《维罗尔杂志》。2001年12月；75(24): 12241–12251.
塔卡里布病毒基因组和抗原类似物的转录和RNA复制需要N和L蛋白：Z蛋白是这些过程的抑制剂
阿根廷布宜诺斯艾利斯C1414DEM Serrano 669，动物病毒中心（CONICET）
接收日期：2001年4月30日；2001年9月6日接受。
摘要
塔卡里布病毒（TV）是新世界沙粒病毒群的原型，由一个单一的系统发育谱系和四个南美出血性疾病的致病性产生菌组成。TV基因组由两个称为S和L的单链RNA片段组成。建立了基于质粒提供的TV-like RNA和TV蛋白的重组转录-复制系统。质粒表达由重组痘苗病毒提供的T7 RNA聚合酶驱动。构建质粒以产生含有氯霉素乙酰转移酶（CAT）负义拷贝的TV S片段类似物，该序列位于S基因组（小基因组）或S抗原组（小抗原组）的5′和3′非编码区的序列两侧。在表达N和L蛋白的细胞中，输入分别产生的小基因组或小抗原组，包被小抗原组或小基因组，然后产生子代小基因组或子代小抗原组。在N和L介导的转录存在下的小基因组和小抗原基因组，分析为CAT表达。小环指Z（p11）蛋白的共表达对小基因组或小抗原基因组介导的转录和复制都具有高度抑制作用。这种影响取决于Z蛋白的合成，而不是质粒或RNA，并不是因为质粒提供的模板或蛋白质（N或L）数量减少。N和L蛋白足以支持质粒提供的S基因组模拟物的全周期RNA复制，其中CAT取代了N基因。Z表达也抑制了该RNA的复制。
塔卡里布病毒（TV）是新世界沙粒病毒群的原型。在这一组中，病毒形成了三个系统发育上不同的分支，其中一个包括TV和四种已知的南美病原体，它们会导致严重出血性疾病（朱宁病毒、马丘波病毒、瓜纳利托病毒和沙比亚病毒）(5). 然而，电视似乎不是人类的病原体。
与所有沙粒病毒一样，TV是一种包膜病毒，其遗传信息包含在两个单链RNA片段中，分别称为S（约3.4 kb）和L（约7.1 kb）。S RNA包含两个基因，分别编码核蛋白（N，64kDa）和糖蛋白前体（GPC）（55kDa(10). L RNA还含有两个编码假定RNA依赖RNA聚合酶（L蛋白，240kDa）的基因(16)和一种带有环指基序的小蛋白（Z，11kDa；该蛋白最初命名为p11[17]). S和L RNA中的基因排列方向相反，由一个非编码序列分开，该序列有可能以发夹的形式形成稳定的二级结构(11)（S RNA的组织如图所示。A） ●●●●。尽管沙状病毒基因组和抗原的5′区是阳性链，但事实上它们并没有直接翻译成蛋白质。相反，基因组和抗原只能作为与N蛋白紧密结合的核衣壳被发现(11,20)，编码序列由基因组或抗原的3′区转录的mRNA表达(2,11,26). 这些mRNAs在其5′端含有短段非模板化核苷酸，当它们与抗癌抗体反应时，似乎被覆盖(20). TV中的转录终止发生在远端发夹的底部。这决定了转录物3′端的发夹结构，该结构被认为是终止转录的信号(18). 与其他负链RNA病毒类似，假设L与N一起构成病毒聚合酶，当该蛋白与核衣壳结构中的RNA相关时。对TV-infected细胞提取物与Z抗血清免疫缺失的研究表明，该蛋白是TV转录和RNA复制所必需的(13). 然而，最近有报道称，在转染含有氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因的淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）样RNA的细胞中，仅表达N和L的细胞产生CAT活性(21). Z也可能在沙粒病毒生物学中发挥其他作用，正如最近关于Z与几种细胞蛋白相互作用的报告所表明的那样(三,4,7).
示意图（不按比例）显示了TV S RNA的组织和表达（箭头表示RNA合成的方向）（A）和用于生成TV RNA类似物的质粒（B）。显示了T7聚合酶启动子（T7Pr）、HDV Rz和T7 RNA聚合酶终止子（Tφ）的位置。按照材料和方法进行施工。pGenCAT转录本（842 nt）包含（5′至3′）整个TV S基因组5′NCR序列（68 nt），短连接子（16 nt）包括Sna公司BI位点，S基因组基因间区（IGR）的一个短序列（nt 1614至1633），不涉及发夹结构(18)CAT ORF为反义取向（660 nt），S基因组3′NCR全序列（76 nt）。pAgenCAT转录本（810 nt）包含（5′至3′）整个TV S抗原组5′NCR序列斯纳BI位点、反义方向的CAT ORF和完整的S抗原3′NCR。pS-GenCAT（2343 nt），包含TV S基因组的（5′至3′）nt 1至1633，随后是CAT的负义拷贝和整个S基因组的3′NCR序列。转录物的大小是指加工的RNA，其中包括5′端的两个非病毒G(23). 核苷酸被编号为1 S基因组的5′末端。开放线表示阳性编码区域；负值编码区域用变黑的粗线表示。S RNA IGR用黑框表示，3′和5′NCR末端用阴影框表示。显示了DNA构建物组装中使用的关键限制性内切酶位点。
重组质粒提供的RNA和蛋白质的转录和RNA复制将为分析顺式-作用于RNA基因组的信号，如RNA合成的包被、起始和终止所需的信号，并将使每个TV蛋白都可用于反向遗传分析。
在本研究中，我们描述了基于质粒提供的TV RNA和蛋白质的重建系统的建立。使用该系统，我们证明（i）S基因组和S抗原组5′和3′末端的非编码序列包含所有顺式-转录、RNA复制和封装所需的作用信号；（ii）N和L蛋白都足以驱动由S基因组和抗原样RNA介导的转录和全周期复制；（iii）Z蛋白是一种有效的转录和复制抑制剂。
材料和方法
细胞和病毒。
CV1细胞在补充有5%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（GIBCO-BRL，马里兰州盖瑟斯堡）中生长。表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3由B.Moss（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）善意提供(12). 每个细胞常规感染3-5个vTF7-3 PFU，因此90%以上的细胞受到感染。一份TV工作库存，如前所述准备(19)以每细胞1个PFU的多重感染率感染CV1细胞，并在感染后2天制备细胞提取物，此时病毒积极参与转录和复制(19).
