与mSin3/HDAC复合物的相互作用抑制其靶基因。此外，这种复合物通过改变转录因子的异常募集已被证明在一些人类癌症中具有致病性，例如急性早幼粒细胞白血病和急性髓细胞白血病（有关综述，请参阅Melnick和Licht 2002).

除了在转录抑制中的作用外，mSin3/HDAC复合物的新活性在不同的模式生物中不断被发现。例如，酿酒酵母研究表明，sin3p参与渗透胁迫下MAPK Hog1靶基因的转录激活（而非抑制）(De Nadal等人，2004年)，最近在酿酒酵母sin3与DNA复制(Aparicio等人，2004年).酿酒酵母和秀丽隐杆线虫Sin3分子也以转录依赖的方式参与DNA损伤修复过程(Pothof等人，2003年;Jazayeri等人，2004年). 最后，一些Sin3-相关分子被证明参与转录调控以外的活动，包括Sin3复合体在酵母和哺乳动物的着丝粒功能和基因组稳定性中的作用。沿着这些路线磅/平方英寸（裂变酵母中mSin3A的同源物）或导弹防御系统3（小鼠细胞中mSin3/HDAC复合物的一个重要成分）导致着丝粒或着丝粒周围位点的特定染色质修饰丢失，最终导致染色体分离受损(David等人，2003年;Nakayama等人，2003年;Silverstein等人，2003年).

在这里，在对mSin3辅压复合物有重要了解的背景下，我们试图更好地定义mSin3A在正常哺乳动物发育、原代细胞和癌细胞的生长和存活以及转录网络调控中的生物学作用。为此，综合使用条件mSin3A敲除模型系统、生化分析和计算方法，以了解体内和培养的原代和转化细胞中mSin5A的合子和体细胞缺失的生物学影响。

结果

mSin3A对早期胚胎发育、细胞增殖和存活至关重要

基因靶向和嵌合形成用于产生条件微信3A等位基因(毫秒3AL（左）)在小鼠生殖系中(图1A、B)mSin3A的正常表达和小鼠及杂合或纯合的衍生细胞中缺乏表型证明，它们保留了野生型功能最小3AL（左）(图1C; 数据未显示）。此外，微信3A+/–小鼠，生成自E2A-Cre公司和微信3AL（左）/+交配显示出正常的基因型分布模式，外观健康，与微信3A+/+1.5岁以下的室友。While期间微信3A+/–容易生成的交叉最小3A–/–胚胎第6.5天（E6.5）及其后，未出现囊胚和未受精卵，这表明mSin3A在围植入期的早期发育周期中起着重要作用(图1D).

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mSin3A缺乏会导致胚胎死亡。(A类)野生型的示意图(最小3A+)，目标明确(最小3ATgt公司)，使用牙线(微信3AL（左）)和零等位(微信3A–)mSin3A。删除两侧的新霉素选择盒后前位点（条纹箭头），外显子4左侧为LoxP公司站点（打开箭头）。(B类)用Southern blot分析从mSin3A靶向ES细胞中分离的BglII消化DNAA类作为探针。(C类)大豆蛋白提取物的蛋白质印迹分析微信3A+/+,微信3AL（左）/+、和最小3A升/升MEF感染了mSin3A、mSin3B和Hdac1的表达载体（V）或表达Cre重组（C）病毒。Cdk4用作加载控制。(D类)E3.5、E6.5、E10.5和出生后第5天（P5）的子代和胚胎的基因型分布微信3A+/–交叉路口。

与合子纯合缺失相关的早期致死表型最小3A提示躯体条件微信3A原代细胞培养中的缺失研究。为此，使用Cre-encoding逆转录病毒感染最小3A升/升小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），导致仅在微信3A升/升5天内的MEF(图1C). 虽然公认的适度Cre诱导的停滞在最小3A+/+MEF，Cre表达微信3A升/升显微镜检查、TUNEL分析和FACS图谱显示，MEF与深度生长停滞和细胞凋亡增加有关，其中G1峰值(图2; 补充图1）。除了G之外2/M逮捕，BrdU-PI FACS档案微信3A–/–培养物显示一个含有S期DNA的亚群，但没有BrdU掺入(图2C，箭头）-与计划外DNA复制一致的图谱，随后触发S期检查点。

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mSin3A缺乏通过增加细胞凋亡、阻断DNA复制和G2/M被捕。(A类)增长曲线分析微信3A+/+（正方形），最小3AL（左）/+（三角形），以及最小3A升/升（圈）MEF感染了表达载体（开放型）或表达Cre重组（填充型）病毒。该图显示了三个独立实验的代表性，每个实验均进行了三次。误差条表示平均值的标准偏差。请注意，时间点0表示感染开始后4天。(B类)在感染表达载体或Cre重组病毒后5天，对指定基因型的MEF细胞进行培养。(C类)BrdU-PI FACS分析微信3A+/+,微信3A升/升、和导弹防御系统3升/升MEF感染了表达载体或Cre重组病毒。注意凋亡细胞（箭头）和S相阳性细胞（箭头最小3A升/升-表达Cre重组酶。(D类)G的百分比1、S、G2/M、 和子G1正常培养条件下MEF培养物中的（凋亡）期。该图显示了三个独立实验的代表性，每个实验均进行了三次。

