呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是世界范围内儿童严重呼吸道疾病最重要的病原体。呼吸道合胞病毒（RSV）作为老年人呼吸道疾病的一个重要病因也越来越受到重视；免疫功能低下的患者，如骨髓移植受者；在普通人群中（参考文献中回顾16). RSV再感染很常见，尽管该病不太严重。目前还没有获得许可的RSV疫苗，但使用RSV中和抗体的被动免疫预防现在可用于高危婴儿(2).
RSV是该家族的一种非片段负链RNA病毒副粘病毒科RSV编码11种蛋白质（参考文献综述8,15、和16)即三种跨膜表面蛋白（G、F和SH）；病毒基质蛋白M；核衣壳和聚合酶蛋白N、P、M2-1和L；推测的转录-复制调节因子M2-2；以及两种非结构蛋白NS1和NS2，它们被认为是I型干扰素抗病毒状态的拮抗剂(31). 虽然先天免疫系统和适应性免疫系统的许多组成部分有助于限制和解决RSV感染，但先前感染引起的对再感染的抵抗力增加似乎主要由RSV特异性分泌抗体和血清抗体介导(16,17,27). F和G糖蛋白是RSV中和的主要抗原(17).
在20世纪60年代，在婴儿和儿童中评估的福尔马林灭活RSV疫苗没有保护作用，并且自相矛盾的是，在随后的自然RSV感染期间，与疾病的频率和严重程度增加有关(26). 现在可以理解，最初的疫苗接种是为了在随后的自然感染过程中再次接触病毒抗原时发生的免疫介导的致病性反应而准备的，尽管这种现象的细节尚未完全阐明。有一个因素似乎与CD4的Th2亚群的过度诱导有关+以白细胞介素4（IL-4）和IL-10分泌增加为特征的T辅助淋巴细胞(18). 在实验动物中，由RSV F和G蛋白组成的亚单位疫苗也与RSV攻击后增强的肺部病理学有关(22,28,35). 其他研究表明，CD4的过度诱导+同时诱导CD8，RSV抗原的T淋巴细胞被消除+T淋巴细胞，表明后者具有调节作用(23,32). 因此，不平衡的CD4+-RSV蛋白疫苗观察到的T细胞反应可能是由于它们在刺激CD8方面效率低下+T淋巴细胞。相反，强大的CD8+-与自然RSV感染相关的T细胞反应可提供调节作用，解释自然再感染期间免疫介导疾病增强缺乏的原因(35). 这将是基于感染减毒RSV的疫苗策略的一个重要优势(36).
儿童严重呼吸道合胞病毒病的高峰期在2到9个月之间，因此，在此之前应接种呼吸道合胞菌疫苗。不幸的是，由于免疫不成熟和母体来源的呼吸道合胞病毒特异性血清免疫球蛋白G（IgG）介导的免疫抑制，该年龄组的免疫反应降低(36). 研制成功RSV减毒活疫苗的另一个挑战是在保持足够免疫原性的同时达到适当的减毒和安全水平。最近对RSV候选疫苗的临床研究表明，这一目标可以实现(36). 然而，由于即使是自然感染也不能赋予实体免疫，我们一直在研究通过表达一个或多个插入病毒基因组的基因中的一个或更多细胞因子或趋化因子来修改免疫反应的可能性。两种可能的理想结果是增强免疫反应和减弱病毒。另一种可能性是，在生命早期感染可能会对“培养”不成熟的免疫系统产生普遍有益的影响(30)一种或多种适当的细胞因子或趋化因子的表达可能会增强这种作用。
我们之前描述了一种重组RSV（rRSV），该病毒表达小鼠IFN-γ，来自位于RSV基因组G和F基因之间的多余基因，我们证明了这种细胞因子介导的病毒衰减和免疫反应增强(11). 表达IL-2的可比rRSV具有相似但较小的作用(12). 在本研究中，我们构建了一种表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）的可比rRSV。这种细胞因子特别令人感兴趣，因为它介导树突状细胞和巨噬细胞的分化和成熟，这对先天免疫和适应性免疫都很重要。几个小组建议使用GM-CSF作为疫苗佐剂，在DNA免疫期间从质粒表达或作为可溶性蛋白提供(1,5,20,21,25,29,37). 负链RNA病毒反向遗传学的发展使我们能够探索将GM-CSF作为插入活rRSV的额外基因表达的方法。在目前对小鼠的研究中，rRSV表达mGM-CSFs与病毒复制减弱有关，增强肺抗原提呈细胞的增殖和激活，增强肺CD4的刺激+T淋巴细胞。
材料和方法
重组病毒的构建和繁殖。
我们购买了一个cDNA，两侧是Mlu公司我和英国标准时间BI位点，编码成熟的124-氨基酸形式的mGM-CSF，缺少17-氨基酸信号肽（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。该cDNA的上游端通过插入Hin公司dIII型-Mlu公司I窗口紧邻合成DNA的mGM-CSF编码序列上游，依次包含圣诞节I位点，RSV转录基因启动信号，以及GM-CSF编码序列框架中信号肽的编码序列。该合成DNA片段是通过退火以下两个寡核苷酸形成的：AGCTT公司CCCGGG公司自动变速箱GGGCAAAT公司ATGTGGCTGCAGATTTACTTTCCTGGGCATTGGTCTACACTCTCGCTCCCG一个和CGCGT公司CGGAGCTGAGGCTGTGAGTCTGAGACAACATGCCCAGGAAAAATATTCTGCAGCACAT公司ATTTGCCC公司自动变速箱CCCGGG公司一个（该圣诞节I限制性内切酶位点用斜体表示，RSV基因起始序列用下划线表示，信号肽编码序列紧随下划线序列之后开始，以及有助于Hin公司dIII和Mlu公司I限制网站以黑体显示）。对cDNA的下游末端进行修饰，以添加RSV基因末端信号和圣诞节通过插入到英国标准时间商业智能-巴姆HI窗口通过退火以下两个寡核苷酸形成的合成双链DNA：CGAA公司TGCAAAAACCAGTCAAAAAATAA公司AGTTATTAAAA公司TT公司中建集团G公司和关贸总协定科科斯群岛CGGG公司AA公司TTTTT AATAACT公司TTATTTTGGACTGGTTTTTGCA公司TT公司（RSV基因末端信号下划线圣诞节I限制网站是斜体的Bst公司BI和巴姆HI限制站点以粗体显示）。工程cDNA的序列得到了完全确认。
这个圣诞节将含有mGM-CSF转录盒的I片段插入RSV抗原组的cDNA中，该抗原组经修饰后含有一个独特的圣诞节G和F基因之间的I位点(9)（图。). 这使编码的抗原组RNA的长度从15223个核苷酸增加到15688个核苷酸。通过将抗原基因质粒与表达N、P、L和M2-1支持蛋白的质粒共转染到感染了表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒的HEp-2细胞中，可恢复编码的重组病毒rRSV/mGM-CSF(14).