表达TV-like RNA的质粒。
质粒构建在转录载体pTV2.0中，这是阿拉巴马大学伯明翰分校Andrew Ball的慷慨捐赠。该载体提供了一个T7 RNA聚合酶启动子序列，该序列位于斯图I限制站点和唯一Sma公司丁型肝炎病毒核酶序列（HDV Rz）位于T7聚合酶终止序列（Tφ）之前的I位点5′(23). 为了消除囊I位点来自pTV2.0，质粒用囊一、 用Klenow治疗，并重新进行治疗。修改后的向量，命名为pTV2.0(囊我−)，用于构建两个转录TV S基因组类似物的质粒（pGenCAT和pS-GenCAT）和一个表达TV S抗原组类似物的质粒（pAgentCAT）（图。B） ●●●●。pGenCAT的构建如下：TV S RNA的5′和3′区域，分别包含核苷酸（nt）1至334和3031至3422（数字表示相对于基因组序列5′端的位置）(10,18)使用来自TV感染细胞的总RNA通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增。将对应于S基因组5′区的PCR产物插入斯图pTV2.0的I站点(囊我−)T7 RNA聚合酶启动子下游，与3′区对应的基因插入Sma公司I位点，HDV Rz序列的5′。该结构命名为p13-6Nco公司一、 最后用Klenow处理以填充，并用囊I.使用裂解位点（分别对应于TV S基因组的nt 67和3381）将CAT开放阅读框（ORF）定位在T7 RNA聚合酶启动子的反义极性中，如下所示：CAT ORF是使用质粒pCAT3-Basic Vector（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）通过PCR获得的作为模板和包含（5′至3′）短连接子序列的正向引物斯纳BI位点（插入用于克隆目的），一个与TV-S基因组的nt 1614至1633相对应的序列，以及一个与CAT ORF的位置660至636互补的序列。反向引物设计为CAT ORF将取代TV N ORF，包含（5′至3′）一个与TV S基因组nt3390至3347互补的序列以及CAT ORFnt1至27。PCR产物用囊一、 纯化，并插入如上所示切除的p13-6中。为了产生质粒pS-GenCAT，首先将完整的TV S基因组序列克隆到pTV2.0中(囊我−)通过插入Nco公司我-英国标准时间质粒p2b2的EII DNA片段(10)转化为用相同酶消化过的p13-6。然后使用合成的质粒（pS-Gen）引入CAT ORF而不是N ORF。为此Sna公司商业智能-囊pGenCAT中的I片段被克隆到之前被切割的pS-Gen中囊二、 用Klenow治疗，用囊I.pAgenCAT的构建如下：如上所述，通过RT-PCR扩增TVS RNA的5′和3′区域，并克隆到pTV2.0中(囊我−)因此，将对应于S抗原组5′区的PCR产物直接插入T7 RNA聚合酶启动子下游，将对应S抗原组3′区的片段直接克隆到HDV Rz序列上游。质粒命名为p15-2，用于将CAT ORF插入T7 RNA聚合酶启动子的反义方向。通过PCR从pCAT3-Basic载体中扩增出CAT ORF，该正向引物包括（5′至3′）一个与TVS基因组3388至3347位互补的序列和4 nt，该序列完成了一个完整的序列斯纳BI位点（为克隆目的添加），后面是CAT ORF的nt 660至638的互补序列。反向引物由TVS基因组的nt60至68和CAT ORF的nt1至30组成（5′至3′）。PCR产物用Nco公司我和囊并插入用相同酶裂解的p15-2。
表达TV蛋白的质粒。
表达TV L、N和Z蛋白的质粒（分别命名为pL、pN和pZ）构建如下：（i）为了构建pL，L ORF由质粒p96和p14工程化。这些质粒包含插入物，分别覆盖相对于L基因组5′端161-2240和2025-7102的位置(16). 为了在克隆过程中充当p96和p14插入物之间的桥梁，使用来自TV-infected细胞的总RNA，通过RT-PCR扩增了一个覆盖L基因组nt1586到2806的区域。反向引物包括巴姆HI站点位于其5′端。RT-PCR产品用斯纳BI和巴姆HI并克隆到p96中斯纳BI和巴姆HI，后一个位点对应于p96的聚链接体。用酶消化产生的质粒Pvu公司II和巴姆HI，用于插入Pvu公司二-巴姆从p14中切除HI片段。最后一个建筑最终被消化了巴姆HI和Sma公司一、 将含有完整L ORF和L AUG非编码区（NCR）5′的22 nt的6669-bp片段插入pGEM-4（Promega）的相应位点。（ii）为了构建pN，通过切割p2b2获得了一个包含完整的N ORF和N起始密码子NCR 5′的31 nt的DNA片段(10)带有囊一、 用Klenow治疗，用Sma公司I.然后将该片段克隆到先前用Sma公司I.（iii）为了构建pZ，将覆盖整个Z ORF和Z起始密码子NCR 5′的43 nt的cDNA（由瑞士日内瓦大学D.Kolakofsky善意提供）克隆到Sma公司pGEM-3的I位点。（iv）质粒pZmut是pZ质粒的一个突变体，其中Z起始密码子被终止密码子取代。该突变是以质粒pZ为模板，用含有（5′至3′）生态RI限制位点之后是L基因组的nt 27到93，其中包括70和71位的变化。这导致Z起始位点被终止密码子取代（UAG为AUG）。反向引物含有（5′至3′）a巴姆HI位点之后是L基因组nt372-354的互补序列。将PCR产物插入生态RI公司-巴姆T7 RNA聚合酶启动子下游pGEM-3的HI位点。质粒结构通过接合处的DNA测序进行验证。PCR获得的DNA片段全部测序。所有质粒均使用Qiagen Tip-100（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen Inc.）进行纯化。