为了巩固mSin3A缺乏与上述细胞缺陷之间的联系，野生型的异位表达微信3A但不是无关基因(荧光素酶)，能够消除与内源性缺失相关的上述细胞表型微信3A（补充图2）。最后，mSin3A缺陷培养物的Western blot分析显示，mSin3B或HDAC1没有明显上调(图1C)，尽管检测到编码其他mSin3A相关因子的几个基因的转录上调，表明潜在的基因调控相互作用（参见下面的转录谱）。mSin3A缺失后的细胞致死表型，加上结构相关的mSin3B的持续表达，强调了mSin3A具有可分离和基本的细胞生理功能。

mSin3A和mSds3在染色体生物学中的不同作用

以前的酵母研究表明，Sin3及其相关HDAC和Sds3组分之间存在较强的上位关系。在哺乳动物中微信3A–/–和导弹防御系统3–/–表型似乎有些重叠，这是由早期胚胎致死率、细胞生长停滞和凋亡所推断的。尤其是，两者微信3A–/–和导弹防御系统3–/–细胞显示G2/M阻滞谱，这增加了mSin3A也可能参与最近报道的mSds3染色体动力学的可能性(David等人，2003年). 如前所述(David等人，2003年),导弹防御系统3–/–由于染色体分离受损，细胞中多核细胞增多，非整倍体增多。相反，微信3A–/–MEF显示多核细胞没有增加，染色体计数相对正常(图3A; 数据未显示）。怀念导弹防御系统3–/–细胞，>75%最小3A–/–细胞在整个细胞核内呈现弥漫的HP1α信号，而不是DAPI染色的异染色质结构中的正常集中信号(图3C).

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尽管mSin3A缺陷MEF中HP1α和Orc2离域，但未出现染色体不稳定。(A类)缺乏mSin3A或mSds3的MEF中期扩展的染色体数。虚线表示正常小鼠染色体计数为40。AcK5H4免疫荧光法分析缺乏mSin3A的MEF中的异染色质(B类)、HP1α和三甲基K9H3(C类)和Orc2(D类).

尽管有这些异常的HP1α模式（与正常染色体计数一致），免疫荧光研究显示组蛋白H3的甲基化Lys 9（meH3K9）和组蛋白H4的Lys 20（meH4K20）以及组蛋白H5的低乙酰化Lys 5和Lys 12（AcH4K5和AcH4K12）的异染色质定位正确(图3B、C; 数据未显示）。此外，在组蛋白H4的Lys 5、Lys 8、Lys 12和Lys 16的整体乙酰化状态中未观察到差异，这表明mSin3A不参与组蛋白H5的整体脱乙酰化（数据未显示）。值得注意的是微信3A–/–异染色质图谱非常类似于Orc2（复制2的起源）缺失的细胞，类似地显示DNA复制阻滞G2/M期阻滞，HP1α着丝粒周围异染色质定位丢失，但缺乏染色体不稳定性(Prasanth等人，2004年). 因此，Orc2在毫秒3A–/–单元格(图3D)，指出Orc2和mSin3A在HP1α正确靶向着丝粒周围异染色质方面的联系。然而，随着Orc2在晚G期从中心周异色中消失2/M、 不能排除Orc2在着丝粒周围异染色质中不存在的可能性微信3A–/–单元格在后期G受到约束2/M相。总之，mSin3A和mSds3缺陷对细胞周期动力学的影响存在差异，这可以通过mSin5A与DNA复制过程的特定联系以及Sds3在染色体分离中的重要作用来证明。染色体动力学的这些差异表明，mSds3的功能独立于mSin3A，或者mSin5A和B同源物在这些特定的细胞过程中具有重叠的功能。

mSin3A对p53–p21的调节Cip1号机组轴

mSin3A缺陷的细胞周期阻滞和凋亡表型促使对p53–p21进行深入的基因分析Cip1号机组途径，特别是考虑到以前的报告揭示（1）mSin3A–p53的物理联系(Murphy等人，1999年)基因毒性应激对p53乙酰化和转录活性的调节(Sakaguchi等人，1998年)和（3）HDAC抑制剂的容量或基因缺失Hdac1型诱导p53转录靶点p21Cip1号机组（Lagger等人。2002,2003; 有关查看信息，请参阅Johnstone和Licht，2003年). 与这些观察结果一致，我们观察到p21的一致诱导Cip1号机组Cre介导的mSin3A缺失表达(图4A、B). 事实上，染色质免疫沉淀（ChIP）实验揭示了mSin3A在第21页Cip1号机组（未显示数据）。While期间微信3A升/升感染Cre逆转录病毒的MEF的p21没有显著增加Cip1号机组蛋白质水平，独立实验显示，用阿霉素治疗后，Lys 317和Lys 379上的p53发生了超乙酰化(图4B). 这些数据强烈表明，mSin3A调节p53–p21Cip1号机组两个层面上的轴；它抑制了第21页Cip1号机组通过调节组蛋白乙酰化在基因启动子中的转录第21页密码1通过基因毒性应激的脱乙酰化调节p53活性。

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mSin3A在基因毒性应激下脱乙酰化p53，但具有p53–p21Cip1号机组-在正常培养条件下具有独立功能。(A类)mSin3A和p21的Western blot分析Cip1号机组属于微信3A+/+,微信3AL（左）/+、和微信3A升/升感染了表达载体（V）或Cre-regusis-expressing（C）病毒的p53高产和p53缺乏背景的MEF。Cdk4用作加载控制。(B类)Western blot分析从具有指定基因型的MEF中分离的细胞裂解物，表达经或不经8μM阿霉素处理的mSin3A、p53、p21的Cre-relubiseCip1号机组和乙酰化p53赖氨酸317和p53赖氨酸379.(C类)增长曲线分析微信3A+/+第53页–/–（正方形），微信3AL（左）/+第53页–/–（三角形），以及最小3AL（左）/–第53页–/–（圈）在正常培养条件下，MEF感染了表达载体（开放符号）或表达Cre重组（填充符号）病毒(D类)G的百分比1、S、G2/M、 和子G1正常培养条件下MEF培养物中的（凋亡）期。该图显示了两个独立实验的代表性，每个实验一式三份。(E类)TUNEL分析在p53阳性的MEF中检测到的凋亡细胞百分比(左边)或p53缺失(正确的)背景。

