《维罗尔杂志》。2000年9月；74(18): 8234–8242.
牛呼吸道合胞病毒非结构蛋白NS1和NS2协同对抗α/β干扰素诱导的抗病毒反应
乌苏拉·巴赫霍尔茨
慕尼黑D-81377路德维希·马克西米利安大学马克斯·冯·佩滕科弗研究所和基因中心，1联邦动物病毒病研究中心分子生物学研究所，D-17498 Insel Riems，2德国
慕尼黑D-81377路德维希·马克西米利安大学马克斯·冯·佩滕科弗研究所和基因中心，1联邦动物病毒病研究中心分子生物学研究所，D-17498 Insel Riems，2德国
*通讯作者。通讯地址：德国慕尼黑D-81377 Feodor-Lynen-Str.25，Max von Pettenkofer Institute&Gene Center。电话：49 89 2180 6851。传真：49 89 2180 6899。电子邮件：ed.nehcneum-inu.bml@amleznoc公司. 摘要
通过携带单基因和双基因缺失的重组牛呼吸道合胞病毒（BRSV）的产生和分析，研究了BRSV非结构蛋白NS1和NS2的功能。然而，在MDBK细胞中，缺乏一个或两个NS基因导致病毒滴度降低5000到10000倍，而在Vero细胞中观察到病毒滴度中度（10倍）降低。有趣的是，感染MDBK细胞的细胞培养上清液能够抑制Vero细胞中NS缺失突变体的生长，表明NS蛋白参与逃避细胞因子介导的宿主细胞反应。通过用阻断α-干扰素（IFN-α）受体的抗体中和抑制作用，MDBK上清液中的相关因子被确定为I型干扰素。用重组通用IFN-αA/D或IFN-β处理细胞显示出对单缺失和双缺失突变体的严重抑制，而全长BRSV的生长没有受到很大影响。令人惊讶的是，所有NS缺失突变体均受到同等程度的抑制，这表明NS1和NS2在对抗IFN介导的抗病毒机制中必须合作。为了验证这一发现，我们制备了表达NS1或NS2的重组狂犬病病毒（rRV），并测定了它们对干扰素的敏感性。在与表达NS1和NS2的rRV共同感染的细胞中，病毒复制对IFN剂量有抵抗力，IFN剂量会导致感染野生型RV或单独感染NS-表达rRV的细胞复制减少1000倍。因此，BRSV NS蛋白具有协同保护无关病毒免受干扰素-α/β介导的抗病毒反应的潜力。有趣的是，与其他来源的细胞系相比，BRSV NS蛋白在牛细胞系MDBK中对干扰素具有更显著的抵抗力，表明其适应宿主特异性抗病毒反应。上述发现对BRSV和HRSV活重组疫苗的设计产生了重大影响。
牛呼吸道合胞病毒（BRSV）是小牛呼吸道疾病的主要病原体，造成了巨大的经济损失(40,45). 小牛的免疫反应和病理学模拟了人类呼吸道合胞病毒（HRSV）引起的症状，HRSV仍然是世界各地婴幼儿严重毛细支气管炎和肺炎的主要原因(9). 分子克隆证实了BRSV和HRSV之间的密切关系，并揭示了它们与其他成员之间的巨大差异副粘病毒科家族，导致肺炎病毒中的属副粘病毒科家庭(36,37).
与订单的所有成员一样单核糖核酸，RSV的15-kb基因组RNA包含在核糖核蛋白（RNP）复合体中，该复合体用作基因顺序转录的模板(25,49). 从10个转录单位中表达了11个蛋白质，其排列顺序为3′-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5′(5,9,30,31). 编码的蛋白质包括五种RNP相关蛋白，即核蛋白N、磷酸蛋白P、RNA聚合酶的大催化亚单位L和由M2基因的两个重叠开放阅读框中的第一个编码的转录延伸因子（M2-1）(8,17,27,38). 据报道，M2转录单元（M2-2）的第二个开放阅读框编码一个非必需蛋白(1)可能参与RNA合成的调节(4,28). 三种病毒蛋白与病毒包膜相关，即融合蛋白F、假定的附着蛋白G和一种小的疏水蛋白SH。
两个非结构蛋白基因NS1和NS2位于基因组的3′末端，这将肺炎球菌病毒与其他所有成员区别开来单核糖核酸由于3′-近端位置，NS基因转录丰富。编码的蛋白质已在感染细胞中得到证实(10,16). BRSV NS1和NS2基因分别编码136和124个氨基酸的多肽。与HRSV亚组A和B蛋白的NS蛋白进行比较，发现NS1蛋白的氨基酸同源性分别为69和68%，NS2蛋白的氨基酸相似性分别为84和83%(5,34). 然而，推导出的序列并没有为NS蛋白在病毒生命周期中的功能提供明显线索。据报道，HRSV NS1蛋白与M蛋白相关，而NS2蛋白与RSV结构蛋白没有任何可检测的关联，表明NS1和NS2具有不同的功能(16,47). 最近，在没有或存在NS1的情况下生长人工HRSV小基因组的实验表明，NS1在病毒RNA转录和RNP复制中具有抑制作用。在同一研究中，还观察到NS2具有抑制作用，但不太明显(三).