放射标记、免疫沉淀和蛋白质凝胶电泳。
将转染或感染TV的CV1细胞进行放射标记，如图图例所示。和，如下所示。采集细胞，使用单特异性血清对每种蛋白质进行放射免疫沉淀(25)如前所示，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析(22).
病毒感染和质粒转染细胞中TV蛋白表达的分析。CV1细胞感染TV（车道TV）、vTF7-3（车道VV）或vTF7-3，并转染pGenCAT、pL和pN的混合物，如材料和方法（车道混合）中所示，不含（a和B）或添加10 ng（C，车道1）或100 ng（C、车道2）的pZ。C中的Lanes Z和Mut对应于感染vTF7-3的细胞，并分别转染1μg pZ或1μg pZmut。将转染细胞培养18小时，将TV感染细胞培养40小时，然后用[35S] 制备半胱氨酸（150μCi/ml）和细胞提取物。在标记时，TV感染细胞和转染细胞都积极参与转录和复制（见材料和方法）。用单特异性血清免疫沉淀细胞质提取物，以对抗N（A组）、L（B组）或Z（C组）蛋白。免疫沉淀蛋白（对应2×105每个通道的细胞）在含有10%（A）、7%（B）或17%（C）聚丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶上分离，然后使用增感屏（Biomax、Kodak）直接接触X射线胶片2、6和4天（分别为A、B和C板）。分子质量14C标记标记（车道M）以千道尔顿表示。
Z蛋白表达对N或L蛋白合成的影响。CV1细胞（4×105)用vTF7-3感染，并用2μg pGenCAT、2μg p N和50 ng pL（Mix）转染显示（+）的人，如图所示，未添加或添加10、25或50 ng pZ。转染后24小时，用以下混合物标记细胞1.5小时[35S] 半胱氨酸（80μCi/ml）和[35S] 制备蛋氨酸（80μCi/ml）、细胞质提取物，并用针对N（αN）或L（αL）蛋白的单特异性血清免疫沉淀蛋白质。免疫沉淀蛋白（相当于2×105用含有12%（αN）或7%（αL）聚丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶。使用增感屏（Biomax，Kodak）将凝胶暴露在X射线胶片上。分子质量根据14C标记标记显示在右侧。
DNA转染。
将CV1细胞亚流入单层在37°C下感染vTF7-3 1 h。根据制造商的规范，去除接种物，清洗细胞，然后使用脂质体2000试剂（GIBCO-BRL）转染细胞。具体来说，添加的质粒数量约为4×105在12孔培养皿中培养的细胞如下：每孔2μg小基因组或小抗原基因组质粒、2μg pN和50 ng pL。转染pS-GenCAT后，质粒数量增加到2.6μg/孔。转染pZ和pZmut的量在相应的图例中显示如下。通过添加适量的空pGEM-3 DNA，转染DNA的总量保持不变。在这些转染条件下，CAT活性的积累（数据未显示）和通过TV聚合酶扩增质粒提供的模板（见图。)持续至少2天。
质粒提供的小基因组或小抗原组的复制。CV1细胞亚流培养物感染vTF7-3，并转染pGenCAT（A）或pAgenCAT（B）和pN和/或pL，如图所示。在转染后24小时（1至3、6和7道）和40小时（4、5、8和9道），纯化总RNA（1至5道）或核衣壳相关RNA（Nc RNA，6至9道）并通过Northern印迹分析。将重复的印迹与反义CAT核糖探针[CAT（−）]（上面板）或正义CAT核糖探针[CAT（+）]（下面板）杂交。胶片曝光30小时，但下部面板中的1至5道除外，该面板曝光3小时。面板左侧的箭头指示由TV聚合酶或T7聚合酶合成的RNA的位置。标记RNA（Promega）的大小（以千为单位）显示在面板的右侧。
CAT分析。
电池（约4×105)用冰镇磷酸盐缓冲盐水清洗两次，用TNE（10 mM Tris-HCl[pH7.4]，150 mM NaCl，1 mM EDTA）清洗一次，刮取TNE，离心回收。通过三次冷冻和解冻循环，在60μl 250 mM Tris-HCl（pH 7.4）中溶解细胞。通过离心（13000×克在4°C下加热5 min），在65°C下通过加热10 min使内源性CAT失活。为了进行分析，将5μl细胞提取物与0.2μCi的[14C] 氯霉素（57 mCi/mmol；新英格兰核公司，马萨诸塞州波士顿），15μl 4 mM乙酰辅酶A（英国白金汉郡小查方Amersham Pharmacia Biotech）调整为250 mM Tris-HCl（pH 7.4），总体积130μl，并在37°C下培养1小时。用19:1氯仿-甲醇展开的升华薄层色谱法（TLC）分析CAT分析的产物，然后进行放射自显影。测定测定的细胞提取物量，使测定在酶活性的线性范围内（非乙酰化氯霉素转化为单乙酰氯霉素的转化率小于30%）。CAT活性是通过测定单乙酰化氯霉素种类计数相对于总计数的百分比来计算的，通过切割适当的TLC片和在闪烁液中计数来实现(14).
