术语“益生菌”和“益生元”在食品技术领域已变得重要(9,11,32). 益生菌被定义为除基本营养外对健康有益的活性微生物食品成分，而益生元是能够增加体内益生菌肠道细菌的食品成分。革兰阳性厌氧双歧杆菌和乳酸杆菌是益生菌和益生元的主要靶点。
双歧杆菌的肠道定植对人类健康很重要，尤其是在儿科，因为定植似乎可以防止一些引起腹泻或其他疾病的病原菌的感染(4). 母乳喂养婴儿在出生后1周内形成以双歧杆菌为主的肠道菌群，占肠道菌群的95%至99.9%(2,30). 相比之下，瓶装婴儿并没有显示出双歧杆菌如此迅速的定植，在20世纪初之前，他们经常被病原菌感染(4). 为了促进肠道双歧杆菌的繁殖，牛奶配方通常添加低聚糖，如乳果糖(29)结果，现在的瓶装婴儿比以前健康多了。然而，由90%的双歧杆菌和10%的肠杆菌组成的瓶装婴儿的肠道菌群与母乳喂养婴儿的肠道菌落仍然不同(三).
已有许多关于母乳中双歧杆菌生长因子的研究。最初，双歧杆菌的生长被认为依赖于含氮糖，但后来发现这些结果是由于使用了一种特殊的双歧双歧杆菌应变，双歧杆菌宾夕法尼亚州立大学，这需要N个-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）促进其生长(17,34). 进一步研究表明，母乳中的低聚糖（母乳低聚糖）是双歧因子的候选成分，该因子导致双歧杆菌数量增加(4). 牛奶含有乳糖作为唯一的糖类，而母乳含有乳糖以及各种低聚糖(24,28). 然而，尚未确定哪些低聚糖或其中的结构与双歧因子有关。
双歧杆菌在成人肠道中的定殖是由粘蛋白碳水化合物的识别和代谢介导的(20,25). 双歧杆菌产生能够水解粘蛋白糖的因子。Derensy-Dron等人报告了一种酶的存在，该酶可可逆地分解β-d日-吡喃半乳糖-（1→3）-N个-乙酰基-d日-氨基葡萄糖（乳糖-N个-biose I[LNB]）至α-d日-1-磷酸吡喃半乳糖（Gal1-P）和N个-乙酰基-d日-细胞提取物中的葡糖胺双歧杆菌(13). 该酶还分解β-d日-吡喃半乳糖-（1→3）-N个-乙酰基-d日-半乳糖胺（半乳糖-N个-biose[GNB]）到Gal1-P和N个-乙酰基-d日-半乳糖胺（GalNAc），命名为β-1,3-半乳糖-N个-乙酰己糖磷酸化酶（酶代码EC2.4.1.211）(13). 在这里，我们建议简称为lacto-N个-二糖磷酸化酶（LNBP）。
LNBP被发现是合成LNB和GNB各种衍生物的有用工具(15). 由于LNB和GNB是粘蛋白糖的核心结构，细胞内酶LNBP被认为与肠道定植有关(13). 然而，还没有关于这种酶的进一步报道。因此，我们纯化并克隆了编码该酶的基因。
在本研究中，我们从双歧杆菌JCM1254，并成功克隆了一株长双歧杆菌JCM1217。该酶与任何其他已知蛋白质没有同源性，应归入一个新家族。在这里，我们还讨论了LNBP的作用，LNBP基因是推测的操纵子的一部分长双歧杆菌.