最近建立的从cDNA中回收感染性负链RNA病毒的方案(11)允许产生重组HRSV(8,29)和BRSV(5)并允许研究人员在病毒背景下解决单个蛋白质的功能。成功回收活的NS2基因缺失突变体证实了NS2对病毒在细胞培养中的复制不是必需的(5,43). 然而，缺失突变体被减弱，表明NS2是一个辅助因子，能够通过迄今为止未知的机制实质上支持病毒生长。
为了更深入地研究BRSV NS蛋白的功能，我们产生了额外的缺乏NS1基因或NS1和NS2的BRSV缺失突变体，并分析了它们在不同细胞系中的行为。我们已经确定BRSV NS蛋白是干扰素（IFN）介导的宿主细胞反应的有效拮抗剂。最突出的发现是，干扰素拮抗活性需要NS1和NS2，而每种蛋白本身并不表现出任何活性。通过使用另一种负链RNA病毒狂犬病病毒（RV）作为表达BRSV衍生的NS基因的载体，我们还可以表明这两种NS蛋白的活性可以增强无关病毒的IFN抗性。
材料和方法
细胞和病毒。
重组BRSV（rBRSV）是从BRSV株A51908（美国型培养物收集）中获得的(33)变体ATue51908（GenBank登录号。AF092942型)如前所述，在MDBK细胞中生长(5). 在制备病毒载体时，80%的融合MDBK或Vero细胞单层在无血清Dulbecco最小必需培养基（DMEM）中以0.1的感染倍数（MOI）感染。吸附1小时后，取出接种物，并将细胞在37°C下在补充有2.5%胎牛血清（FCS）的DMEM中在5%CO中孵育2直到观察到广泛的细胞病变效应（CPE）。病毒通过冷冻和解冻释放出来。通过限制微孔板中的稀释度和用融合蛋白抗体间接染色后感染细胞病灶的计数来测定Vero细胞上的病毒滴度（由西班牙马德里J.a.Melero善意提供）。感染后，以0.01的MOI在Vero细胞单层上制备NS缺失突变体。在贺利氏8074转子中以1500 rpm的速度，通过Ficoll梯度离心法（Lymphoflot；Biotest，Dreiech，德国）从奶牛和小牛的血液中分离出牛巨噬细胞，并将单核细胞部分吸附到细胞培养瓶底部。过夜培养后，用不含FCS的RPMI（Gibco）清洗三次，去除非粘附细胞。剩余的贴壁细胞（CD14阳性率为90-95%）在37°C和5%CO下用10%FCS在RPMI中培养2.
BRSV NS基因缺失突变体的构建。
包含全长BRSV cDNA（pBRSV）和NS2基因缺失突变体（pBRSVΔNS2）的表达质粒的构建已在前面进行了描述(5). 通过切割从pBRSV中删除NS1基因不是我和Ase公司一、 随后填充Klenow聚合酶，并重新定位，产生pBRSVΔNS1。为了产生双缺失突变体pBRSVΔNS1/2，用引物NNot（+）（5′-TAG）扩增了一个跨越部分N基因的0.6-kb PCR片段GCGGCCGC公司美国汽车协会自动液位计GCTCTTAGCAAGGTG-3′）包含不是与rBRSV的核苷酸（nt）1735至1715相对应的N起始密码子（斜体）和反向引物NStu（−）（5′-TCCTTGTATCGTTTCATTTC-3′）上游的I识别位点（带下划线）位于唯一的斯图I限制位置（rBRSV位置1671）。从pBRSV中删除NS21和NS2基因以及部分N基因后不是I（rBRSV位置72）和斯图I（rBRSV位置1671）消化不是I-和斯图使用I-cut PCR片段（543nt）替换删除的序列（图。).