RNA分析。
通过Chomczinski和Sacchi程序在指定时间纯化感染转染细胞的总RNA(8). 为了获得核衣壳相关RNA，将细胞刮入低温磷酸盐缓冲盐水中。在TNEN（含0.2%Nonide P-40的TNE）中溶解颗粒细胞，离心后回收细胞质部分。免疫选择包被的RNA如下：对于每个样品，将35μl蛋白A-Sepharose 4B快速流动（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）与25μl N蛋白抗血清在室温（RT）下孵育90分钟，总体积为100μl。用冷TNEN洗涤四次后，将抗体偶联蛋白A-Sepharose混合物与细胞裂解物（6×105总体积为300μl）的细胞在室温下放置30分钟，然后在4°C下放置60分钟。将含有免疫选择核衣壳的珠子按上述方法洗涤六次，并用1%十二烷基硫酸钠处理，相关RNA用苯酚提取，并用70μg tRNA作为载体进行乙醇沉淀。当抗体偶联珠相对于细胞提取物的比例增加两倍时，回收的RNA数量保持不变，表明免疫选择是在限制条件下进行的。如图所示。当这一程序应用于TV-感染细胞的细胞质提取物时，对免疫选择RNA的分析只显示基因组和抗原基因组，而不显示亚基因组RNA。
TV感染细胞免疫选择和总RNA的Northern blot分析。按照材料和方法中的描述，用TV感染细胞。如材料和方法所示，对核衣壳（Nc）进行免疫选择，并从感染细胞提取物中提取Nc相关RNA和总RNA。RNAs通过Northern blotting分析32分别检测S基因组和GPC mRNA或S抗原组和N mRNA的P-标记的负义GPC或N核糖探针。28S rRNA与总RNA制备中的基因组和抗原组RNA共迁移导致这些RNA的迁移率高于从免疫选择核衣壳中提取的基因组和抗原性RNA的迁移。
纯化RNA（对应3×105每个泳道的细胞）在含有2.2M甲醛的1.5%琼脂糖吗啉丙磺酸凝胶上分离，并按照制造商的指示转移到Hybond-N膜（Amersham Pharmacia Biotech）上。在含有50%甲酰胺、5×SSPE（1×SSPE为0.18 M NaCl、10 mM NaH2人事军官4、1 mM EDTA）（pH 7.7）、5×Denhardt溶液、0.5%十二烷基硫酸钠、100μg煮沸鲑鱼精子DNA/ml和100μg酵母tRNA/ml。32然后将P标记的核糖探针直接加入杂交袋中，并在65°C下杂交18小时。过滤器在2×SSPE中各清洗两次，每次10分钟，室温下清洗0.1%十二烷基硫酸钠，随后在1×SSPE、65%℃下清洗15分钟，然后分别在0.1×SSPE和65℃下清洗两次10分钟。将滤光片与胶片（BioMax film；Kodak，Rochester，N.Y.）接触，并在−70°C下使用增感屏。
通过线性化pGEMCAT的体外转录，使用SP6或T7聚合酶和[32P] CTP公司。通过将CAT ORF（无任何TV序列）插入SP6和T7启动子之间的pGEM-3载体获得该质粒。阳性或阴性CAT探针均获得了类似的总掺入。利用线性化的pGEMGPC和pGEMN质粒以及SP6聚合酶合成GPC和N核糖探针。
结果
目前关于砂状病毒复制的模型假设基因组和抗原都是RNA复制和单个mRNA转录的模板（图。，S RNA）。砂型病毒基因组和抗原组的3′端序列高度一致。具体来说，TV-S基因组和抗原组在nt 20之前是相同的，但位置6和8除外，而TV-L基因组的前20 nt和抗原组只在位置8上有所不同。在nt 21之后，没有序列相关性。由于这些保守序列，基因组和抗原RNA在3′端和5′端之间具有高度互补性，因此可能形成泛柄结构(11). 基因组和抗原组3′端的保守一级序列（或3′端和5′端之间的保守碱基配对）更可能代表转录和复制的保守启动子。这些序列也可能指定新生RNA中的封装信号。假设这个假设是正确的，含有基因组或抗原组3′和5′末端序列的质粒衍生的TV-like RNA应在表达病毒转录-复制蛋白的细胞中转录和复制。为了获得这些模板，我们构建了质粒pGenCAT和pAgenCAT（图。). pGenCAT指导合成一个TV S基因组模拟物，该模拟物包含报告CAT基因的负义拷贝，在其5′端和3′端由TV S基因组的5′和3′NCR序列侧翼。pAgentCAT表达TV S抗原组类似物，其中负义CAT编码序列在其5′和3′端被S抗原组的5′和3′NCR序列包围。这些构建是在T7 RNA聚合酶启动子下游的转录载体pTV2.0中进行的。如Pattnaik等人所示(23)pTV2.0允许获得转录RNA的精确末端。5′端由T7启动子相对于插入物的位置决定，而转录的精确3′端由插入物下游的HDV Rz介导的自催化裂解产生（图。B） ●●●●。由pGenCAT和pAgenCAT表达的TV-like RNA分别称为小基因组和小抗原基因组。