材料和方法
材料。
LNB和Gal1-P购自Sigma（密苏里州圣路易斯）。载体pET28a来自Novagen（威斯康星州麦迪逊）。两株双歧杆菌，双歧杆菌JCM1254（DSM 20082）和长双歧杆菌JCM1217是从日本理化研究所（日本Wako）的日本微生物标本馆获得的。大肠杆菌JM109（Takara-Bio，Otsu，日本）和BL21（DE3）（Novagen）分别用作克隆和表达宿主。
LNBP活性测量。
通过Lowry和Lopez法测定30°C下50 mM MOPS（pH 7.0）缓冲液（PH7.0）中含有10 mM Gal1-P和10 mM GlcNAc的反应混合物中磷酸盐的增加，使用常规方法测量LNBP活性(27). 一个活性单位被定义为在上述条件下每分钟释放1μmol磷酸盐的酶量。蛋白质浓度根据理论计算A类280（1.823升·克−1厘米−1)基于LNBP的氨基酸序列长双歧杆菌JCM1217型(16). 该值用于粗酶和纯化酶。
LNBP的纯化。
双歧杆菌JCM1254在37°C厌氧条件下培养48小时（N2/CO公司2，4:1）在含有16 g/升营养肉汤、5 g/升酵母提取物、10 g/升葡萄糖、3 g/升K的培养基中2高性能操作41 g/升吐温80、10 g/升抗坏血酸钠和500 mg/升半胱氨酸-HCl。从4升培养物中提取细胞，清洗，并将其重新悬浮在10 ml 10 mM MOPS缓冲液（pH 7.0）中。为了提取酶，使用超声波发生器（Branson Ultrasonic Corporation，Danbury，CT）对细胞进行超声波破碎，并将所得混合物离心（17000×克将硫酸铵沉淀（30%饱和度）的上清液应用于用含有30%饱和硫酸铵的10 mM MOPS缓冲液预平衡的650 M（日本东京东吴）丁基-硫代丙烯酸柱（8 ml）上，并用50 ml相同的缓冲液清洗柱。然后用100 ml的线性梯度硫酸铵从30%饱和度洗脱到0%。收集显示LNBP活性的组分，并将硫酸铵添加到溶液中，使其达到60%的饱和度。沉淀物再次悬浮在10 mM MOPS缓冲液（pH 7.0）中，酶在DEAE-Toyopearl 650 M（Tosoh）柱（1 ml）上通过色谱纯化，NaCl线性梯度为150 mM至350 mM（20 ml）。在与DEAE-Toyopearl程序相同的条件下，在MonoQ柱（1ml；Amersham Biosciences，Picataway，NJ）上进一步纯化酶。收集活性组分并用10mM MOPS缓冲液（pH 7.0）透析，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检查纯度。
氨基酸序列。
纯化的LNBP的N端氨基酸序列是使用自动肽序列测定器测定的（G1001A型；Hewlett-Packard，Corvallis，CA）。为了获得内部氨基酸序列，纯化的LNBP在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中通过葡萄球菌V8蛋白酶（Wako Pure Chemicals，日本大阪）(10). 完成SDS-PAGE后，将肽片段印在聚偏二氟乙烯膜上(26). 从膜上切下几条带，并使用自动肽序列测定其N-末端氨基酸序列。
LNBP基因的克隆。
包含整个LNBP基因的DNA片段，液化石油气，扩增自长双歧杆菌利用引物Fwd（TGC TGT TCC TCC GCC AGC GCT ACT GGC）和Rev（ATG CCG AAT AAA ACT TCA TTG CTT TCG GTC）对JCM1217基因组DNA进行PCR（27个98℃循环10秒，60℃循环10秒钟，74℃循环2分钟），根据BL1641周围的序列设计。对扩增片段进行测序。然后液化石油气该基因再次用带有附加限制位点的引物扩增（下划线；NcoI和XhoI，分别）（Fwd，AGC ACC类GGC CAG CAC CGG CCG CTT CAC GCT GC；CGC GG版本C TCG股份公司G GCT TCA CGC CAT GCG ATG CCG CTG TC），使用基因组DNA作为模板，并使用DNA连接试剂盒ligation High（Toyobo，大阪，日本）将其插入NcoI/XhoI位点的pET28a载体。
LNBP的表达。