表达mGM-CSF的两种rRSV的基因组RNA图，即rRSV/mGM-CSF和rRSV/6120/mGM-CSF。在每种病毒中，由mGM-CSF ORF组成的转录盒在RSV基因启动和基因结束转录信号（上框）的控制下插入圣诞节I位点位于rRSV的G-F基因间区。GM-CSF ORF的起始密码子和终止密码子以粗体显示，圣诞节I限制性内切酶位点用斜体表示，RSV基因开始和结束信号用下划线表示。如下框所示，这两种病毒仅在各自rRSV主干的SH基因上有所不同。rRSV/mGM-CSF的主干是前面描述的wt rRSV的主干(14)修改为包含圣诞节G-F基因间区的I位点(9). 在rRSV/6120/mGM-CSF的主干中，SH基因被修改为（i）在SH ORF的最后四个密码子中包含五个翻译沉默的核苷酸替换，（ii）从SH基因的下游非翻译区域（下框）删除112个核苷酸（nt；位置4499到4610）。这个Xho公司我和派克靴构建中使用的I位点（材料和方法）用斜体表示并标记，SH基因末端信号用下划线表示，SH密码子显示为三联体，核苷酸替换用小写，删除的序列用指示的序列位置装箱。
我们还使用经修饰的抗原cDNA构建了第二个版本的mGM-CSF重组体，从而删除了SH基因的大多数下游非编码区，氨基酸水平没有变化。具体来说，141-bpXho公司我-派克靴从SH开放阅读框（ORF）末端到SH基因末端信号的I窗口（图。)被以下两种寡核苷酸形成的合成DNA取代：TCGAG公司TtAATACtGa型TAAAGTAG公司TTAAT公司和TAA公司CTACTTTA公司tcAaGTaTTaA公司C类（部分Xho公司我和派克靴I限制性位点用黑体字表示，SH ORF和终止密码子的核苷酸用下划线表示，无声的核苷酸变化用小写表示）。编码的病毒在SH ORF的最后三个密码子和终止密码子中有沉默的核苷酸替换，并且在SH下游非翻译区有112个核苷酸的缺失，使基因末端信号保持完整。mGM-CSF表达盒完全按照上述rRSV/mGM-CSF的方法插入该主干。得到的重组病毒命名为rRSV/6120/mGM-CSF，其亲本对应物命名为rRSAV/6120。
病毒在含有5%胎牛血清（FBS；Summit Biotechnology）的Optim-Mem培养基（Life Technologies）中的HEp-2细胞中繁殖。rRSV/mGM-CSF用于如图所示的实验中。（另请参见图。对于另一个实验），以野生型rRSV作为对照病毒；用于动物研究（见图。)，病毒通过在SW28转子（加州富勒顿贝克曼·库尔特）中以25000 rpm在4°C下进行差速离心1小时来浓缩。rRSV/6120/GM-CSF用于图1所示的实验中。和（在其他实验中[见图。到])以亲本rRSV/6120为对照病毒。
HEp-2细胞中rRSV/mGM-CSF、rRSV/CAT和wt-rRSV的生长动力学。每个细胞用2个PFU感染细胞单层（每个病毒两个复制孔），取200μl等分培养基，在指定的时间点用新鲜培养基替换。这些样品被快速冷冻，随后通过斑块试验测定感染病毒的滴度。显示了每个时间点的两个单层的平均值。
在BALB/c小鼠中复制rRSV/6120/mGM-CSF和rRSV/6220。用指定剂量（104, 105、或106rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的每只动物的PFU）。如图所示，在第3天、第4天或第5天，每个时间点处死六只动物；采集肺和鼻甲组织；用菌斑滴定法测定病毒滴度。误差条表示标准误差。
感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的BALB/c小鼠RSV特异性血清抗体的滴度。小鼠被模拟感染（单独使用培养基）或以指定剂量（104, 105、或106rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的每只动物的PFU，作为图中所示的两个实验（1和2）的一部分。28天和56天后收集血清样本，通过糖蛋白特异性ELISA分析F或G糖蛋白的特异性IgG，并在有补体的情况下使用60%斑块减少试验分析RSV中和抗体。显示了平均滴度。每个ELISA滴度是八只动物的平均值（±SE），中和滴度是六到八只动物。
通过核糖核酸酶保护试验检测肺细胞因子和趋化因子mRNA。动物（每组20只）被模拟感染或感染10只6第0天每只动物的rRSV/mGM-CSF或wt rRSV的PFU。在第1天和第4天，每组每个时间点处死5只小鼠，并使用特定于选定细胞因子和趋化因子的混合探针通过RNase保护分离和分析总肺RNA。其余的动物被感染106第28天wt RSV的PFU；在第29天和第32天，每组每个时间点处死5只小鼠，并以相同的方式分离和分析总肺RNA。（A） 显示第4天分离的mRNA的一个探针试剂盒mCK-2B的结果的自动放射自显影图，每个凝胶通道代表一个单独的小鼠，非杂化探针混合物平行运行作为标记，单个探针的核苷酸长度显示在左侧。与单个细胞因子或管家基因L-32相对应的受保护探针位于右侧。IL-1Ra、IL-1受体拮抗剂；巨噬细胞迁移抑制因子MIF；IL-12 p35和p40分别是IL-12的组成单体和诱导单体。（B） IFN-γ的肺mRNA和二聚IL-12的诱导性p40单体的积累。通过磷光成像对如面板A所示的自动放射自显影进行量化，并以相同样本中L-32管家基因mRNA数量的百分比进行计算。显示了每种病毒每天五只小鼠的平均值（含SE）。请注意，每个年轴具有不同的比例。
分析感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的BALB/c小鼠的RSV-特异性CTL反应。在第0天，各组小鼠感染了指示的病毒或模拟感染，在第5天（未显示）、第9天和第21天（未示出），每组分别处死2只（模拟感染）或5只（病毒感染）动物，并进行CTL分析。其余动物在第31天接受wt-rRSV鼻内感染，6天后处死2只（模拟感染）或4只（病毒感染）动物进行CTL分析。从肺（左）和脾（右）分离出单核细胞，用M2-1在体外刺激82–90肽，并检测与M2-1孵育的P815靶细胞的细胞毒活性82–90肽（+）或未收到肽（−）。
流式细胞术分析PMC的三个部分，即区域R2、R3和R4，如图所示。B、 用于表达MHCII分子。每组四只动物中的一只小鼠感染后第5天和第8天的结果。显示每组4人MHCII表达的中位数（上限值）和平均值（下限值）（±SE）。