（A） 重组BRSV的基因组图。转录物（阴影条）和蛋白质编码框（开条）的位置显示为相对于病毒基因组（vRNA）（实心条）。在放大过程中，比较了全长突变体和NS缺失突变体的组织。先导RNA以垂直条纹标记，并指示用于克隆的相应核苷酸和限制性位点的相对位置。（B） 在RV G和L基因之间组织含有标记的BRSV NS1或BRSV NS 2开放阅读框的rRV。
携带NS1或NS2基因的rRV（图。)基于全长RV cDNA（SAD L16）构建，该cDNA包含G基因（SAD VB）3′非编码序列中的额外转录停止-重新启动序列(32). 首先，构建编码BRSV NS1或NS2蛋白C末端标记版本的cDNA。通过使用反向引物NS1HAr-EcoRI（5′-GAAATA）进行PCR，在NS1终止密码子之前插入与流感病毒血凝素（HA）蛋白的内部区域相对应的额外27ntGAATTC公司CTAAGCGTAATCTGGTACATCATAAGGATAAT TCAGACAAGAGAGT-3′），包含生态RI识别序列（带下划线）。对于NS2，用反向引物NS2FLr-EcoRI（5′-GCAATA）插入编码合成FLAG肽的24 ntGAATTC公司CTATTTATCGTCATCATCTTTATAATCTTGGATTAAATCATTATA-3′）（生态RI序列带下划线）。使用PCR片段替换含有全长BRSV cDNA的nt1-957的质粒（pBSBRSVNS1NS2）的相应序列(5). NS1-HA基因用不是我和生态意大利。在用Klenow聚合酶填充后，得到的475-nt片段被插入到一个独特的Sma公司我位于pSAD-VB中额外转录起始信号的下游，导致pSAD-VB-NS1HA。含有NS2-FL的470-nt片段在用Ase公司我和生态RI并填充Klenow酶，产生SAD VB-NS2FL。
BRSVs和rRVs的转染实验和恢复。
如前所述，对缺乏NS1或NS2基因的rBRSV和含有NS1或NS2基因的r RV进行了抢救(5,19)，转染CaPO后4-沉淀（哺乳动物转染试剂盒[Stratagene]）T7启动子控制质粒，包含相应的病毒cDNA（10μg）。对于BRSV，编码BRSV蛋白N和P（pTITB-N和pTITB-P，各4μg）、L和M2（pTITB-L和pTITB-M2，各2μg6稳定表达噬菌体T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞(5). 4h后取出转染培养基，将细胞进一步培养在BHK-21培养基（Gibco）中，该培养基含有5%的BRSV FCS和10%的RV小牛血清。将转染BRSV cDNA的细胞以1:3的比例每5天分裂一次，直到检测到CPE。为了恢复RV，在转染6天后收集细胞培养上清液，并将其转移到新鲜的BSR细胞上。通过识别RV N蛋白的异硫氰酸荧光素结合物（Centocor）免疫染色检测感染性RV。
北方杂交。
在大规模CPE（RNeasy；Quiagen）发生后，从感染重组病毒rBRSV、rBRSV-ΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSV-ΔNS1/2的Vero细胞中分离出总RNA。RNA通过变性凝胶电泳分离，印迹到尼龙膜（Duralon-UV；Stratagene）上，并通过UV辐射交联到膜上。约500 nt的NS1、NS2和N基因特异性DNA探针标记有[α-32P] dCTP（3000 Ci/mmol；Amersham），通过昵称翻译（昵称翻译工具包；Amersham）。将杂交滤光片与柯达BioMax MS胶片在−70°C的温度下用增感屏曝光或进行磷光成像处理（Storm；Molecular Dynamics）。
干扰素共培养试验及处理。
在共培养实验中，Vero应答细胞在无FCS的DMEM中以0.1的MOI模拟感染或悬浮感染rBRSV、rBRSV-ΔNS1、rBRSVΔNS2或rBRSV-ΔNS1/2，持续1h。清洗后，5×105细胞接种到DMEM加2.5%FCS的六孔培养皿中。用每毫升10μg脂多糖（LPS）（Sigma）隔夜孵育激活的MDBK效应细胞或牛巨噬细胞，用rBRSV在MOI为1的条件下悬浮感染1小时6将细胞接种到具有200nm孔径的Anopore膜（Nunc）的25mm组织培养插入物中，并放置到含有感染的Vero应答细胞的孔中。共培养3天后，去除膜插入物，并如上所述测定Vero细胞中的病毒滴度。感染后立即用抗体处理应答细胞，方法是用每毫升5μg中和鼠抗人IFN-α/β受体链2（CD118）抗体（PBL生物医学实验室）或5μg识别肿瘤坏死因子受体I型（TNFRI）的对照抗体孵育1小时或主要组织相容性复合物（MHC）I类/ml。接种到六孔板中后，在每ml中存在1μg相应抗体的情况下进一步培养细胞。
为了确定干扰素-α/β对BRSV和NS缺失突变体复制的影响，Vero或MDBK细胞在0.1的MOI下感染上述不同病毒，并在DMEM加2.5%FCS的六孔培养皿中培养。接种后立即将重组人IFN-αA/D或人IFN-β（PBL生物医学实验室）添加至15000 U/ml的浓度。通过限制稀释和用上述F蛋白抗体间接染色感染细胞病灶，在培养3天后测定病毒滴度。
rRV SAD VB、SAD VB-NS1和SAD VB-NS2的感染分别在悬浮液中进行，如前所述(18)MOI为5。对于与SAD VB-NS1和SAD VB-NS2的联合感染，每个重组体的MOI为2.5。接种后立即将重组干扰素-αA/D添加到高达500 U/ml的浓度。感染后2天，通过限制稀释和用荧光素-异硫氰酸盐结合物对RV N蛋白（Centocor）进行免疫染色来测定病毒滴度。
结果
缺乏NS基因的BRSV缺失突变体的构建和拯救。
我们之前已经描述了BRSV株ATue51908全长cDNA的克隆和质粒的构建，这些质粒允许T7 RNA聚合酶驱动BRSV全长抗原组RNA（pBRSV）或缺乏NS2基因的RNA（pBRESVΔNS2）的转录(5). 缺失NS1基因（pBRSVΔNS1）或同时缺失NS1和NS2（pBRSVΔNS 1/2）的构建物也由pBRSVs制成，详见材料和方法。与重组野生型病毒rBRSV的序列相比，NS1、NS2和NS1/2缺失突变体分别缺少496、509和1060 nt。在所有结构中，3′末端基因的转录都是由原始先导/NS1转录启动信号连接（图。).