证实mSin3A–p53–p21Cip1号机组遗传水平上的相互关系，微信3A+/+第53页–/–,微信3AL（左）/+第53页–/–和最小3AL（左）/——第53页–/–MEF感染Cre或对照逆转录病毒，随后分析DNA损伤诱导的p21Cip1号机组诱导及对增殖和细胞周期的相关影响。第21页Cip1号机组发现归纳法在微信3A–/–第53页+/+细胞和在微信3A–/–第53页–/–单元格(图4A)表明p53与基因毒素诱导的p21有关Cip1号机组mSin3A缺乏症的上调。尽管如此，p53缺陷并没有缓解微信3A–/–细胞增殖不良、S期减少和G期增加的表型2/M组分，DNA复制受阻，显著凋亡(图4C-E; 补充图3A）。此外，通过表达SV40-Large T抗原（T-Ag）对p53和pRb途径进行功能性失活，并没有克服mSin3A缺乏的细胞致死影响（补充图3B）。

由于已知原代细胞和转化细胞对HDAC抑制有不同的反应（有关综述，请参阅Johnstone和Licht，2003年)mSin3A的重要性也在淋巴瘤和肉瘤细胞系中进行了检测，这些细胞系来源于微信3A升/升第53页–/–老鼠。如所示图5在Cre介导的mSin3A蛋白缺失后(图5A),最小3A–/–第53页–/–肿瘤细胞，但不是微信3A+/+第53页–/–对照组表现出强烈的增殖抑制(图5B)，DNA复制的障碍(图5C，箭头），并标记凋亡，如子G所示1峰值和caspase-3激活(图5C-E). 总之，这些数据表明，mSin3A在原代细胞的生长和存活以及造血和间充质谱系衍生的癌症中发挥着重要作用。这些遗传和生物化学研究也提供了明确的证据，证明mSin3A（以及由此推断的相关HDAC活性）参与了基因毒性应激条件下p53特异性赖氨酸残基的脱乙酰化。然而，值得注意的是，p53缺乏（或T-Ag表达）无法减轻mSin3A功能丧失对细胞的不利影响，这进一步表明mSin3A的作用超出了p53–p21的调节范围Cip1号机组axis和Rb家族。

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mSin3A是肿瘤细胞生存所必需的。(A类)mSin3A的Western blot分析微信3A+/+第53页–/–和微信3A升/升第53页–/–表达载体或表达Cre重组病毒的淋巴瘤细胞系。Cdk4用作加载控制。(B类)感染表达载体或Cre重组病毒的指示淋巴瘤细胞系的生长曲线分析。感染后3d开始绘制生长曲线。(C类)使用指示淋巴瘤细胞系的BrdU-PI FACS分析进行细胞周期分析。注意凋亡细胞（箭头）和S相阳性细胞（箭头所示）的存在。(D类)G的指示淋巴瘤细胞系的平均BrdU-PI FACS分析总结1、S、G2/M、 和子G1细胞周期的（凋亡）阶段。(E类)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3激活微信3A+/+第53页–/–和微信3A升/升第53页–/–感染载体或Cre-retrovirus的淋巴瘤细胞系。

mSin3A转录组

由于mSin3蛋白在基因表达调控中起着不可或缺的作用（Knoepfer和Eisenman 1999），并且mSin3A的缺失具有广泛的生物学效应（本研究），因此利用转录谱和硅通路分析来更准确地了解mSin5A的这些不同作用。在时间进程研究中，4-羟基三苯氧胺（4-OHT）诱导的Cre/雌激素受体（CreER）T2段)使用了该系统，因为它可以对Cre活动进行严格的时间控制最小3A升/升MEF公司。如所示图6A，4-OHT诱导CreERT2段-转导的微信3A升/升导致细胞表型与构成性Cre逆转录病毒在微信3A升/升MEF（参见。图2A)，尽管细胞周期阻滞和凋亡不太明显，正如在表达组成性Cre重组酶的细胞中观察到的那样（补充图4）。基于显示稳定损耗的动力学微信3A信使核糖核酸和蛋白质水平(图6B)，CreER的比较时间进程转录谱T2段-转导的毫秒3A+/+和最小3A升/升在4-OHT治疗后0、24、48、72和96小时进行MEF。这种方法可以在mSin3A表型出现之前监测mSin3A-缺失的差异基因表达，并且更容易区分mSin3A－消融导致的直接转录效应与伴随细胞周期阻滞和凋亡加重的非特异性次级转录变化。dChip软件(李和王2001)用于分析Affymetrix M430A寡核苷酸微阵列生成的微阵列数据。

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mSin3A转录组。(A类)增长曲线分析微信3A升/升感染CreER的MEFT2段-表达用（圆圈）或不用（正方形）4-OHT（100 nM）处理病毒指定时间（小时）。(B类)的表达式分析微信3ARNA和蛋白质微信3A+/+和微信3A升/升感染CreER的MEFT2段-在100 nM 4-OHT存在下表达病毒指定时间。(C类)上调（红色）和下调（绿色）基因的层次聚类(第页=0.0005）暂时删除微信3A在MEF中。在正确的是分层聚类的指示区域的放大图像。