HEp-2细胞产生的GM-CSF的测量。
复制的单层细胞被rRSV/mGM-CSF、rRSV/6120/mGM-CSF-一种表达氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因（rRSV/CAT）的rRSV感染[9])，或wt rRSV。在96小时内每隔一段时间从培养基中取样，并使用Quantikine M小鼠GM-CSF免疫测定法（R&D Systems）通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定mGM-CSF的浓度。
病毒在体内的复制和免疫原性
在轻度甲氧基氟烷麻醉下，于第0天用rRSV/6120/mGM-CSF、rRSV/6120或单独培养基经鼻感染11周龄无色素呼吸雌性BALB/c小鼠。在实验1中，小鼠接受1060.1-ml接种物中每只动物的PFU，每组6只动物用CO处死2第4天。采集鼻甲和肺部，并通过斑块滴定法检测感染性RSV(28). 在实验2中，各组小鼠接受10剂量6, 105、或104两种病毒的PFU。每组6只小鼠在第3天（10天）被处死6仅适用于组）、4（所有组）和5（106收集鼻甲和肺组织，并通过斑块滴定法检测感染性RSV。为了监测血清抗体反应，上述每个实验还包括（i）一个未感染的对照组和（ii）每个实验组中另外八只动物，分别在第0天、第28天和第56天采集血清样本。用糖蛋白特异性ELISA测定RSV F或G蛋白的血清抗体(28)，和RSV中和抗体是在补体存在的情况下通过60%的斑块减少测定来测量的(13).
用逆转录（RT）-PCR检测小鼠肺中mGM-CSF mRNA。
在感染rRSV/mGM-CSF或wt-rRSV后的第4天，从BALB/c小鼠肺部分离的总RNA使用引物AGAAGGTTTAAGGCTGTC逆转录，该引物特异于GM-CSFmRNA序列的537至556位（GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X02333”，“term_id”：“51103”}}X02333型). 使用上述寡核苷酸作为直接引物和反向引物R1（GTGGTCTACGCTCTCCAGC）进行PCR，该反向引物对GM-CSF mRNA位置207至226或R2（GTGGCCTACTCCAGCT型)，其序列与引物R1相同，只是在3′端（粗体）有一个额外的T碱基，该T碱基对构建物中使用的合成GM-CSF cDNA（R&D系统）中的沉默突变具有特异性。首先进行2分钟的变性步骤，在此过程中塔克添加DNA聚合酶，然后进行30个PCR周期（变性，94°C下1min；退火，45°C下1 min；伸长率，72°C下2 min）。在2.5%琼脂糖凝胶上分析产品。
肺细胞因子mRNA分析。
20只BALB/c小鼠经鼻感染10只6rRSV/mGM-CSF或wt rRSV的PFU或Opti-MEM培养基模拟感染的PFU。感染后第1天和第4天，每组5只小鼠被一氧化碳处死2通过均质和Trizol（Life Technologies）提取，采集并处理窒息和肺组织，以纯化肺总RNA。每组剩下的10只动物在第28天通过鼻腔注射106每只动物体重rRSV的PFU。在攻击后第1天和第4天（首次感染后29天和32天），每组五只动物被处死，并采集总的肺RNA。每只老鼠的材料都是分开处理的。根据说明书，使用RiboQuant多探针RNase保护分析系统（PharMinen）通过RNase防护方法对细胞因子mRNA进行定量。简单地说，小鼠细胞因子mRNA特异性RNA探针标记有[32P] 使用多探针模板集mCK-1和mCK-2B合成UTP，并在56°C下将每个探针集分别与肺mRNA或对照小鼠总RNA和酵母RNA杂交过夜，然后用RNase A和蛋白酶K处理。剩余的RNA用苯酚和氯仿纯化，并在5%聚丙烯酰胺测序凝胶上电泳，同时用未经处理的探针作为标记。使用PhosphorImager 445 SI对放射性带进行定量，减去背景，并将每个物种表达为同一RNA样品中L-32持家基因mRNA的百分比。
肺和脾单核细胞（PMC和SMC）的分离。
在献祭后，将肺和脾脏切除，并分别处理每只小鼠的材料。用3500 Dornase U的DNase I（Calbiochem）/ml和75 U的胶原酶（Life Technologies）/ml在37°C下清洗、切碎肺，并消化2小时，调节至0.01 M EDTA，在冰上冷冻，并通过100μM孔径的尼龙单丝布（PGS）过滤。将细胞制成颗粒，重新悬浮，并在Ficoll-Paque Plus溶液（Amersham Pharmacia Biotech）中以400×克收集PMC界面，清洗两次，并将其重新悬浮在5 ml含有10%FBS、100 U青霉素/ml和100μg硫酸链霉素/ml的RPMI 1640培养基（Life Technologies）中。为了纯化SMC，将脾脏冲洗、捣碎、清洗，并在上述Ficoll-Paque Plus溶液中进行差速离心。
RSV特异性肺和脾细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的检测。
BALB/c小鼠（每组每天5只）感染10只6rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的PFU或被模拟感染。在感染后第5天、第9天和第21天按上述方法分离PMC和SMC，并按以下方法进行分析。在第31天，剩余的小鼠接受10只6wt-rRSV的PFU，并在第37天（攻击后6天）分离细胞并进行分析。将新鲜分离的细胞孵育过夜后测量细胞溶解活性(7)含肽SYIGSINNI，代表M2-1蛋白的82-90氨基酸(27).51Cr标记的P815靶细胞用1μM RSV特异性肽脉冲2小时。将肽标记或未标记的靶细胞与PMC或SMC混合，并在37°C下培养4 h。分析分为三次进行，比溶百分数计算如下：[（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发发布）]×100。通过添加5%Triton X-100溶解的细胞上清液测定最大释放量。在无效应细胞培养的靶细胞中测定自发释放(6).