如前所述，从表达T7 RNA聚合酶的BSR T7/5细胞中的相应cDNA构建物中回收活的重组病毒rBRSV、rBRSV-ΔNS1、rBRSVΔNS2和rBRSV-ΔNS1/2(5). 在所有病例中，包括NS1/2双缺失突变体，与编码BRSV N、P、L和M2蛋白的支持质粒共转染导致合胞体的形成。将转染细胞以1:3的比例分离，并出现广泛的CPE后，分离出病毒。为了生产病毒库存，Vero细胞以0.1的MOI感染重组病毒，直到出现明显的CPE，rBRSV需要3天，NS缺失突变体需要5天。
在以0.1的MOI感染rBRSV或NS缺失突变体的细胞并分别孵育3天和5天后，分离并处理总RNA以进行Northern杂交。观察到类似的转录模式，只有在存在或不存在NS1和NS2特异性RNA时，病毒才会有所不同（图。). 正如之前在BRSV和HRSV NS2缺失突变体中观察到的那样(5,43)，在感染所有重组体的细胞中都存在类似数量的N mRNA和基因组RNA（数据未显示）。
重组BRSV中缺乏NS1和NS2转录物。感染指示病毒后2至4天，从BSR细胞中分离出总RNA，并用分别跨越NS1、NS2、NS1至NS2和N基因的探针进行Northern杂交分析。显示NS1、NS2和N mRNA。
NS缺失突变体的生长依赖于细胞类型。
首先分析了BHK衍生的BSR T7/5细胞中的病毒生长特性，这些细胞用于恢复实验。与亲本全长病毒相比，所有三个突变体均被减弱，表明这两种NS蛋白都对病毒复制有贡献。有趣的是，两个NS单基因缺失突变体和NS1/2双缺失突变体在感染细胞培养物中的传播和最终滴度没有显著差异。所有突变株的感染滴度均达到2×105在0.1的MOI下感染BSR T7/5细胞并孵育6天后出现PFU，而亲本病毒产生10个6PFU（图。A） ●●●●。在HEp-2细胞或Vero细胞（HRSV培养的首选细胞系）中培养病毒后，获得了类似的结果，滴度略有增加（数据未显示）。
NS缺失突变体在MDBK细胞中比在BSR细胞中更弱。在MOI为0.1时，接近融合的BSR T7-5（A）和MDBK（B）细胞单层被BRSV、BRSVΔNS1、BRSV-ΔNS2或BRSV△NS1/2感染。按照材料和方法所述，每2天测定一次感染病毒滴度。从第6天开始，Vero细胞中所有突变体的复制和MDBK细胞中wt-BRSV的复制导致大规模细胞破坏。数值来自两个独立的实验，每个实验一式三份。条形图显示标准偏差。
然后我们切换到牛源性细胞系MDBK，该细胞系已被证明最能支持wt BRSV的生长(5). 事实上，MDBK产生的wt BRSV滴度略有增加，为2×106感染6天后的PFU（图。B） ●●●●。然而，最出乎意料的是，该细胞系中缺失突变体的生长受到严重阻碍。缺乏NS1或NS2的单缺失突变体的滴度仅为3×10三6天后的PFU，比BSR细胞低100倍。NS1/2双缺失突变体在前6天内不能显著生长。只有在细胞分裂并再培养8天后，病毒滴度才能达到2×102获得（未显示数据）。显然，MDBK细胞是全长wt BRSV的首选宿主，而对于所有NS缺失突变体，它们几乎是不允许的。与之形成鲜明对比的是，作为wt BRSV次优宿主的BSR和Vero细胞对NS缺失突变体的支持作用相当好。
MDBK细胞和牛巨噬细胞产生的可溶性因子影响Vero细胞中NS缺失突变体的生长。
为了揭示MDBK细胞因子对NS缺失突变体（而非wt-BRSV）具有明显的选择性阻碍作用，我们首先检查了MDBK产生的可溶性分子是否能够抑制Vero细胞中NS缺失突突变体的生长。这是通过在设备中共同培养MBDK和Vero细胞实现的，在该设备中，两种细胞培养物由病毒膜过滤器分离，允许可溶性因子通过（图。A） ●●●●。在上孔中，MDBK细胞被用作效应细胞。在下孔中，以0.1的MOI感染wt BRSV或每个NS缺失突变体的Vero细胞作为应答细胞。至少进行了五个独立的共培养实验。未感染的MDBK效应细胞或用作阴性对照的BSR细胞对Vero应答细胞中wt BRSV或NS缺失突变体的生长均无抑制作用。然而，当MOI为1时，与感染BRSV的MDBK细胞共培养，导致NS缺失突变体受到较小但可重复的抑制，而wt BRSV生长不受影响（图。B） ●●●●。NS1/NS2双缺失突变体的作用最为明显，与未感染的MDBK细胞相比，在感染MDBK的细胞中，其滴度降低了约7倍。单缺失突变体rBRSVΔNS1和rBRSV-ΔNS2的滴度分别降低了两倍和三倍。