进行方差分析（ANOVA）程序，以确定两个遗传背景之间具有非恒定表达值的基因(微信3A+/+与。微信3A–/–). 强加第页-<0.0005的阈值，1308个基因被确定为具有显著的非恒定表达。与mSin3A蛋白的耗竭动力学一致，这些基因中的大多数在加入4-OHT后48小时开始表现出差异表达。值得注意的是，在这个48小时的时间点没有明显的细胞表型，因此，观察到的转录变化更接近于mSin3A功能，而不是二次事件和终末细胞崩溃（补充图4）。这些差异表达基因中的大多数（977个）上调(图6C; 补充表1；补充信息1、2）。Affymetrix表达谱上显示表达改变的基因子集通过实时RT-PCR分析来自毫秒3A升/升表达Cre-ER的MEFT2段(图7A). 如所示图7A，而微信3A4-OHT治疗48和72小时后，RNA水平逐渐下降mSin3B、Mxi1、Sap30、Ing1、Arid4b、Peg3、Set、p130、cyclin E、Odc1、Msh6、Brca1、53Bp1、Stmn1、和Aldh6a1在48小时时已经显著增加，结果与mSin3A法规的直接联系一致。相应地，ChIP分析mSin3B、Mxi1、Ing1、Arid4b、Peg3、Set、p130、半胱氨酸蛋白酶3、53Bp、Pmm1、和Aldh6a1表明mSin3A在物理上定位于这些基因的近端启动子(图7B).

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经验证的mSin3A靶基因揭示了新的mSin3A相关基因顺式-监管要素。(A类)RNA表达水平微信3A和mSin3A靶基因通过实时RT-PCR测定微信3A升/升感染CreER的MEFT2段-表达病毒，在添加100 nM 4-OHT后48和72小时，相对于添加他莫昔芬后0小时的RNA水平。(B类)使用针对SV40 Large T（阴性对照）、mSin3A和乙酰化H4（阳性对照）的抗体，通过ChIP在所示mSin3A-靶基因启动子上鉴定mSin3A。而mSin3A在mSin3A靶基因的远端无法找到Arid4b，Mxi1，Ing1公司、和53字节1两个非mSin3A靶点（β-肌动蛋白和Gapdh公司)，mSin3A位于指示基因的近端启动子部分。(C类)在mSin3A靶基因的一个子集中可以发现Stat转录调节因子（I）和核小体重塑因子Falz（II）结合的DNA序列基序。

通过上调几个成熟的Myc应答靶基因（如Odc、Cyclin D2、Ccylin E、Nucleolin、Mcm7、Cdc2A、Vamp3、RNA聚合酶1-3（16kDa亚基）、Fabp5、和项目1在其他中。除了这些预期结果外，编码与mSin3/HDAC辅阻遏物复合物相互作用的蛋白产物的多个基因上调，包括mSin3B、mSds3、Hdac2、Sap30、和干旱4b(Sap180型),Mxi1、Mnt、Prmt5、和Ing1公司这些发现表明，mSin3–HDAC通路中存在潜在的调节反馈回路，其他研究也表明了这一点(Lagger等人，2002年;Schuettengruber等人，2003年). 此外，我们确定了三个参与组蛋白甲基化的mSin3A靶基因：精氨酸蛋白甲基转移酶项目1和项目5和含有SET域的甲基转移酶Nsd1号机组（核受体结合SET域蛋白1）。由于组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化是密切相关的过程(Fischle等人，2003年;Silverstein和Ekwall 2004)这些观察结果提示人们推测，mSin3A可能部分通过这些甲基转移酶编码基因的转录调控参与这些过程的协调。

几个上调基因作为参与G2/M转变和胞质分裂包括53Bp1、p130、Gadd45-γ,Mcm4、Mcm5、Mcm7、Securin、Set、Tacc3、和Cdc2A公司。据报道，这些基因中没有一个在G中特异上调2或有丝分裂，表明其上调不仅仅是G2/mSin3A缺陷引起的M细胞周期阻滞(Whitfield等人，2002年). 因此，当这些基因中的一些过度表达时，会产生G2/M逮捕（例如。，加德45γ和53字节1)为观察到的G提供了可能的解释2/M细胞周期阻滞微信3A–/–细胞。类似地，与mSin3A缺失相关的凋亡可能在一定程度上与转录上调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，Ing1，Peg3，Pdcd5，Trim27，Mcl1，Pin1、和鞘氨醇磷酸裂解酶1，所有编码促凋亡活动(Nicholson等人，1995年;Helbing等人，1997年;Reiss等人，2004年).

在mSin3A转录组中鉴定的几个基因是已知的E2F靶基因，包括细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白D3、Mcm5、Mcm7、复制蛋白A、Rad51、Securin、核糖核苷酸还原酶M1、核糖核酸还原酶M2、半胱氨酸蛋白酶3、细胞分裂周期2A、和细胞分裂周期6E2F靶基因调控的变化与包含视网膜母细胞瘤家族蛋白和I类HDAC的E2F复合物的调控一致(Brehm等人，1998年;Luo等人，1998年;Magnaghi-Jaulin等人，1998年;Lai等人，2001年;Rayman等人，2002年). 以类似的方式，已知p53靶基因的上调(状态1，Fk506bp3)与记录的p53–mSin3A物理和功能相互作用一致(Murphy等人，1999年;Zilfou等人，2001年; 本研究）。

mSin3A转录组中存在的一组显著基因参与DNA修复过程，例如Rpa1、Msh6、Rad17、Lig1、Lig3、Apex1、和Nsep1号机组这些观察结果与支持Sin3在非同源末端连接途径中作用的酵母工作一致(Jazayeri等人，2004年). 在这方面，同源重组途径中涉及的几个DNA修复基因上调，包括Brca1，53Bp1、和Rad51系列在NHEJ活性受损的情况下，同源重组基因的上调增加了令人感兴趣的可能性，即mSin3A可能参与协调NHEJ与细胞内同源重组修复活性的相对水平。