肺CD4的细胞内细胞因子染色和流式细胞术分析+细胞。
为了刺激细胞内细胞因子的积累，将新鲜分离的PMC（分别来自每只小鼠）在37°C下，在2.5 ng佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（Sigma）/ml、250 ng离子霉素（Sigma/ml）和6.5μl高尔基停止试剂（PharMinen）/ml的存在下孵育4小时。将DNase I添加到最终浓度3500 Dornase U/ml，并继续培养10分钟。将细胞造粒并重新悬浮在冷细胞染色缓冲液（FBS）（PharMinen）中。阻止Fc受体，细胞在106每100μl与1μg纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32（FcγIII/II受体）结合，并在4°C下孵育15分钟。然后，对细胞进行稀释、造粒和清洗，并添加1μg三色共轭大鼠抗小鼠CD4克隆CT-CD4的IgG2a（Caltag Laboratories）。将细胞在4°C下培养30分钟，清洗，同时通过在250μl Cytofix/Cytoperm溶液（PharMinen）中再悬浮来固定和渗透，在4°C下培养20分钟，并用PermWash溶液（PhorMinen）双重清洗。为了检测累积的细胞因子，将细胞重新悬浮在100μl PermWash中，并按初步实验中优化的量添加以下两种荧光标记抗体：（i）抗小鼠IFN-γ克隆XMG1.2（PharMinen）的荧光素异硫氰酸盐（FITC）结合大鼠IgG1和（ii）R-藻红蛋白（R-PE）结合大鼠IgG2b对抗小鼠IL-4克隆BVD4-1D11（PharMinen）。将细胞在黑暗中4°C下培养30分钟，然后依次用PermWash和细胞染色缓冲液（FBS）清洗，再分别悬浮在500μl细胞染色缓冲溶液（FBS。染色的特异性通过同型控制和用5μg相同抗体的未结合制剂预孵育30分钟（4°C）进行封闭来确认。FITC-结合IFN-γ特异性IgG1大鼠抗体的同型对照为FITC-偶联大鼠IgG1-克隆R3-34（PharMinen），而三色偶联CD4特异性大鼠Ig G2a抗体的对照为偶联大鼠-IgG2a克隆LO-DNP-16（Caltag Laboratories）。使用FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）进行流式细胞术分析，如前所述对淋巴细胞进行门控(24). 每个样本共分析60000个淋巴细胞，不包括死细胞。
肺树突状细胞和巨噬细胞的流式细胞术分析。
如上文所述，对单个小鼠的PMC进行处理以阻断Fc受体，并与同时添加的以下荧光色素的预定最佳量相结合：（i）FITC-标记的抗小鼠CD11b（克隆M1/70；PharMinen），（ii）R-PE标记的抗鼠CD11c（克隆HL3；Pharminen），以及（iii）生物素标记的抗老鼠i-Ad日/I-E公司d日（克隆2G9；PharMinen）。将细胞在4°C的黑暗中孵育30分钟，加入别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素（PharMingen），并在4°C的黑暗中再孵育30分钟，用Hanks平衡盐溶液-2%FBS洗涤两次，通过重悬在250μl Cytofix缓冲液（PharMingen）中固定，并在4°C孵育20分钟，又洗了两次。进行流式细胞术分析，每个样本分析100000个细胞（不包括死细胞）。
结果
表达mGM-CSF的rRSV的构建和体外特性。
将编码mGM-CSF的cDNA置于RSV转录基因起始和结束信号的控制下，并插入RSV抗原基因cDNA克隆的G-F基因间区（图。). 回收重组病毒并命名为rRSV/mGM-CSF。
对HEp-2细胞中rRSV/mGM-CSF的生长进行了检测，发现与平行检测的wt rRSV亲本相比，其生长延迟并减少，感染后40小时的最大差异为34倍（图。). 然而，rRSV/mGM-CSF在体外的生长动力学与rRSV/CAT的生长动力学没有区别，rRSV/CAT是一种先前描述的重组体，含有编码细菌CAT的735核苷酸转录单位（相比之下，目前的mGM-CSF插入物为465 nt）插入同一基因组位点。我们之前已经注意到，外来插入物的存在会减弱RSV在体外的复制，而与其编码蛋白无关(9–12). 这种衰减的基础尚未详细表征，但似乎是基因组长度的增加。
Northern杂交用于监测插入的mGM-CSF基因以及RSV G、F和L基因的表达（数据未显示）。这证实了mGM-CSF基因以预期大小的单独、丰富的mRNA表达。附加基因对其他基因的转录没有显著影响。此外，对体外第10代感染的HEp-2细胞分离的病毒RNA进行RT-PCR分析，没有发现插入物中有任何缺失的证据（数据未显示），这表明插入物是稳定的，正如在重组单核病毒中观察到的插入物一样。感染后48小时，分泌到感染HEp-2细胞培养基中的mGM-CSF浓度约为1μg/ml（数据未显示），其表达水平与先前研究中的IFN-γ和IL-2类似(11,12).