病毒感染的MDBK细胞或感染的巨噬细胞的上清液抑制共培养Vero细胞中BRSV NS缺失突变体的生长。（A） 协同栽培试验设计示意图。（B） MDBK细胞或LPS刺激的牛巨噬细胞效应细胞（EC）在MOI为1时感染BRSV，接种到Nunc Anopore膜细胞培养嵌体中，并与感染wt BRSV、BRSVΔNS1、BRSV-ΔNS2或BRSV△NS1/2的Vero应答细胞（RC）共培养。3天后，取下嵌体并测定Vero培养物中的感染病毒滴度。结果显示为抑制百分比，包括与使用未感染MDBK或未感染、未刺激巨噬细胞的对照组相比的标准偏差（+/-）和折叠减少（平均值）。数值来自六个（MDBK）和四个（巨噬细胞）共培养实验。
由于未感染MDBK细胞的上清液不能抑制Vero应答细胞中NS缺失突变体的生长，有效的MDBK因子似乎是由病毒感染诱导的。不仅wt BRSV感染，而且还感染了一系列BRSV基因缺失突变体，包括rBRSVΔNS1/2和一个缺乏SH和G基因的突变体（rBRSVΔSH/G；未发表的数据），导致抑制因子的分泌具有可比性。此外，研究发现，感染另一种RNA病毒RV后，MDBK细胞中的有效物质的诱导程度与感染病毒相似（数据未显示）。这些结果有力地支持细胞因子介导的Vero应答细胞中抗病毒状态的诱导，主要候选是IFN。
为了进一步说明所涉及的细胞因子的性质，我们在共培养实验中使用牛巨噬细胞作为效应细胞。隔夜用LPS刺激从两种动物分离的牛巨噬细胞，感染rBRSV，并与Vero细胞共同培养。与受刺激、病毒感染的巨噬细胞和非受刺激的巨噬细胞孵育后，全长rBRSV的产量相似。然而，与非刺激、非感染巨噬细胞对照组相比，NS缺失突变体显著减少了30到50倍（图。B） ●●●●。此外，仅用LPS刺激巨噬细胞，而无后续病毒感染，足以使rBRSVΔNS1/2的产量减少约10倍（数据未显示）。由于已知受刺激的巨噬细胞是IFN-α/β的产生者，这些实验表明IFN-α和/或IFN-β参与抑制BRSV NS缺失突变体的生长。
NS基因的缺失使BRSV IFN-α/β敏感。
此前有报道称，Vero细胞在产生干扰素方面存在遗传缺陷(15,46). 然而，根据荧光激活细胞分选分析（数据未显示）确定，在共培养实验中用作应答细胞的Vero细胞表达IFN-α/β受体（IFNAR2）的α亚单位(44). 为了确定受感染的MDBK细胞或巨噬细胞产生的IFN-α和/或IFN-β是否介导对NS缺失突变体的抑制作用，Vero应答细胞被rBRSVΔNS1/2、rBRSV-ΔNS2或rBRSV-ΔNS1/2感染，并用阻断IFNAR2的单克隆抗体处理（PBL Laboratories）。对照细胞与MHC I类和TNFAR特异性单克隆抗体并行处理。然后将这些细胞在受感染的MDBK效应细胞存在下孵育3天。虽然在与对照抗体孵育的细胞培养物中或在没有抗体的情况下观察到NS缺失突变体受到抑制，但在与IFNAR2抗体孵育的细胞中抑制作用几乎完全被中和（图。). 因此，在Vero应答细胞中诱导抗病毒状态导致抑制NS缺失突变体完全是由于MDBK细胞或巨噬细胞产生IFN-α/β。
IFNAR2单克隆抗体可中和MDBK或巨噬细胞上清液产生的抑制因子的作用。在MOI为0.1的情况下，感染rBRSVΔNS1、rBRSV-ΔNS2、rBRSRVΔNS1/2或wt rBRSVs的Vero应答细胞分别用5μg抗IFNAR2（2道）、MHC I类（3道）或TNFR1（4道）的单克隆抗体或在无抗体的情况下（1道）培养3小时。与感染的MDBK细胞共培养（见图。在每毫升含有1μg相应抗体的情况下进行试验。在六个（第1和第2道）或两个试验（第3和第4道）中测定滴定度。条形图显示标准偏差。
然后使用重组人干扰素-α/β直接分析干扰素刺激细胞中wt和突变BRSV的行为。MOI为0.1时感染BRSV或NS缺失突变体的Vero细胞在感染后立即用增加量的IFN-αA/D或IFN-β进行处理，并在感染后3天测定病毒滴度。所有三个NS缺失突变体对干扰素诱导的细胞反应表现出高度相似、严重和剂量依赖性的敏感性，1500 U导致感染滴度降低了10000倍以上（图。). 相反，wt-BRSV对干扰素治疗有显著抵抗。然而，保护并不完全，1500 U IFN-α或IFN-β导致产量下降约13倍。