与果蝇属，mSin3A缺失导致参与细胞溶质和线粒体能量生成途径的基因上调(Pdk1、Mrsp23、Oghd、Adac9、Bdh、Got2、Hadh2、Cs、Fxc1、Prdx3)，加强mSin3A在线粒体呼吸活动调节中的激发作用(Pile等人，2003年; 见下文）。最后，mSin3A调节参与DNA复制的几个基因的表达(Rpa1、Lig1、Mcm4、Mcm5、Mcm7、Nap1l1)为mSin3A缺失后DNA复制中观察到的缺陷提供了依据，并加强了mSin3A在DNA复制过程中直接作用的案例。

已知和新mSin3A转录节点的鉴定

mSin3A转录组中已知Myc、E2F和p53靶点的富集促使我们搜索由mSin3A调节的所有基因的调节区域，以寻找其他Myc、E_2F和p53-靶基因，以及其他转录因子及其结合位点的意外链接。对于E2F，66毫秒3A–/–上调基因在转录起始位点上游或下游500 bp范围内含有E2F结合位点。与随机收集的1161个基因相比，富集度为1.95倍（4.40%对8.61%；第页=0.044）mSin3A缺失后诱导基因集合中E2F-结合位点。扫描p53结合元素（通常位于距离转录起始位点更远的位置），64毫秒3A–/–在转录起始位点的5000bp范围内，上调基因在上游或下游都含有p53结合位点。p53结合位点的富集倍数为1.85倍微信3A–/–与随机基因相比，上调基因（8.47%对4.57%，第页= 0.046). 最后，通过扫描上调基因启动子的E-box序列来搜索Myc靶基因，发现189个基因，富集度为1.34倍（24.6%对18.33%，第页=0.183）。与更长的E2F和p53结合序列相比，E-box序列的富集相对较低，这可能是因为E-box序列中的信息减少，以及已知的Myc癌蛋白调节基因组中很大一部分的能力，如在人类和果蝇属(Fernandez等人，2003年;Orian等人，2003年). 总之，这些发现表明，基因表达谱分析和硅启动子分析可以识别E2F-、Myc-和p53应答靶点。

接下来，我们试图进一步验证mSin3A与E2F、Myc和p53转录网络之间的上述联系，并寻找新的mSin5A相互作用。此外，由于mSin3A不直接与DNA结合，我们试图鉴定mSin5A用于调节基因表达的DNA结合转录因子，如E2F、Myc和p53。为此，一个基于知识的数据库（Ingenuity Pathways knowledge Base，网址：http://www.intenuity.com)用于将mSin3A转录组（尤其是上调基因）整合到各种途径中。正如预期的那样，该网络分析将转录因子E2F1、E2F4、Myc和p53确定为连接大量mSin3A调制基因的节点（补充图5），从而为顺式-上述监管因素的结果。除了这些预期的网络之外，还出现了其他几个网络，包括由节点转录因子Fos和过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）控制的网络。后一种转录因子特别有趣，因为mSin3A转录组包含许多参与线粒体代谢/呼吸的基因(Acsl1、Nr2f2、Ctps、Pmm1、Tpm2、Pc、Scarb1、Hsd17b4、Cs、Fabp5、和乌姆普克（见补充表1；补充图6），PPAR途径与线粒体呼吸和代谢有关(Puigserver等人，1998年). 此外，通过PPAR途径调控基因表达似乎受到组蛋白脱乙酰化的调控(Fan等人，2004年). 类似地，Fos蛋白与Jun异二聚体化，已证明Jun通过招募mSin3A/HDAC复合物抑制转录(Lee等人，2000年). 最后，Pathway Knowledge Base还揭示了与DNA修复相关的各种基因的联系，强化了酵母在DNA修复中的作用的数据（补充图6；Jazayeri等人，2004年).

接下来，我们对顺式-在经验证的mSin3A靶基因启动子中过度表达的元素：mSin3B、Mxi1、Ing1、Arid4b、Sap30、53Bp1、Peg3、Set、半胱氨酸蛋白酶3、p130、和Aldh6a1（即通过ChIP分析和实时RT–PCR确认的基因）(图7A、B). 将mSin3A ChIP阳性基因组片段两侧跨越500 bp的DNA序列覆盖在多个物种的基因组上，以确定保守区域（Siepel和Hauser，2005年）。随后使用MEME基序发现程序分析这些保守区的DNA结合基序(Bailey和Elkan 1994)并使用Transfac中的Match程序与已知转录因子结合基序进行比较(Matys等人，2003年). 如所示图7C，两个顺式-已鉴定出与转录激活物Stat的DNA结合基序类似的调控元件，其DNA结合活性已被证明是乙酰化依赖的(Wang等人，2005年;袁等.2005)Falz（也称为FAC1/BPTF/Nurf301），一种核小体重塑因子，用于ISWI ATP依赖的染色质重塑复合物NURF(Bowser等人，1995年;Jordan-Sciutto等人，1999年;Jones等人，2000年;Xiao等人，2001年;Badenhorst等人，2002年). 总之，这些数据表明，计算分析和ChIP分析相结合为验证已知的mSin3A辅因子提供了一种方法，并为识别新的mSin 3A辅因素提供了一个切入点。