构建的质粒用于转化大肠杆菌BL21（DE3）。通过在1升Luria-Bertani培养基（含50μg ml−1卡那霉素），直到600 nm处的光密度达到0.5。然后通过添加异丙基-1-硫代-β诱导蛋白质生成-d日-将半乳糖苷添加到培养物中至最终浓度为0.5mM，然后在振荡的情况下进一步孵育20小时（30°C）。通过15000×克10分钟，并在20 mM MOPS缓冲液（pH 7.0）中重新悬浮。对重新悬浮的细胞进行超声波处理（Branson Ultrasonic Corp.），并在17000×克按照供应商的协议，使用Ni-硝基三乙酸琼脂糖柱（德国希尔顿QIAGEN），通过柱层析纯化粗酶。
底物特异性。
为了研究底物特异性，在含有0.5 U/ml LNBP、50 mM供体（Glc1-P或Gal1-P）和50 mM受体（GlcNAc、GalNAc、Glc或Gal）的溶液中在37°C的100 mM MOPS缓冲液（pH 7.0）中进行酶反应2小时。反应混合物的等分（1μl）然后在薄层色谱板（5×7.5 cm；硅胶60F254; Merck，Darmstadt，Germany），该板是用乙腈-水（75:25）溶剂系统开发的。将平板浸在5%的硫酸和甲醇中，然后在120°C下加热，以观察平板上的碳水化合物。
结果
细胞内LNBP的纯化双歧杆菌.
我们从双歧杆菌JCM1254如表所示纯化的LNBP在SDS-PAGE上显示为一条表观分子量为86kDa的单条带，其比活性为10U/mg蛋白质。据报道，部分纯化的LNBP的天然分子量为140kDa，因此认为该蛋白具有二聚体结构(13).
表1。
| 净化步骤 | 总蛋白质（mg） | 总活性（U） | Sp活性（U/mg） | 净化(n个-折叠） |
|---|
| 粗提取物 | 524 | 37 | 0.07 | 1 |
| 30%饱和（NH4)2SO公司4 | 181 | 22 | 0.12 | 1.8 |
| 丁基-羰基 | 3.4 | 1.9 | 0.56 | 7.8 |
| DEAE-TOOPEARL公司 | 0.67 | 1.5 | 2.2 | 30 |
| Mono-Q第一 | 0.23 | 1 | 4.6 | 64 |
| 单Q第二 | 0.050 | 0.50 | 10 | 139 |
纯化酶磷解LNB和GNB，如前所述，部分纯化LNBP(13). 反向反应中的供体和受体特异性也与之前报道的相同(13). N端和两个内部氨基酸序列分别为STSGR FTIPS ESNFA EKTAE LARLW GADAV、YGYRL RPEDF VNEGS YNSAW RVPRK和LGGID FGEPI ADTFP VNEDV TLLRA DGGQV。关于BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站/) (1)，所有序列都显示出与由长双歧杆菌新冠2705(31)（GenBank登录号。{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“AAN25428.1”，“term_id”：“23326930”}}AAN25428.1号)，其完整基因组序列可用，如图所示。.
LNBPs氨基酸序列的比对。酶的来源在左栏中指出。重点介绍了保守氨基酸残基。
LNBP基因的克隆与表达长双歧杆菌.
LNBP基因，液化石油气，成功地从长双歧杆菌以JCM1217为模板，根据DNA序列设计一组引物长双歧杆菌NCC2705约为BL1641。LNBP的DNA和氨基酸序列长双歧杆菌JCM1217作为{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AB181926”，“term_id”：“56676014”}}AB181926型该基因编码752个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量为84327。该氨基酸序列与BL1641基因的氨基酸序列同源性为97%，长度相同，无缺口。另一方面双歧杆菌JCM1254不能用相同的引物集进行扩增。
这个液化石油气基因来自长双歧杆菌将JCM1217插入表达载体以形成pET28a-lnbp并转化为大肠杆菌BL21。培养携带质粒的转化子以诱导蛋白质。含有额外His的重组酶6纯化了其C末端的序列。的重组LNBP长双歧杆菌显示出与天然LNBP类似的比活性（19 U/mg）双歧杆菌（10 U/mg）。通过薄层色谱测试特异性(双歧杆菌)和重组(长双歧杆菌)研究表明，LNBPs以Gal1-P为供体，以GlcNAc/GalNAc为受体，检测底物。
培养长双歧杆菌JCM1217在与双歧杆菌，并且该菌株在材料和方法中描述的葡萄糖培养基中不产生LNBP，这表明LNBP是长双歧杆菌.