rRSV/mGM-CSF病毒在体外的生长减少阻碍了用于小鼠接种的足够滴度的储备的制备。对于一个实验（图。)rRSV/mGM-CSF通过离心浓缩，但由于RSV感染性的不稳定性，这导致总滴度的大量损失。在这项工作进行的同时，我们制备了另一种rRSV，称为rRSV/6120，其中SH基因的大多数下游非编码区被删除，氨基酸水平没有任何变化（见材料和方法）。rRSV/6120在体外的复制效率大约是其全长rRSV亲本的五倍，可能是由于112-核苷酸的长度减少。因此，我们将mGM-CSF转录盒插入rRSV/6120主干并恢复编码的病毒rRSV/6120/mGM-CSF。该病毒与rRSV/mGM-CSF相同，但SH基因中存在上述非编码缺失。正如预期的那样，它在体外的复制效率大约是rRSV/mGM-CSF的五倍（未显示），分泌到细胞培养基中的mGM-CSF浓度与rRSV/mGM-CSB的浓度完全相同（未显示的）。rRSV/6120/mGM-CSF用于体内实验（图。,,,、和和表)以亲本rRSV/6120为对照病毒。
用总PMC流式细胞术分析感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的BALB/c小鼠肺部树突状细胞和巨噬细胞。（A） 前向散射的总PMC的细胞轮廓显示R1区域，该区域富含巨噬细胞和单核细胞样细胞，淋巴细胞耗尽。（B） 基于CD11c与CD11b的表达，对rRSV/6120/GM-CSF（左）或rRSV/6220（右）感染后第5、8和9天从小鼠分离的PMC的R1部分进行点图分析。确定了三个区域：CD11b低的/CD11c公司明亮的（R2区；淋巴树突状细胞），CD11b明亮的/CD11c细胞明亮的（R3区；髓系树突状细胞）和CD11b明亮的/CD11c公司低的（R4区；巨噬细胞）(4,33,34). 每天，每组四只小鼠的细胞分别进行处理和分析；每个图代表从每组一只小鼠分离的细胞分析。（C） 在感染rRSV/6120/GM-CSF或rRSV/6220或模拟感染后的第5天、第8天和第9天从小鼠中分离出的PMC总数R2、R3和R4区域中的总数（每只小鼠），如面板B所分析的。这是通过将每个细胞群的百分比乘以每个小鼠的PMC总数量来计算的。结果是基于感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6220的每组四只小鼠和模拟感染的每组两只小鼠的平均值（±SE）。rRSV/6120/mGM-CSF和rRSV/6220之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.05），对于除CD11b外的所有3天的所有三个细胞群低的/CD11c公司明亮的第9天的细胞。
表1
肺总CD4的流式细胞术分析+从模拟感染或感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的小鼠中分离的细胞一
| 天 | rRSV/6120/mGM-CSF
| rRSV/6120型
| 嘲弄
|
|---|
| 项目管理咨询公司b条 | CD4细胞+
| 项目管理咨询公司 | CD4细胞+
| 项目管理咨询公司 | CD4细胞+
|
|---|
| 总计c（c） | 干扰素-γ+d日 | 白介素-4+d日 | 总计 | 干扰素-γ+ | 白介素-4+ | 总计 | 干扰素-γ+ | 白介素-4+ |
|---|
| 5 | 151.2 ± 0.08* | 79.08 ± 2.00* | 2.44 ± 0.34† | 1.58 ± 0.08* | 55.60 ± 0.15 | 17.55 ± 1.73 | 0.57 ± 0.06 | 0.16 ± 0.02 | 12 | 2.51 ± 0.49 | 0.03 ± 0.00 | 0.02 ± 0.00 |
| 10 | 204.7 ± 16.99 | 86.24 ± 8.49 | 9.21 ± 1.16‡ | 0.93 ± 0.15§ | 265.6 ± 65.5 | 80.84 ± 17.33 | 5.40 ± 1.35 | 0.44 ± 0.09 | 61.0±11 | 18.05 ± 3.55 | 0.23 ± 0.05 | 0.08 ± 0.02 |
| 32 | 119.5 ± 21.1 | 56.86 ± 8.26 | 4.11 ± 0.37 | 1.60 ± 0.58 | 105.5 ± 0.60 | 50.27±5.62 | 3.35 ± 0.36 | 1.36 ± 0.14 | 57 | 11.97 | 0.31 | 0.17 |
| 38 | 47.5±7.8 | 20.24 ± 2.82 | 4.93 ± 0.67 | 0.20 ± 0.04 | 51.0 ± 4.0 | 21.73 ± 1.35 | 5.48 ± 0.41 | 0.16 ± 0.01 | 77.0 ± 20.0 | 18.28 ± 4.03 | 1.85 ± 0.41 | 0.36 ± 0.09 |
与rRSV/6120相比，rRSV/6120/mGM-CSF在小鼠体内的复制显著减弱。
rRSV/6120/mGM-CSF在体内的复制通过BALB/c小鼠的鼻内感染与其wt等效物rRSV/6120的复制平行进行评估，之后处死动物，并通过斑块测定测定肺和鼻鼻甲中的病毒滴度（图。). 在一个实验中（图。，实验1），每只动物感染106第4天采集病毒PFU和组织。在第二个实验中（图。，实验2），动物组接受相同剂量，106在第3、4或5天处死PFU和进行病毒定量，以检查感染的时间进程。其他动物组收到10份5或104在第4天处死PFU和进行病毒滴定，以检查较低接种量后病毒复制的程度。