讨论

这项研究提供了遗传学证据，证明mSin3A在调节几个重要的转录网络中起着关键作用，并且对正常细胞和肿瘤细胞的增殖和生存至关重要。与mSin3A在不同生理过程中的作用一致，mSin5A功能的丧失会引发早期胚胎致死状态，在细胞周期的所有阶段（包括DNA合成阶段）产生缺陷，增强凋亡反应，特别是在基因毒性应激环境中，并改变与细胞周期调节、DNA复制、DNA修复、线粒体代谢和组蛋白修饰相关的许多基因的表达。与先前的生物化学数据一致，mSin3A转录组和上调基因启动子区域的计算分析提供了mSin3A在调控Myc-Mad网络、pRB–E2F轴和p53通路中的关键作用的遗传确认。此外，我们的计算工作还与PPAR、FOS、STAT和FALZ调节的基因网络建立了假定的联系。

尽管mSin3A伴侣上调，以及高度相关的mSin3B同系物普遍共表达，但mSin3A功能的丧失产生了深刻的生理后果，突显了mSin3同系物的基本和可分离的作用。mSin3A和mSin3B具有非重叠功能，这与mSin5A和mSin3B在哺乳动物细胞中占据不同启动子的能力一致(Rayman等人，2002年)以及两个酵母Sin3同源基因的不同功能分配(Nakayama等人，2003年;Silverstein等人，2003年). mSin3A和mSin3B的共同和不同功能的性质和范围需要额外的直接遗传研究。沿着这些路线，最重要的是确定在建立功能着丝粒异染色质时，mSin3A和mSin3B之间是否存在功能冗余，或者在染色体生物学的这一方面，mSds3是否确实存在独特的mSin3A/B独立功能。

同时，尽管mSds3似乎对维持mSin3A和mSin3B协同升压复合物中HDAC相关酶活性至关重要(Alland等人，2002年)，重要的是要注意微信3A–/–细胞表现出的表型在导弹防御系统3–/–细胞。明确地，微信3A–/–MEF培养物含有含有S期DNA含量的亚群，没有进行DNA复制（没有BrdU掺入）。鉴于这种DNA含量异常不能归因于染色体不稳定性，并且mSin3A转录组中DNA复制基因具有显著的代表性，我们认为mSin5A在哺乳动物细胞中的DNA复制调控中发挥直接作用。这一假设与以前在酿酒酵母，显示的角色Sin3型和零售价3（HDAC1的直系同源基因）在晚期复制起源激活中的作用与它们在转录抑制中的作用无关(Aparicio等人，2004年). 此外，在果蝇属，复制源的激活依赖于Rpd3，这可以从以下方面得到证明零售价3功能，导致全基因组超乙酰化、基因组复制和起源结合蛋白ORC2的重新分布(Aggarwal和Calvi 2004). 这些共同的见解形成了我们对mSin3共升压复合物的看法。这些数据与mSin3复合体以更模块化的方式运作的能力相一致，而不是存在一个整体的组分集合，因此各种转录因子和其他DNA结合元件可能只招募mSin3/HDAC组分的一个子集。这种推测与新发现的mSin3多蛋白复合物存在几种不同的生化形式相一致(Fleischer等人，2003年).

在癌症的背景下，一个强烈的共识是染色质结构的调节剂与关键的癌症相关途径密切相关。与此问题特别相关的是先前记录的mSin3A辅阻遏物和p53抑癌剂之间的物理和生物化学相互作用。在此，我们的遗传分析证实了mSin3A在DNA损伤中调节p53激活的能力，如Lys 317和Lys 379高乙酰化以及mSin3A-功能丧失后p53蛋白水平增加所证明的。因此，我们认为mSin3A/HDAC复合物的一个重要功能是在基因毒素诱导的损伤后调节p53乙酰化状态和细胞周期控制。此外，值得注意的是，一些脱乙酰酶和含HDAC的复合物显示了对p53脱乙酰的能力，包括NuRD复合物(Luo等人，2000年)，所有一级HDAC(Juan等人，2000年)和III类脱乙酰酶SIRT1(Luo等人，2001年;Vaziri等人，2001年;Cheng等人，2003年). 这些观察结果，以及本报告的发现，提出了一种有趣的可能性，即多个蛋白质复合物，因此，多个生化信号通路，在不同的生理环境中通过乙酰化聚合在p53蛋白上调节其活性。

电子启动子扫描显示Myc、E2F和p53显著富集顺式-mSin3A转录组中的元素。然而，值得注意的是，并非所有Myc、E2F和p53靶基因都上调，这意味着mSin3A可能只调节这些靶基因的一个子集，mSin3A可能仅在某些生理条件或细胞类型下参与这些转录因子，和/或mSin3B可能在这些基因靶标的子集上起重叠作用。对这些假设的一个重要警告是，只扫描了mSin3A转录组基因启动子序列的一个有限区域，可能是Myc、E2F和p53顺式-在我们的分析中没有捕捉到调控元件，从而导致低估了由Myc、p53和E2F共同调控的mSin3A靶基因。Stat和Falz的识别顺式-mSin3A靶基因子集中的调控元件表明，mSin5A使用各种DNA结合转录因子在转录调控中赋予选择性和特异性。最近，研究表明，Stat3的乙酰化对于蛋白质形成稳定的二聚体至关重要，二聚体是细胞因子刺激的DNA结合和转录调控所必需的，也是增强细胞生长相关基因转录的关键(Wang等人，2005年;袁等.2005). 这些研究，加上我们发现mSin3A可以抑制Stat靶基因转录，提出了一种模型，其中mSin3A相关的HDAC活性抑制Stat3二聚化并中和其转录潜力。各种研究暗示了不同染色质重塑复合物之间的协同作用，包括mSin3A/HDAC和SWI/SNF(Sternberg等人1987;Sif等人，2001年;Kuzmichev等人，2002年). 在这种情况下，我们发现mSin3A通过Falz调节基因转录似乎是相关的，因为Falz是ISWI ATP依赖性核小体重塑复合物NURF的一个组成部分。Falz含有一种溴代多巴胺，已知其能结合组蛋白和非组蛋白中的乙酰化赖氨酸（有关综述，请参阅杨2004)这表明Falz可能将mSin3A/HDAC复合物招募到此类靶点，以脱乙酰化特定启动子区域或修改非组蛋白的转录活性。除FALZ外，人类NURF复合物还含有RbAp46和RbAp48两种蛋白质，这两种蛋白质通常在与mSin3A的复合物中发现(Barak等人，2003年). 值得注意的是，Nurf301可以作为STAT蛋白下游JAK/STAT信号通路的负调控因子，表明mSin3A可以通过两种DNA-结合转录因子调节基因转录(Badenhorst等人，2002年). 沿着这些路线，我们的计算和ChIP分析显示mSin3A靶基因萨普30在其启动子中包含Statas和Falz-binding基序。