编码可能参与转录和复制的TV蛋白的基因——假定的RNA聚合酶（L）、核衣壳蛋白（N）和Z蛋白——在T7 RNA聚合素启动子的控制下克隆。为了分析这些质粒表达的蛋白质，将每个质粒转染到感染了痘苗病毒vTF7-3的CV1细胞中，表达T7 RNA聚合酶，以驱动质粒表达。在感染后18小时，用单特异性血清对每个蛋白进行放射免疫沉淀后，通过代谢标记和SDS-PAGE检测质粒表达蛋白。同时分析TV-表达蛋白。如图所示。，质粒表达蛋白显示出与真TV蛋白相同的电泳迁移率。
质粒表达TV蛋白对小基因组和小抗原基因组的转录。
由小基因组或小抗原基因组介导的转录被分析为CAT表达。在将小基因组或小抗原基因组与支持质粒一起转染后，只有通过TV聚合酶识别RNA并转录到消息感RNA中，才能检测到CAT活性。CAT mRNA分别从包含的小基因组或小抗原组拷贝，CAT起始密码子的5′，N mRNA的5′NCR或GPC mRNA（图。). 这些序列具有70%的整体一致性，每个起始密码子都被一个非常有利于真核核糖体启动的序列包围(10). 这意味着从小基因组或小抗原组转录的CAT mRNA的翻译效率将非常相似。在初步实验中，我们检测了在表达L和N的细胞中转染小基因组或小抗原时CAT的活性。然后，我们研究了转染质粒的数量和比例，以获得最高水平的CAT活性。当质粒提供的模板（小基因组或小抗原组）和pN以约40的pN/pL比率等量转染时，获得了最佳条件（见材料和方法）。在这些条件下，质粒转染细胞中N和L蛋白的表达水平低于TV感染细胞中的表达水平，转染细胞和TV感染的细胞中N与L的比例非常相似（图。A和B）。
实验如图所示。在获得最大报告基因表达的最佳条件下进行。用vTF7-3感染细胞，然后用pGenCAT转染细胞，表达微基因组（图。A） 或与pAgenCAT结合，表达小抗原组（图。B） 以及编码TV L、N和Z蛋白的质粒的各种组合。在转染后24小时，制备细胞提取物并测定CAT活性。在分别表达L、N或Z蛋白的细胞（1、2和3道）或表达Z与L或N结合的细胞（4和5道）中，CAT活性无法检测到。在同时表达N和L的细胞中，很容易检测到CAT的表达（通道6），表明L和N是最小的反式-由小基因组或小抗原组介导的CAT表达所需的作用病毒因子。三个独立实验的估计表明，转染的小抗原组产生的CAT活性是输入的小基因组产生CAT活性的4-7%（未显示）。出乎意料的是，在表达L和N的细胞中加入10 ng pZ后，由小基因组或小抗原基因组介导的CAT活性显著降低，与100 ng pZ共转染几乎消除了CAT表达（第7和第8道）。小基因组或小抗原组表达的CAT活性几乎同样降低（图。C） ●●●●。
检测由小基因组或小抗原组介导的CAT活性。用pGenCAT（A）或pAgenCAT（B）转染重复培养皿，如图所示，添加（+）或不添加（-）pN和pL。当包括pZ或pZmut时，其数量以纳克表示。在转染后24小时，制备细胞提取物，测定CAT活性，并按照材料和方法中的描述分析反应产物。胶片曝光18小时（A）或48小时（B）。（C） 在三个独立的实验中量化了从小基因组（▴）或小抗原基因组（●）表达的CAT活性，其中细胞被转染为6至8道。获得的平均值显示为未添加pZ的相应值的百分比。
然后，我们研究了与Z质粒共转染相关的抑制是否取决于Z蛋白的表达能力，或者抑制效果是否可能是Z质粒转染或Z mRNA合成的伪影。为了区分这些可能性，我们首先突变pZ，以阻止Z蛋白的合成。这是通过用终止密码子替换Z起始位点来实现的。正如预期的那样，用突变质粒（指定为pZmut）转染的细胞中没有表达Z蛋白，而原始质粒产生Z蛋白（图。C） ●●●●。当评估pZmut对CAT活性的影响时，发现与10 ng和100 ng pZmut共同转染的细胞中CAT的表达没有减少，而这些量的pZ的加入强烈抑制了CAT的表现（图。，将泳道7和8与泳道9和10进行比较）。注意，pZ的抑制与极少量转染质粒有关，并且在放射免疫分析几乎检测不到的Z蛋白合成水平上观察到（图。C） 并且低于通过蛋白质印迹的检测极限（结果未显示）。有趣的是，当抑制效应发生时，转染细胞中表达的Z蛋白相对于N或L的比例低于在TV感染细胞中观察到的比例（图。，A至C）。
RNA包被和复制。