所有BRSV NS缺失突变体都对IFN-α/β敏感。在MOI为0.1时感染BRSV、BRSVΔNS1、BRSV-ΔNS2或BRSV△NS1/2的Vero细胞与指定数量的重组IFN-αA/D（A）或IFN-β（B）孵育。在感染后4天测定四个独立实验的感染病毒滴度。条形图显示标准偏差。
为了测试wt BRSV在牛细胞中的保护作用比Vero细胞更显著的可能性，我们在MOI为1的平行实验中感染了MDBK和Vero细胞，并添加了等量的IFN。在未经处理的MDBK和Vero细胞中，BRSV生长到1.7×10的滴度7和4×106PFU/ml（图。). 干扰素处理后，Vero细胞的滴度下降速度比MDBK细胞快。应用10000 U干扰素后，Vero细胞的感染滴度比MDBK细胞低555倍，尽管后者已经出现了严重的细胞损伤。正如NS缺失突变体的强烈抑制所证明的那样，MDBK细胞的抗病毒反应至少与Vero细胞的抗病毒反应一样强大。因此，wt BRSV对MDBK细胞的增强保护表明，BRSV可能比灵长类细胞反应更有效地应对牛细胞抗病毒反应。
BRSV在MDBK和Vero细胞中的IFN抗性。用rBRSV感染MDBK细胞（实心柱）或Vero细胞（开放柱），并用指定量的重组IFN-αA/D处理。感染后3天测定感染病毒滴度。条形图表示标准偏差。
BRSV NS1和NS2协同增强RV对干扰素介导的抗病毒反应的抵抗。
BRSV中每个NS基因的缺失导致对IFN介导的反应的敏感性大致相等，这表明两种NS蛋白都是对抗抗病毒机制所必需的。为了验证NS1和NS2的强制性合作功能，并确定这两种NS蛋白是否可用于保护无关病毒，我们产生了表达NS1（SAD VB-NS1）或NS2（SAD VB-NS2）的rRV。在减毒RV SAD L16的G和L基因之间引入附加基因（图。B） 如前所述，成功表达其他基因(12,39). 从表达转染质粒RV N、P和L蛋白的BSR T7/5细胞中的cDNA中拯救重组体。NS蛋白的表达对重组体在BSR细胞中的复制、生长特性和感染滴度没有明显的不利影响（数据未显示）。
为了研究表达的BRSV蛋白的活性，用亲本RV（SAD VB）或每个重组体在5倍的MOI下感染Vero细胞，或以2.5倍的MOI+SAD VB-NS1和SAD VB/NS2共同感染Vero电池。然后用增加数量的IFN-α处理受感染的培养物，并在感染后2天，在至少四个独立实验中分析感染性RV滴度的产生和RV蛋白的表达。来自单一感染的亲代RV SAD VB和NS1或NS2蛋白表达病毒的生长同样受到影响（图。A） ●●●●。应用50 IU的IFN-α后，滴度下降约1 log单位，然后随着IFN量的增加，滴度进一步缓慢下降，这表明Vero细胞的IFN反应较弱，或者RV对Vero细胞中IFN介导的反应具有较高的内在抗性。然而，在与表达NS1和NS2的病毒共同感染的细胞中，可以显示对病毒复制的保护作用。病毒滴度仍然显著高于单一感染，并且呈剂量依赖性缓慢下降。
与表达NS1和NS2的RV共感染的细胞中RV的IFN耐药性。Vero细胞（A）或MDBK细胞（B）感染了wt RV SAD VB、SAD VB-NS1或SAD VB/NS2或与SAD VB-NS1和SAD VB_NS2联合感染。感染后立即用指示量的IFN-αA/D处理培养物。感染后2天测定感染病毒滴度。结果表示至少四个独立实验的平均值，误差条表示标准偏差。
为了重新检查上述观察结果，即BRSV NS蛋白在对抗牛细胞抗病毒反应方面比Vero细胞更有效，在MDBK细胞中进行了平行实验（图。B） ●●●●。标准RV SAD VB和NS-表达重组体在未经处理的MDBK细胞中复制到的滴度略低于Vero细胞。与Vero细胞相比，干扰素治疗显著降低了来自单一感染的wt RV和NS-表达病毒的感染滴度。感染性滴度立即降低3个对数单位，表明IFN介导的反应非常有效。然而，在NS1和NS2蛋白共存的细胞中，病毒复制被完全保护，直到应用超过150 IU的干扰素（图。B） ●●●●。RV蛋白合成分析反映了这些结果。在未经处理的细胞中，所有重组体都产生了大量可比较的RV蛋白，而在IFN处理的细胞内，只有与SAD VB-NS1和SAD VB/NS2的复合感染才能导致大量的蛋白质合成，直到应用了150到200 IU以上（数据未显示）。