在所有时间点和所有剂量下，rRSV/6120/mGM-CSF在上呼吸道和下呼吸道的滴度均显著低于rRSV/6120(P（P）<0.001，在任何时间点和任何剂量）。例如，剂量为106PFU中，两种病毒之间的差异是10到74倍，这取决于位置、时间点和特定实验，但第5天的肺部除外，当时的差异是588倍。我们之前的研究表明，在该部位存在这种大小的外源性插入物并不能在体内自身减弱RSV(11); 因此，这里观察到的衰减与mGM-CSF的表达有关。
RT-PCR用于确认感染rRSV/mGM-CSF的动物（未显示）肺部中mGM-CSF mRNA的表达。在该试验条件下，在模拟感染或rRSV感染的动物中未检测到mGM-CSF mRNA，但在感染rRSV/mGM-CSF的动物中很容易检测到（未显示）。
rRSV/6120/mGM-CSF对RSV特异性抗体的诱导不受其衰减的影响。
小鼠感染rRSV/6120/mGM-CSF或wt-rRSV/6120，剂量为104, 105、或106在第28天和第56天采集每只动物的PFU和血清样本。使用纯化的G和F蛋白，通过糖蛋白特异性ELISA测定RSV特异性血清IgG的滴度，并通过斑块减少试验测定病毒中和抗体的滴度（图。). 尽管rRSV/6120/mGM-CSF有很大程度的衰减，但其免疫原性与每种病毒接种物的wt RSV对应物非常相似。
肺IFN-γ和IL-12 p40 mRNA对rRSV/mGM-CSF的反应增加。
用rRSV/mGM-CSF或wt-rRSV感染小鼠，分别于1天和4天后收获各组动物，并分离总的肺RNA。其余的动物在第29天和第32天（分别在攻击后1天和4天）接受wt RSV攻击并收获用于肺RNA分离。使用商业获得的试剂盒，使用特异于IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-13、IL-15、IFN-γ、IL-1受体拮抗剂和巨噬细胞迁移抑制因子的探针，通过RNase保护试验分析RNA样品。显示直接数据的自动射线图示例如图所示。A.最显著的增加涉及IFN-γ和IL-12 p40 mRNA，如图所示。B.与感染后第1天和第4天wt-rRSV应答相比，rRSV/mGM-CSF应答IFN-γmRNA水平显著增加65%(P（P）<0.02）和三倍(P（P）<0.001）（图。). 激发后未检测到显著差异。IL-12 p40 mRNA水平增加了42%(P（P）与第4天用wt rRSV免疫的小鼠相比，用rRSV/mGM-CSF免疫的小鼠中的水平<0.05），而在第1天没有显著差异。在第29天，没有统计学上的显著差异，并且在第32天，用wt rRSV免疫的小鼠的IL-12 p40 mRNA水平略高于用rRSV/mGM-CSF免疫的小鼠（25%）(P（P）< 0.05). IL-6 mRNA在第4天表现出对rRSV/6210/mGM-CSF的轻微增加。在这些条件下，其余的细胞因子mRNA不受任何一种病毒感染的影响。
与对rRSV/6120的应答相比，对rRSV/6120/mGM-CSF的CTL应答适度减弱。
接下来，我们比较了rRSV/mGM-CSF和rRSV/6120刺激RSV-特异性CTL的能力。每组20只小鼠模拟感染或感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120。在感染后第5天、第9天和第21天处死每组5只动物，并使用通过与含有RSV M2-1蛋白的氨基酸82至90的合成肽孵育而制备的靶细胞测定RSV特异性初级脾和肺CTL的水平。我们之前表明，该序列包含一个主要组织相容性复合体I类（MHCI）（H2）的免疫显性表位d日)-限制CD8+BALB/c小鼠中的CTL(27). 每组其余五只动物于第31天用rRSV鼻内激发，并于第37天（激发后6天）处死进行CTL检测。
在第5天和第21天从肺或脾分离的单核细胞组分中，任何组均未检测到RSV-特异性CTL活性（数据未显示）。第9天，在感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120的小鼠中检测到肺部CTL活性，与前者相关的比活性水平（脉冲标记细胞的裂解百分比-未标记细胞的分解百分比）略低于后者：14.24%（标准误差[SE]，1.29）对23.05%（SE，2.39），分别(P（P）<0.02）（这里和下面，效应器与目标的比率为50:1）（图。). 在同一时间点，脾脏中RSV-特异性CTL活性较低，这两种病毒之间没有统计学意义。
在第37天（挑战后6天）也检测到RSV特异性肺CTL（图。). 首次接种rRSV/6120/mGM-CSF的小鼠的CTL水平与接种rRSV/6120的小鼠相比有所降低：6.81%（SE，1.59）vs 10.86%（SE，1.36），然而，这种差异在统计学上并不显著。此时脾脏中RSV特异性CTL的水平可以忽略不计。因此，GM-CSF的表达与初次感染期间CTL反应的中度降低有关。
rRSV表达mGM-CSF导致PMC、肺总CD4水平升高+T淋巴细胞、IFN-γ阳性和IL-4阳性CD4+T淋巴细胞。
BALB/c小鼠组感染10只6rRSV/6120/mGM-CSF或wt-rRSV/6220的PFU或模拟感染。在第5天和第10天处死每组动物，并采集和处理肺以分离PMC。其余的小鼠在第28天接受10只小鼠的鼻内挑战6分别于第32天和38天（攻击后4天和10天）处死wt-rRSV的PFU和PMC。对新鲜细胞进行计数，体外刺激细胞积累细胞内细胞因子，对CD4、IFN-γ和IL-4进行免疫染色，并用流式细胞仪进行分析（表).