同源搜索。
没有与同源的基因液化石油气在其他主要肠道细菌中发现，例如乳酸杆菌,拟杆菌、和大肠杆菌属.BLAST搜索LNBP的氨基酸序列时，只找到了六种蛋白质，包括BL1641。一个是另一株的基因组序列中的假设蛋白质（ZP_00121798.1）长双歧杆菌，DJO10A，99%身份。其他三种是假设的蛋白质产气荚膜梭菌(33)（位点CPE0573；47%同一性），痤疮丙酸杆菌(6)（位点PPA0083，46%同一性），创伤弧菌CMCP6型(22)（VV21091位点；38%同一性），以及创伤弧菌YJ016型(8)（VVA1614位点；38%同一性）。没有发现与已知功能的任何蛋白质有显著的一致性，这表明LNBP应该被划分为一个新的家族。
讨论
LNBP的分类。
参与糖基键形成和断裂的酶根据氨基酸序列的相似性分为三类：糖苷水解酶（GH）(18)，糖基转移酶（GT）(7)和糖苷裂解酶(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). LNBP是表中列出的碳水化合物加工磷解酶之一(23). LNBP的氨基酸序列与其他任何磷脂酶均无同源性。此外，没有发现具有已知功能的蛋白与LNBP同源，这表明它应该被划分为一个新的家族。
表2。
| 第2.4.1节。x个 | 姓名 | 机制 | 产品 | 家庭 |
|---|
| 1 | （糖原）磷酸化酶 | 保留 | α-Glc1-P | GT35系列 |
| 7 | 蔗糖磷酸化酶 | 保留 | α-Glc1-P | GH13号机组 |
| 8 | 麦芽糖磷酸化酶 | 反转 | β-Glc1-P | GH65标准 |
| 20 | 纤维二糖磷酸化酶 | 反转 | α-Glc1-P | GH94标准 |
| 30 | 1,3-β-低聚葡聚糖磷酸化酶 | 反转 | α-Glc1-P | 未克隆 |
| 31 | 海带核糖磷酸化酶 | 反转 | α-Glc1-P | 未克隆 |
| 49 | 纤维素糊精磷酸化酶 | 反转 | α-Glc1-P | GH94标准 |
| 64 | 海藻糖磷酸化酶 | 反转 | β-Glc1-P | GH65标准 |
| 97 | β-1,3-葡聚糖磷酸化酶 | 反转 | α-Glc1-P | 未克隆 |
| 211 | 拉克托-N个-生物磷酸化酶 | 反转 | α-Gal1-P | 新家庭 |
| 216 | 海藻糖6-磷酸磷酸化酶 | 反转 | β-Glc1-P | GH65标准 |
| 230 | 可可糖磷酸化酶 | 反转 | β-Glc1-P | GH65标准 |
| 231 | 海藻糖磷酸化酶 | 保留 | α-Glc1-P | GT4型 |
| ND（无损检测）一 | 壳二糖磷酸化酶 | 反转 | α-GlcNAcl-P | GH94标准 |
磷分解酶最初应根据其催化的反应归类为GT家族。然而，由于存在同源水解酶，一些磷分解酶被划分为GH家族（GH13和-65）。此外，由于这些磷酸水解酶与GH-L族糖苷水解酶的结构和机制关系，尽管没有一个成员具有水解活性，但壳二糖磷酸化酶的结构分析迫使GT36重新分类为GH94(19). 因此，需要仔细分类才能对磷解酶家族进行分类。据报道，GT酶有两个折叠家族之一，GT-A和GT-B(5,12)而GH酶具有不同的折叠(5). 然而，三维结构的预测(21)LNBP没有产生可能的折叠，使得分类困难。目前，我们认为LNBP应该归入一个新的家族，不能合理地归类为GT或GH。
涉及LNBP的新型半乳糖操纵子的作用。