CAT mRNA的转录表明，添加的模板（小基因组或小抗原组）以核衣壳结构的形式与N蛋白相关，与L蛋白一起形成功能性核衣壳。然后我们推测这些假定的核衣壳是否也支持RNA复制。因此，在复制的第一步中，质粒提供的小基因组将产生一个包被CAT（+）小抗原组，该小抗原组将作为RNA复制的第二步的模板，即生成子代包被小基因组。相反，质粒提供的小抗原组首先会产生包被CAT（+）小基因组，该基因组将作为合成子代包被小抗原组的模板。为了分析RNA复制，我们进行了如图所示的实验。编码微小基因组的质粒（图。A） 或小抗原组（图。B） 与支持质粒一起转染到感染了vTF7-3的CV1细胞中，以驱动质粒表达。使用的转染质粒数量是先前发现的最适合CAT表达的质粒数量。在转染后24小时和40小时，直接从一组转染孔中提取细胞内总RNA，而用于核衣壳分析的细胞提取物是从重复转染中制备的。用对TV N蛋白的抗体选择性免疫沉淀核衣壳，然后纯化免疫沉淀中的RNA。该程序被证明对TV核衣壳的分析是可靠的，因为只有TV基因组和抗原基因组总是包被的(18)-存在于免疫沉淀中，而排除了mRNA（图。). 然后使用股特异性探针通过Northern印迹分析细胞内总RNA和核衣壳相关RNA。
为了使从所提供的模板复制的RNA产物可视化，图中上部面板所示的印迹。与32P标记的阴性CAT核糖探针。微基因组和微抗原基因组的转染将分别产生CAT（+）微抗原基因组和CAT（＋）微基因组。此外，每个输入模板都会转录CAT mRNA。由于质粒提供的RNA不包括被认为负责转录终止的基因间区（IGR）发夹结构(18)CAT mRNA和相应的复制产物大小相同（约800 nt），因此，在分析总RNA时无法区分（1到5道）。如通道3和5所示，在同时表达N和L蛋白的细胞中出现了TV聚合酶产物预测的大小和极性带，但在单独表达N或L蛋白时没有出现（通道1、2和4）。事实上，一部分CAT（+）RNA产物与N蛋白结合形成核衣壳（第7和第9道），这表明源自小基因组或小抗原组的重组系统支持RNA复制的第一步，即产生包被的小抗原组或包被的微基因组，分别是。
为了识别子代微基因组和子代微抗原基因组以及任何质粒表达的RNA，将Northern blots与阳性CAT核糖探针杂交（图。，下部面板）。对总细胞RNA（1到5道）的分析显示，一条带的迁移速度比正确大小的小基因组或小抗原组的预期稍慢。该条带的出现与L或N是单独表达还是共表达无关。这些大于预期的RNA的估计大小与未分离小基因组或未分离小抗原基因组T7转录本的预测大小一致（约1000 nt）。质粒提供的小基因组或小抗原组的水平非常相似，在转染后40小时每种水平都会下降。在同时表达N和L的细胞中（泳道3和5），在转染后40小时，当T7转录物的背景降低时，清楚地检测到小基因组或小抗原组预测大小的条带。核衣壳相关RNA分析（6至9道）证实，小基因组或小抗原基因在表达TV聚合酶复合物（N和L）的细胞（7道和9道）中积累，但在单独表达N的细胞（6道和8道）中没有积累。在后一种细胞中，即使在胶片过度曝光后，也没有检测到大小正确的RNA。在最早的转染后时间，富含核衣壳的部分显示出几乎无法检测到的未切割T7转录物水平（泳道6和7）（注意，泳道6至9的膜暴露的时间是泳道1至5的10倍）。这些结果表明，质粒提供的模板以较大的未分离形式在细胞内积累，并且这些RNA没有包被。结果还表明，裂解和包被的质粒表达模板数量太低，无法检测，因为检测到的唯一包被的小基因组或小抗原基因组是通过TV聚合酶扩增的（图。，下部面板，将车道6和8与车道7和9进行比较）。
pZ共转染对RNA复制的影响。
我们还检测了pZ共转染对RNA复制的影响。在图中所示的实验中。如图所示，质粒提供的模板（小基因组或小抗原基因组）由支持质粒pN和pL补充，无论是否有表达Z（pZ）的质粒。pZ的加入量显示为抑制转录，以CAT活性测量。与负义CAT核糖探针杂交（图。A、 上面的面板，通道1至4）显示，与10 ng和100 ng pZ共转染导致转染的小基因组中核衣壳相关CAT（+）小抗原组的积累越来越少。在分析总细胞RNA时，也检测到Z的抑制作用（5到7道）。如图所示。B、 pZ包涵体同样减少了来自转染小抗原组的核衣壳相关CAT（+）小基因组的积累。
pZ共转染对RNA复制的影响。将先前感染vTF7-3的CV1细胞的亚流培养物转染小基因组（A）、小抗原组（B）或pS-GenCAT（C）以及带有或不带有pL的pN。当包含pZ时，其数量以毫微克表示。转染后24小时获得总RNA（A，5至7道），而在转染后40小时免疫选择核衣壳相关RNA（Nc RNA；A和B，1至4道；C，1至5道）。然后通过Northern印迹分析纯化的RNA。将重复的印迹与反义CAT核糖探针[CAT（−）]（上面板）或正义CAT核糖探针[CAT（+）]（下面板）杂交。箭头显示了由TV聚合酶或T7聚合酶（T7转录物）合成的RNA的位置。“kb”表示并行解析的RNA标记的大小。在面板A和B中，胶片曝光20小时，但第5至7（A）车道除外，该车道曝光2小时。在面板C中，胶片暴露4天。