与模拟感染对照组相比，wt-rRSV/6120感染导致第5天和第10天PMC总数显著增加（4.6倍和4.3倍）。在第28天的挑战后，第32天PMC的数量增加，尽管少于原发感染，但到第38天时减少。对rRSV/6120/mGM-CSF感染的反应相似，但PMC数量的增加更快（与rRSV/6220感染相比，第5天增加了2.7倍）。
肺CD4的积聚+T淋巴细胞遵循类似的模式。具体而言，在wt rRSV/6120感染的小鼠中，肺CD4的数量+在第5、10和32天，T细胞分别是模拟感染动物的7.0、4.5和4.2倍。在感染rRSV/6120/mGM-CSF的动物中，这种增加发生得更快，因此CD4的数量+第5天的细胞数是感染rRSV/6120的动物的4.4倍。因此，rRSV/6120/mGM-CSF似乎诱导PMC和CD4总量更快增加+在最初感染期间，T淋巴细胞比rRSV/6120多，尽管这两种病毒在其峰值时的反应量相似。
CD4细胞+-通过细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4染色进一步分析T淋巴细胞反应，这两种细胞因子分别是Th1和Th2亚群的标记物。这表明，wt-rRSV/6120感染导致IFN-γ或IL-4阳性细胞大量增加（与模拟感染动物相比，第10天分别增加23.5倍和5.5倍）。正如该模型的特点，IL-4阳性细胞的数量大大少于IFN-γ阳性细胞的数目。此外，大多数CD4+T淋巴细胞对两种细胞因子均无阳性反应。对rRSV/6120/mGM-CSF的反应也观察到类似的结果，只是在第5天和第10天，IFN-γ或IL-4阳性的细胞数量高于感染rRSV/6120亲本的小鼠。例如，在第5天，IFN-γ阳性和IL-4阳性CD4分别增加4.2倍和9.9倍+感染rRSV/6120/mGM-CSF的动物的细胞数分别是感染rRSV/6120的动物的1.7倍和2.1倍。因此，两个CD4中每个CD4的总反应量+在感染rRSV/6120/mGM-CSF的动物中，各亚群的反应速度更快。
这些结果表明，RSV感染期间mGM-CSF的表达与PMC、总肺CD4的快速增加有关+T淋巴细胞、IFN-γ阳性肺CD4+T细胞和IL-4阳性CD4+最初感染期间的T细胞。Th1和Th2亚群的比例刺激相似。无论最初感染的病毒是rRSV/6120还是rRSV/6120/GM-CSF，对wt-rRSV攻击的反应似乎没有太大差异。
mGM-CSF表达导致肺树突状细胞和巨噬细胞增加。
各组小鼠感染rRSV/6120/mGM-CSF或rRSV/6120（每组4只小鼠/天）或模拟感染（每组2只小鼠/每天）。感染后第5、8和9天分离出总PMC；标记CD11b、CD11c和MHCII分子；流式细胞仪分析。通过正向散射特征（区域R1）确定新分离PMC的非淋巴样部分（图。A） 并在CD11b和CD11c表达的基础上进一步分析（图。B） 鉴定三个群体，即常驻肺淋巴树突状细胞（CD11b低的/CD11c公司明亮的; R2区），髓样树突状细胞（CD11b明亮的/CD11c公司明亮的; R3区）和巨噬细胞（CD11b明亮的/CD11c公司低的; 区域R4）。代表性个体小鼠的点图如图所示。B、 计算出的每个种群的平均细胞数如图所示。C、。
与模拟感染的对照组相比，感染rRSV/6120的动物在任何一天都没有显著增加这些细胞群的积累，尽管每天每个群体的平均细胞数略高于感染rRSV/6120的动物。相比之下，rRSV/6120/GM-CSF感染导致每天每个细胞群中的细胞数量大幅增加（高达四倍），但第9天的R2除外。
rRSV/6120/mGM-CSF感染小鼠肺树突状细胞的激活。
我们进一步分析了感染后第5天、第8天和第9天分离的R2（淋巴树突状细胞）、R3（髓系树突状上皮细胞）和R4（巨噬细胞）细胞亚群，以量化MHCII分子的表达，作为活化的衡量标准。第5天和第8天的结果如图所示。第5天，与感染wt rRSV/6120的小鼠相比，感染rRSV/6120/mGM-CSF的小鼠的淋巴和髓系树突状细胞（分别为R2和R3区域）的MHCII平均表达增加（平均荧光增加2.6倍和1.6倍）。相反，在感染rRSV/6120/mGM-CSF的动物中，巨噬细胞亚群（R4区）中MHCII分子的平均荧光降低了2.0倍。然而，由于这些动物的巨噬细胞总数增加了4.0倍，MHCII阳性细胞数量的增加可能会弥补这一点。第8天（图。)和9（未显示），感染这两种病毒的小鼠淋巴树突状细胞（R2区）上MHCII的平均表达水平相似，但感染wt-rRSV/6120/mGM-CSF的小鼠骨髓树突状上皮细胞（R3）和巨噬细胞（R4）的MHCII表达水平略低于rRSV/6120，尽管如上所述，在感染rRSV/6120/mGM-CSF的动物中，树突状细胞和巨噬细胞的数量增加抵消了这一点。
讨论