总之，本研究的综合遗传、生物化学和计算方法使我们能够深入了解mSin3A的多种功能。这种综合方法和条件体细胞灭活的应用可能会在分析服务于细胞基本功能的多功能复合物中发现实用性。就mSin3A而言，本研究证实了mSin5A的基本作用，并进一步证实了mSin3A辅抑制复合物在许多与正常生理学和癌症相关的生物过程中的重要作用，并有助于揭示调节各种生化过程（例如DNA复制、核小体重塑等）的已知和新的辅因子。

本报告的观察结果提出了一种评估正常细胞和癌症中mSin3协同升压复合物其他成分的总体策略。

材料和方法

的生成微信3A条件无效等位基因

A有条件mSin3A-目标构造由侧翼生成微信3A外显子4带有5′loxP-Frt-PGK-neomcin公司表达盒(Aguirre等人，2003年)和3′loxP现场。在电穿孔129/SvOla胚胎干（ES）细胞并选择200μg/mL G418后，通过Southern blot分析鉴定同源重组体。将正确靶向的ES克隆注射到C57Bl/6囊胚中，并将种系传递嵌合体小鼠培育成CAGG-Flpe公司(罗德里格斯等人，2000年)以及EIIa-核心转基因小鼠(Lakso等人，1996年)生成毫秒3AL（左）和最小3A–等位基因。通过Southern分析和多重PCR对小鼠进行基因分型（可根据要求提供引物和条件）。

MEF的制备、细胞培养和逆转录病毒感染

使用标准程序从13.5-d后囊胚（dpc）中分离出MEF(Dannenberg等人，2000年)并在补充有10%胎牛血清（FBS）、0.1 mMβ-巯基乙醇和抗生素的DMEM中培养。用6μg病毒DNA和6μg pCL载体共转染293T包装细胞，产生嗜生态逆转录病毒上清液(Naviaux等人，1996年)根据制造商的说明使用脂质体2000（Invitrogen）。收集病毒上清液，并在转染后48、56和72小时通过0.45μm过滤器过滤。用含有4μg/mL聚溴乙烯（Sigma）的病毒上清液感染早期传代MEF的低密度培养物两次至少6 h，间隔8 h。在36 h的恢复期后，使用含有2.5μg/mL嘌呤霉素（Sigma）的培养基选择MEF至少48 h，然后对细胞进行本研究中报告的任何分析。

为了研究p53乙酰化，MEF感染对照或表达Cre的病毒，并在感染后72小时用阿霉素治疗，并按照Cheng等人的描述进行处理(2003).

增殖曲线、细胞周期和凋亡分析

按照Dannenberg et al(2000). 通过用10μM 5-溴脱氧尿苷（Sigma）在10-cm组织培养板上培养MEF 1 h并按照Dannenberg等人(2000). 细胞凋亡的评估是通过在八个腔室的载玻片上生长MEF 24–48小时来进行的，然后根据制造商的说明使用原位细胞检测试剂盒（Roche）进行分析。通过在100倍放大率下计算三个不同场中100个DAPI染色细胞核中TUNEL阳性细胞核的数量来量化凋亡细胞。所有实验均在逆转录病毒感染pBabepuro或pBabe-Cre病毒后5-7天进行。

中期传播和免疫荧光

如David等人(2003). 在逆转录病毒感染pBabe-puro或pBabe-Cre病毒后5-7天，对MEF进行免疫荧光分析。MEF在八个室的载玻片上培养24–48小时，用2%新鲜多聚甲醛（Pierce）固定，并用0.1%Triton X-100渗透。使用了针对以下蛋白质的抗体：AcK12H4、AcK5H4、meK9H3、meK20H4（上游）、HP1α（Chemicon）。对于Orc2（BD Biosciences）染色，如Prasanth等人(2004). 免疫荧光图像是使用蔡司Axiovert 200-M倒置显微镜或CoolSnap HQ CCD相机（Photometrics）采集的，该相机由Slidebook 4.0 b 2.5软件（智能成像创新）驱动。通过1×1 binning和0.1-mm Z步长获得照片。反褶积采用最近邻法进行，迭代次数为20次。

蛋白质分析

蛋白质水平采用常规方案通过Western blot分析测定。抗mSin3A（K-20）、mSin3B（AK-12）、p130（C-20）、Cdk4（C-22）和p21的抗体Cip1号机组（C-19）来自Santa Cruz，HDAC1来自Upstate，p53抗体（Ab-7）来自Ongene Science，p53AcK317和p53AcK 379来自Trevigen。过氧化物酶偶联山羊抗兔和山羊抗鼠二级抗体来自Pierce。为了检测抗p53抗体，我们使用了来自圣克鲁斯的过氧化物酶偶联的牛抗羊抗体。