上述结果表明，这两种BRSV NS蛋白不仅能使BRSV对IFN介导的抗病毒反应产生耐药性，而且还能使其对另一种无关病毒产生耐药性。此外，他们证实，这两种NS蛋白都是发挥干扰素拮抗剂活性所必需的且足够的。
讨论
在本研究中，我们可以为BRSV的NS蛋白指定一个重要的生物学功能，即介导病毒从干扰素-α/β诱导的细胞抗病毒机制中逃逸。此外，我们发现这两种NS蛋白都是实现这一功能所必需的，并且其中任何一种单独都没有实质性活性。据我们所知，这是两种病毒蛋白强制性合作拮抗IFN的第一个例子。
在感染MDBK细胞后，首次观察到NS缺失突变体对宿主细胞因子敏感性增加的迹象，MDBK对wt-BRSV感染是完全允许的，并且其产生的wt-BRSV滴度高于任何其他测试的细胞系。与此形成鲜明对比的是，缺乏一个或两个NS基因的病毒在MDBK细胞中生长最差，而在其他细胞中，如Vero或BSR，缺乏NS基因只导致感染滴度中度（10倍）下降。共培养实验证实IFN-α/β是BRSV感染MDBK细胞产生的关键宿主细胞因子。显然，在受感染的MDBK培养物中，细胞的自分泌和旁分泌刺激可诱导抗病毒状态。虽然wt-BRSV能够抵消这种反应，但没有一个NS缺失突变体能够做到这一点。相反，Vero细胞缺乏IFN-α/β基因(15,46)因此，病毒感染不会导致诱导抗病毒状态，从而使NS缺失突变体生长。在Vero细胞中观察到的NS缺失突变体的生长比wt BRSV慢10倍，这可能是由于一些内在的抗病毒活性，或者更可能反映了NS基因产物对病毒复制的贡献。虽然不能产生IFN，但Vero细胞能够通过JAK/STAT信号通过IFN-α受体复合物（IFNAR）对外源性IFN刺激做出反应。由受感染的MDBK细胞分泌的牛IFN在Vero“应答者”细胞中诱导抗病毒反应，抑制NS缺失突变体的生长，但不抑制wt BRSV的生长。MDBK上清液引起的抗病毒作用被Vero细胞与阻断IFN与IFNAR结合的抗体孵育所消除。因此，IFN-α和/或IFN-β是MDBK细胞上清液诱导Vero细胞抗病毒反应的唯一活性成分。共培养实验还表明，BRSV NS蛋白的干扰素拮抗活性作用于干扰素反应而非诱导干扰素，因为wt BRSV、BRSV缺失突变体和RV鼠李病毒在效应细胞中诱导了类似的干扰物活性。
经MDBK细胞上清液处理的Vero细胞对NS缺失突变体的抑制作用较弱，双缺失突变体产量最多减少了7倍，因此与MDBK中NS缺失突突变体的严重抑制作用不可相比。这可能是由于各种因素造成的。用牛源异源干扰素刺激灵长类Vero细胞可能不如刺激MDBK细胞有效。与人类的情况类似，已鉴定出具有不同生物活性的不同类型的牛干扰素-α（2型至8型）和牛干扰物-β（1型和3型）(7). 此外，Vero细胞诱导的抗病毒机制似乎不如MDBK有效。来自受刺激和感染巨噬细胞的上清液分泌的IFN-α/β比其他细胞更多，导致Vero应答细胞中NS缺失突变体的产量减少了50倍。最后，通过用重组人IFN-αA/D或IFN-β刺激Vero细胞，可以剂量依赖性地抑制NS缺失突变体的复制，500 U几乎消除任何复制活性。
来自不同DNA病毒的一系列蛋白质（参考文献综述35)和RNA病毒(14,20,21,23,24,41,42)具有对抗干扰素作用的能力。一些病毒，如丙型肝炎病毒，似乎有多种蛋白能够独立靶向抗病毒机制(20,42). 然而，我们还没有准备好发现NS1和NS2都是完成干扰素拮抗剂活性所必需的，而每个蛋白质本身显然不具有任何活性。在所有细胞系中，缺失NS1或NS2或两个NS基因的缺失突变体的生长特性非常相似，这一观察结果很有吸引力。只有在涉及最低剂量活性干扰素的实验中，即使用MDBK效应细胞的共培养，才能怀疑NS1和NS2缺失突变体的差异行为。在这些实验中，NS1缺失突变体的平均减产量略低于NS2和NS1/2双缺失突变体；然而，这些实验的变异性很高，因此其意义值得怀疑。仅在MDBK细胞中观察到可重复的差异，在受感染细胞培养物分裂后，单缺失突变体的滴度可以比双缺失突变体高一些。然而，尚不清楚这是否应归因于NS蛋白在干扰素逃逸或RNA合成中的功能。