儿童呼吸道合胞病毒疫苗的一个有希望的策略是用减毒呼吸道合胞菌活疫苗进行鼻内感染免疫(36). rRSV可以通过cDNA中间产物分阶段引入已知的减弱突变来减弱，各种候选病毒正在临床评估中。然而，迄今为止发现的所有衰减突变都会降低体内病毒复制的幅度。不幸的是，这似乎也降低了病毒的免疫原性，可能是由于感染细胞数量减少和抗原表达减少。例如，黑猩猩感染减毒候选疫苗中央处理器248/404诱导RSV中和血清抗体滴度比wt RSV降低9.2倍(19). 与任何儿童RSV疫苗相关的第二个问题是，由于免疫不成熟和母体衍生RSV特异性血清抗体在该年龄组的免疫抑制作用，疫苗目标人群幼儿的免疫反应降低。为了测试提高RSV免疫原性的可能性，我们构建了一种表达mGM-CSF的rRSV，并评估了其在小鼠中的复制和免疫原性。众所周知，GM-CSF是树突状细胞（代表最有效的抗原提呈细胞）和巨噬细胞的主要刺激细胞因子，巨噬细胞作为效应细胞、细胞因子分泌细胞和抗原提呈在先天性和适应性免疫中发挥重要作用。
与亲代病毒相比，rRSV/6120/mGM-CSF在小鼠呼吸道中的复制减少了约50倍，这是mGM-CSF特有的效应。因此，这种细胞因子的表达减弱了病毒。尽管这种高度衰减，但在诱导RSV结合和RSV中和血清抗体方面，rRSV/6120/mGM-CSF至少与对照病毒具有相同的免疫原性。如下文所述，这可能反映了肺抗原呈递细胞的积累和激活增加。另一方面，RSV-特异性CD8的诱导率略有下降+初始感染期间的CTL。这可能是由于病毒的衰减导致抗原表达减少的结果。
与wt rRSV感染相比，rRSV/mGM-CSF感染与IFN-γ和IL-12 p40的肺部mRNA积累增加有关。IFN-γ的生成增加可能反映了CD4刺激增加+流式细胞术检测T淋巴细胞。NK细胞可以被GM-CSF激活，它们是IFN-γ的另一种可能来源，特别是在感染后第1天。单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞可能是IL-12 p40 mRNA表达增加的来源，这可能是mGM-CSF的直接作用，也可能是由于CD4增加+T细胞的帮助和IFN-γ的表达。有趣的是，肺IFN-γmRNA对rRSV/mGM-CSF反应的表达量与之前描述的表达mIFN-γ的可比rRSV的表达量非常相似(11)因此代表了一个高水平。事实上，rRSV/mGM-CSF的衰减水平与之前观察到的rRSV/mIFN-γ的衰减水平非常相似，这表明每种情况下的衰减在很大程度上是由IFN-γ的抗病毒作用介导的。
我们还检测了PMC的积累和激活，特别是代表CD4的亚群+T淋巴细胞、淋巴样树突状细胞、髓样树突形细胞和巨噬细胞。与模拟感染对照组相比，rRSV/6120感染导致PMC总量大幅快速增加，并且在rRSV/6120/mGM-CSF感染期间，PMC增加更快（第5天比rRSV/6220感染期间增加2.7倍）。类似地，rRSV/6120感染导致CD4数量大幅快速增加+T淋巴细胞，在感染rRSV/6120/mGM-CSF期间也更快发生这种情况（第5天比感染rRSV/6120时多4.5倍）。CD4的数量+与wt rRSV/6120相比，rRSV/6120/mGM-CSF也增加了表达IFN-γ（Th1细胞）或IL-4（Th2细胞）的T淋巴细胞，并且在第5天和第10天都观察到了这种差异，因此涉及更快速和更高程度的反应。因此，RSV感染导致肺CD4显著增加+同时涉及Th1和Th2亚群的淋巴细胞，且对两者均无强烈偏向，并且mGM-CSF的表达增强了这些效应。相反，CD4+无论最初感染涉及rRSV/6120还是rRSV/6120/mGM-CSF，对wt-RSV攻击的反应都是相同的。正如这一发现所表明的那样，我们迄今为止从rRSV中表达的细胞因子似乎没有扭曲对随后暴露于RSV抗原的免疫反应，这可能是一个理想的特性。
与mGM-CSF表达相关的最显著效应是肺淋巴和髓样树突状细胞和肺巨噬细胞的大量增加（与rRSV/6120相比，增加了四倍）。这种差异在第5天最大，但在感染后第8天和第9天也很明显。与对rRSV/6120的反应相比，这些细胞对rRSV/6120/mGM-CSF的反应也显示出MHCII分子（一种激活标记物）的表达增加：在第5天，基于平均表达和阳性细胞数量，树突状细胞的MHCII表达水平更高，而巨噬细胞和髓样树突状细胞在第8天和第9天的平均表达有所降低，但更多的阳性细胞可以弥补这一点。这些结果表明，rRSV产生的mGM-CSF可增加肺树突状细胞和巨噬细胞的积累、增殖和活化。这可能导致MHCII分子中抗原呈递水平升高，CD4刺激增加+尽管病毒复制水平降低，但T淋巴细胞和B细胞仍能产生高水平的RSV特异性抗体。
应该注意的是，老鼠只允许RSV复制。如图所示。，病毒复制的峰值水平不高，复制持续时间在第4天或第5天达到峰值并迅速下降(三). 当时观察到树突状细胞和巨噬细胞数量最多，活化程度最高。在第8天和第9天观察到的激活水平略低，发生在未检测到病毒脱落且感染已基本解决的时候。这可能解释了那些天髓样树突状细胞和巨噬细胞MHCII表达水平降低的原因。如果是这样，可能是由于BALB/c小鼠在这些条件下感染的短命性导致对mGM-CSF表达效果的评估不完整。例如，感染的快速消退将导致mGM-CSF生产的快速停止，这可能会限制树突状细胞和巨噬细胞的招募、增殖和激活。评估免疫调节分子（如GM-CSF）在灵长类动物中的表达效果非常重要，因为灵长类中RSV感染的寿命更长，与人类的感染非常相似。