的生成和培养毫秒3A升/升第53页–/–肉瘤和淋巴瘤

微信3A+/+第53页–/–和微信3A升/升第53页–/–小鼠是由微信3AL（左）/+第53页–/–交叉，然后允许变老。平均而言，在10-15周龄时，这些小鼠发生了（血管）肉瘤和T细胞淋巴瘤。制备肉瘤和淋巴瘤的单细胞悬浮液并进行培养。肉瘤在培养基中的保存条件与MEF完全相同。淋巴瘤在RPMI培养基（Gibco）的培养瓶中培养，并添加10%FBS、0.1 mMβ-巯基乙醇和抗生素。

基因表达谱分析

次级流出物微信3A+/+和最小3A升/升在10厘米培养皿上培养的MEF两次感染表达CreER的逆转录病毒T2段重组酶，并为其余实验选择嘌呤霉素（2.5μg/mL）。在达到汇合点后，将细胞传代到15厘米的培养皿上，再选择2天。随后，将每个培养皿分成5×3个10厘米的培养培养皿。连续五天，将4-羟基三苯氧胺以最终浓度100 mM添加到一组新的三个10-cm培养皿中。实验结束时分离RNA和蛋白质，以记录mSin3A状态。每个时间点使用两个10厘米的平板，使用Trizol（Invitrogen）和RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）分离RNA。在Affymetrix M430A平台上进行基因表达谱分析。

实时RT–PCR

根据制造商的处方，使用来自Qiagen的Quantitec SYBR试剂盒进行实时PCR。可根据要求提供引物序列。RNA是从微信3A升/升表达CreER的MEFT2段并使用Rneasy试剂盒（Qiagen）用他莫西芬治疗0、48或72小时。为了计算RNA数量，我们用已知RNA浓度的系列稀释液建立了标准曲线。每次RT-PCR（Qiagen）均使用一毫微克总RNA。所有RT-PCR均一式三份。

ChIP和识别顺式-监管要素

采用融合早期传代（第4代）初级MEF（pMEF）进行ChIP实验。对于每个ChIP分析，我们使用3×107并遵循已发布的协议(Ren等人，2002年). 用于ChIP的抗体包括抗mSin3A（K-20；Santa Cruz）、抗SV40 LargeT（马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所J.DeCaprio赠送）、抗乙酰化组蛋白H4（Upstate）。PCR引物是针对5kb启动子片段的每个千碱基设计的，可根据要求提供。关于鉴定小说所用方法的信息顺式-mSin3A靶基因启动子中的调控元件可以在补充材料中找到。

基因表达谱数据的生物信息学分析

使用dChip软件对原始基因表达谱进行分析(李和王2001). 为了识别潜力E2f（E2f）-1182个探针组启动子中的结合位点(第页=0.005）mSin3A缺失后上调，我们将基因映射到基因组上并确定转录起始位点（TSS）。用已知的E2F矩阵对TSS上游500 bp和下游500 bp的启动子进行潜在的扫描E2f（E2f）-结合位点。每个推广人只有两次最佳点击记录的位置和得分。第53页-按照相同的程序在相同的启动子中发现了结合位点，但p53基质的扫描区域在TSS上游扩展到5000 bp，下游扩展到5000 bp。在TSS上游1000 bp和下游200 bp的区域中鉴定出E-box序列。用于扫描mSin3A转录组中基因启动子区域的E2F、p53、Myc和AP-1结合位点的序列记录在Transfac(Matys等人，2003年). 为了确定mSin3A转录组中的基因网络，我们使用了Ingenuity Pathways知识库(网址：http://www.intenuity.com).

致谢

我们感谢James Horner和Michelle Neptune的转基因和基因靶向设施，以产生靶向ES细胞和生殖系小鼠菌株。我们感谢姚瑶关于使用重组技术生成靶向结构体的建议。我们感谢动物设施工作人员的专家协助；Shan Jiang、Karen Marmon、Alice Yu和Yan Zhang。我们感谢佩德罗·卡瓦略（Pedro Carvalho）在反褶积显微术方面的帮助。我们感谢Erguen Sahin、Giovanni Tonon和Ruben Carrasco的有益讨论。我们感谢Nabeel El-Bardesy为Cre和Cre-ERT2段逆转录病毒载体。我们感谢Giovanni Tonon对Ingenuity Pathways知识库分析的帮助。我们感谢Alex Stegh对caspase-3活性分析的帮助。我们感谢Omar Kabbarah在实时RT-PCR方面的帮助。我们感谢Ruben Carrasco对组织切片进行的专业组织学检查。我们感谢J.DeCaprio慷慨提供SV40大T抗体，感谢Darrell Borger提供逆转录病毒大T SV40表达结构。我们非常感谢Robert N.Eisenman在发布之前传达数据。J-H.D.是Damon Runyon癌症研究基金会支持的Damon Runyon研究员，目前是荷兰癌症协会研究员。这项工作由美国国立卫生研究院拨款GM67250（W.H.W.和S.Z.）和RO1CA86379（R.A.D.）以及美国癌症协会拨款资助。R.A.D.是美国癌症协会研究教授和埃里森高级学者。

笔记

补充材料可在http://www.genesdev.org。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1286905。

证据中添加的注释

Cowley等人的一项研究(2005)使用独立生成的微信3A条件小鼠表现出mSin3A缺乏对胚胎发育、MEF增殖和染色体动力学的类似影响。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社