通过使用表达单个NS蛋白的rRV获得了最终证据，证明这两种蛋白都是必需的，并且足以干扰抗病毒状态的建立。BRSV NS1和NS2基因并排位于基因组的最上游位置（图。)这将导致BRSV感染细胞中的高水平和类似表达。因此，为了在BRSV感染的细胞中大致复制条件，在相同的MOI下对两种重组体进行rRV载体的联合感染。在感染单一重组体的细胞和同时感染两种重组体的电池中，应分别表达相当数量的NS1或NS2蛋白。然而，仅在复合感染细胞中观察到RV载体对IFN刺激的抵抗力显著增强。尽管干扰素治疗后，MDBK细胞中的标准RV滴度下降了3个对数单位，但在复合感染细胞中观察到了完全的保护作用。根据实验结果，干扰素剂量高达200 U左右的影响被完全抵消。由于共感染容易产生一些变异，我们怀疑，在适当的化学计量量下，NS蛋白的共表达受到更大的调节，可能会带来更大的保护能力。
用重组干扰素处理Vero细胞表明，全长BRSV不能完全抵抗灵长类细胞的干扰素反应。尽管灵敏度比NS缺失突变体低几个数量级（图。)，观察到wt BRSV滴度的剂量依赖性降低。然而，对牛MDBK细胞进行的平行实验显示，在达到极高剂量的干扰素且细胞损伤明显之前，其保护作用几乎是完美的（图。). 与BRSV一样，rRV载体对MDBK细胞的作用更为显著。从BRSV NS缺失突变体和wt RV在MDBK细胞中的严重抑制来看，很明显，MDBK细胞的抗病毒反应机制至少与Vero细胞的抗病毒反应机制一样有效。这可能表明BRSV的NS蛋白已经与牛宿主一起进化，以最佳地对抗牛细胞的抗病毒反应。据报道，BRSV的人类对应物HRSV对IFN诱导的人类细胞抗病毒活性具有高度耐药性(2)HRSV NS蛋白似乎被优化以对抗人类细胞的IFN反应。
病毒蛋白的适应性以抵消其天然宿主细胞的固有反应是决定病毒宿主范围的一个重要因素，并可能防止病毒跨越物种屏障(13,22,26). 例如，猿猴病毒5（SV5）的V蛋白能够阻止灵长类细胞中IFN应答基因的激活，但在小鼠细胞中不能(14). 这可能是阻止小鼠，甚至SCID小鼠产生性SV5感染的主要因素(13).
事实上，NS蛋白对宿主对RSV感染的许可性的贡献可能至关重要，并可能解释为什么密切相关的病毒显示出高度受限的宿主谱。BRSV和HRSV能够进入人、牛和小鼠细胞；然而，NS蛋白或多或少有效对抗宿主特异性先天反应的差异能力可能会决定病毒是否被清除。这也得到了以前的观察结果的支持。HRSV在小鼠原代胚胎细胞中的生长受到明显限制；然而，当抗鼠干扰素血清添加到培养基中时，病毒产量增加，感染在整个单层中传播(26). 此外，重组BRSV（其中G和F表面蛋白基因被HRSV对应物取代）在黑猩猩中的复制能力略高于BRSV。然而，感染仍然受到高度限制，不足以诱导对同源HRSV攻击的任何保护(6). 根据我们的观察，我们得出结论，BRSV NS蛋白在对抗灵长类IFN应答方面的低效性是宿主范围的主要决定因素。
我们的发现对设计有效的RSV减毒活疫苗具有重要意义。建议按照之前的建议删除NS1或NS2(5,43,48)，导致病毒过度衰减，无法逃避任何干扰素反应。例如，有希望的方法是BRSV和HRSV NS蛋白的相互交换。这可能会产生BRSV和HRSV疫苗，它们分别具有中等能力逃避牛和人的先天反应。此外，还可以确定NS蛋白的突变仅部分破坏干扰素拮抗活性。
进一步的研究将揭示NS蛋白如何合作以及它们如何干扰抗病毒反应。此处所述的RV载体应该特别有用，因为它们提供了独立于迄今为止它们在BRSV复制中可能具有的未知功能来研究NS蛋白功能的可能性。
致谢
我们感谢Stefan Finke对手稿的批判性阅读，感谢西班牙马德里的J.A.Melero和英国康普顿的G.Taylor提供RSV抗体。
这项工作得到了德国联邦公报（SFB 455-A3）和欧洲委员会（EC 5th FP-RSV Vac，QLK2-CT-1999-00443）的部分支持。
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