LNBP基因BL1641似乎位于长双歧杆菌基因组，如图。(31). 在操纵子中，BL1638-1640基因被注释为ATP-结合盒（ABC）型糖转运蛋白的组成蛋白。BL1642、BL1643和BL1644分别被注释为粘蛋白脱硫酶、半乳糖-1-磷酸尿苷基转移酶（酶代码EC2.7.7.10）和UDP葡萄糖4-差向异构酶（酶代码EC5.1.3.2）。从操纵子的成员来看，LNBP似乎与粘蛋白糖的代谢有关，如图所示。，因为GNB是粘蛋白型糖的核心结构(13). 在该途径中，LNB/GNB磷解形成的Gal1-P转化为UDP-葡萄糖进入其他途径。
假定的乳制品-N个-基因组序列中发现的biose操纵子长双歧杆菌NCC2705.BL1641在本研究中被鉴定为LNBP。BL1638-1640基因被注释为ABC型糖转运蛋白的组成蛋白。BL1642、BL1643和BL1644分别被注释为粘蛋白脱硫酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（酶代码EC2.7.7.10）和UDP-葡萄糖4-差向异构酶（酶号EC5.1.3.2）。
已有两种半乳糖代谢操纵子的报道(14). 第一个是带有磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统（PTS）转运体的操纵子。在该途径中，乳糖通过乳糖特异性PTS转运体从细胞外通过膜转运，形成乳糖6-磷酸，然后用6-磷酸-β-半乳糖苷酶水解，生成葡萄糖和半乳糖6-磷酸。第二种由半乳激酶（EC 2.7.1.6）、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶和UDP-葡萄糖4-差向异构酶组成，并伴有ABC转运体和α-和/或β-半乳糖苷酶。在该途径中，半乳糖苷酶水解形成的游离半乳糖通过半乳激酶磷酸化为Gal1-P。这与LNB途径不同，LNB不需要半乳激酶，直接从Gal1-P开始。
半乳激酶基因也发现于长双歧杆菌基因组（BL1210），伴随半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因（BL1211）。在半乳激酶附近未发现半乳糖苷酶或UDP-葡萄糖差向异构酶基因。长双歧杆菌拥有另一个UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因（BL1671），该基因不伴有半乳糖代谢相关酶。基于上述观察，可以假设长双歧杆菌包括液化石油气表达一种对LNB和GNB非常特异的酶。这似乎构成了一个利用粘蛋白型糖进行肠道定植的系统，如图所示。.
此外，这种操作子可以解决为什么双歧杆菌仅在母乳喂养的婴儿中占主导地位的问题(24)，如图所示。成熟牛乳和母乳的主要区别是低聚糖含量；母乳中含有各种低聚糖，在非还原端具有LNB结构(24)而成熟牛乳中除乳糖外不含低聚糖(28). 此外，牛初乳含有少量低聚糖，但在其结构中未发现LNB(28).
母乳低聚糖被认为是双歧因子，但该因子所需的机制和结构尚不清楚。在本研究中，我们发现，在检测LNBP活性或墨西哥基因。考虑到所有结果，可以合理假设母乳低聚糖中的LNB残留物是母乳喂养婴儿的双歧因子。此外，应注意的是，人类初乳中的低聚糖含量高于成熟乳中的低聚糖含量(24)，帮助新生儿快速定植。
本研究结果表明，LNB是双歧因子。由于母乳低聚糖和LNB的可用性较差，很难检测其作为双歧因子的功能。LNBP可能是以合理的成本生产各种LNB衍生物的实用催化剂。LNB有望改善瓶装婴儿的健康状况。