与阳性CAT核糖探针的杂交证实了上述结果，表明这两种基因包被了小基因组（图。A） 和包被的小抗原组（图。B） 代表通过TV聚合酶扩增的RNA，因为它们仅在包含L时出现（第1和第2道），并证明与pZ共转染降低了子代微基因组和子代微抗原基因组积累（第2至第4道）。细胞总RNA分析（图。A、 通道5至7）表明，虽然由于pZ内含物，小基因组的积累减少了，但未分离的T7转录物的数量保持不变。这表明pZ共转染导致的RNA复制水平降低不能归因于质粒提供的模板数量减少。
考虑到小基因组和小抗原基因组不包括IGR序列，并且其长度约为TV S RNA长度的25%，我们试图检测更接近真实TV S基因组的TV RNA类似物的复制，并研究pZ内含物对这一过程的影响。为此，我们构建了质粒pS-GenCAT（图。)，其表达TV S基因组类似物，其中负义N ORF被CAT的负义拷贝取代。pS-GenCAT与支持质粒pN和pL共同转染（图。C） 产生预测大小的正向CAT RNA，S-AgentCAT（+），其被包裹（上图，泳道2）。省略pL时，未检测到该RNA的合成（通道1和5）。在与阳性CAT核糖探针杂交的印迹中（下面板），S-GenCAT预测大小的包被RNA仅出现在表达TV聚合酶复合物（N+L）的细胞中（比较通道1、2和5）。与pZ共转染抑制了S-AgenCAT（+）和子代S-GenCAT的产生（通道2至4）。
最后，考虑了pZ共转染抑制T7聚合酶表达质粒合成N和L蛋白的可能性。如图所示。pZ的加入量对转录和复制产生实质性抑制，但并不影响聚合酶复合物蛋白的表达。
讨论
在本文中，我们报道了基于质粒提供的TV RNA和蛋白质的转录和复制系统的建立。使用该系统，我们证明在同时表达N和L蛋白的细胞中，每个基因组或抗原组的3′和5′NCR序列足以促进转录（以CAT活性测量）和复制（以核衣壳形成分析）。与其他负链RNA病毒一样，在沙粒病毒中，核衣壳应作为转录和复制的功能模板。这意味着在重组系统中，质粒提供的RNA应该被包被以形成活性模板。当Northern杂交以检测质粒提供的RNA时（图。)，我们检测到大量与未分离核酶相关的T7转录物预期大小的RNA积累。这些RNA没有被封装，表明正确的3′末端序列对封装至关重要。然而，尽管同时存在转录和N蛋白合成（通道2、4、6和8），但无法检测到正确大小的质粒转录微基因组或微抗原。这些结果可能是由于转录物的低自分裂效率和裂解产物的快速降解所致。我们发现，由pGenCAT或pAgenCAT在体外转录的RNA中，只有不到1%是自动处理的（未显示）。其他作者报告说，由T7 RNA聚合酶转录的RNAs可能被非常低效地包裹(9,23,24). 然而，一部分质粒提供的RNA被包埋，其数量足以启动复制（也可能是转录），如L存在下RNA的大量积累所示（图。，车道3、5、7和9）。电视聚合酶复制的产物很容易被包裹。总之，在表达L和N的细胞中，对输入的小基因组或输入的小抗原基因组进行扩增，分别产生小抗原基因组或小基因组，然后对其进行封装和扩增，产生子代小基因组或子代小抗原基因组。类似地，小基因组L和N蛋白（而非Z）支持S基因组类似物的全周期复制，其中N基因已被CAT取代（图。C） ●●●●。这种RNA的复制效率略低于小基因组。这种行为的一个可能原因可能是T7转录本的自分裂效率很低。重建系统复制RNA的另一个特征值得进一步评论，即无论输入模板是什么，基因组的积累程度似乎大于抗原。迄今为止，在所有实验中都反复观察到这一点，主要是在转染后40小时，此时电视聚合酶发生了多轮全周期复制（即图。A和B车道9和图。，通道2至4，比较下部和上部面板）。在这一方面，重组系统的RNA复制似乎反映了TV RNA复制，因为在感染细胞中，S基因组总是比S抗原组丰富（未发表的观察结果）。
基因组和抗原组都指定转录信号，如CAT活性所证明，由小基因组或小抗原组介导。然而，在用微小抗原组转染的细胞中，CAT活性占表达微小基因组的细胞中CAT活性的不到10%。由于CAT mRNAs的翻译效率相似，CAT表达较低意味着由小抗原组介导的转录水平较低。这一结果很可能反映了聚合酶转录的模板在细胞内的不同积累，因为小抗原组积累占小基因组积累的5%至20%（图。，下部面板，比较面板A和B中的通道7和9；此外，图。，下部面板，比较面板A和B中的通道2）。这可能是一种可行的基因表达调控机制。
我们对TV的研究结果与最近的一项发现一致，即LCMV L和N蛋白足以支持CAT的表达，并从包含3′和5′末端以及S基因组IGR的LCMV基因组模拟物合成阳性CAT RNA(21). 我们进一步证明了顺式-转录、复制和包被所需的作用信号包含在S基因组或S抗原组的3′和5′NCR序列中。此外，在我们的系统中重新建立全周期RNA复制，使得分析LCMV重组系统研究中未考虑到的转录和复制的某些特征成为可能。
使用重组系统，我们证明了TV-Z蛋白是由小基因组和小抗原基因组介导的RNA复制的有效抑制剂，输入的pZ质粒浓度为每皿100 ng，几乎抑制复制（图。). Z抑制效应并不局限于小复制子，因为包含S基因组所有非编码序列的较大TV-like RNA的复制也受到类似影响（图。). 我们的结果还表明，Z影响转录，分析为CAT表达（图。). 然而，由于RNA复制涉及通过TV聚合酶对质粒提供的模板进行广泛扩增（图。和)，不可能确定CAT活性降低是由于对mRNA合成的直接影响，还是由于RNA复制减少导致转录模板可用性降低的间接影响（图。). 我们的结果确实排除了某些导致pZ共转染效应的微小可能性。研究表明，pZ的抑制依赖于Z蛋白的合成，而不是依赖于pZ转染或Z RNA合成的干扰，因为用终止密码子替换Z起始密码子可以消除Z效应（图。). 此外，与pZ共转染并不影响质粒提供的模板或复制和转录所需蛋白质的合成（图。和). 值得注意的是，Z的抑制作用与放射免疫沉淀几乎检测不到的Z表达水平有关，并且Z与L或N的比值低于在TV感染细胞中观察到的值（图。). 综上所述，我们的结果支持了这样的观点，即Z的影响可能是一种实际的影响，在电视感染期间可能起作用。Z的抑制作用并不局限于TV，因为最近有报道称，LCMV Z蛋白在LCMV微基因组模型系统中强烈抑制转录和复制（T.Cornu和J.C.de la Torre，《第20届年会文摘》，Am.Soc.Virol.，《文摘》，W48-8，2001）。可以发现其他负链病毒编码具有负调控作用的蛋白质的先例，包括仙台病毒(6)，呼吸道合胞病毒(1)和本扬韦拉病毒(27).
编码负调控蛋白可能是沙粒病毒复制和基因表达缓慢，并容易在其自然宿主和培养细胞中建立持续感染的原因之一。为了支持这一观点，我们想提及以前的结果，这些结果表明，与产生与病毒基因高表达相关的细胞病变感染的病毒株相比，产生以病毒RNA和蛋白质合成水平低为特征的非细胞病变感染病毒株中含有较高比例的Z到L RNA(19).
与我们的结果不同的是，N和L足以支持重建系统中的转录和复制，Garcin等人(13)建议两个过程都需要TV Z。这一结论得到了以下发现的支持：用Z抗血清对TV-infected细胞提取物进行免疫耗竭，可显著降低mRNA和S基因组合成，而Z表达细胞提取物可恢复这些活性。考虑宿主细胞因子在沙粒病毒复制中的可能意义(15)最近的研究表明，LCMV Z与几种细胞蛋白相互作用(三,4,7)，这些结果的一个可能解释是，对TV-infected细胞提取物的TV-Z抗体治疗可能因其与Z的相互作用而耗尽，Z是RNA合成所需的细胞激活剂，Z表达的细胞提取物可能已经恢复了这种活性。然而，很难解释提取物中的Z蛋白缺乏抑制作用。在这方面，应该考虑到在真实感染中，Z的作用是在实验前2天从感染细胞制备的提取物中研究的，RNA合成的测量可能反映了体内已经启动的RNA链，而在重组系统中，我们从复制过程开始就添加Z，并评估其对多轮RNA复制的影响。在这两种条件下，Z与病毒和细胞蛋白之间的相互作用可能有很大不同。Garcin等人的结果之间可能存在明显差异(13)这项研究中的报道仅仅反映了对病毒和细胞蛋白在沙粒病毒复制周期中的作用缺乏了解。
本报告中描述的系统为研究TV转录和复制的分子基础及其调控打开了可能性，并为建立TV及其密切相关病原体的救援系统提供了基础。这将有助于研究特定突变的衰减效应，并可能最终促进新疫苗的产生。
致谢
我们非常感谢安德鲁·鲍尔（伯明翰阿拉巴马大学），他慷慨地提供了质粒pTV2.0。我们还感谢D.Kolakofsky（瑞士日内瓦大学）提供编码Z蛋白的cDNA。
这项工作得到了ANPCyT和CONICET的资助。我们还感谢巴戈实验室（阿根廷）的财政支持。N.L.和M.T.F.-F.是CONICET的研究人员。R.J.是该机构奖学金的获得者。
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