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基因发育。2005年6月15日；19(12): 1432–1437.
数字对象标识：10.1101/gad.1299505
预防性维修识别码：项目经理1151659
PMID：15964994

Bmi-1通过抑制p16促进神经干细胞的自我更新和神经发育，但不促进小鼠的生长和存活墨水4a和第19页阿尔夫衰老途径

安娜·莫洛夫斯基，何晟辉，穆罕默德·拜登，肖恩·莫里森，1和里卡多·帕达尔
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1需要在出生后维持多个组织中的干细胞，包括中枢神经系统（CNS）和外周神经系统（PNS）。删除墨水4a或阿尔夫从B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠部分挽救了CNS和PNS中的干细胞自我更新和干细胞频率，以及前脑增殖和肠道神经发生。阿尔夫不足，但不是墨水4a缺陷，部分挽救小脑发育，显示祖细胞对p16敏感性的区域差异墨水4a和第19页阿尔夫.删除两者墨水4a和阿尔夫不会影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠或完全挽救神经发育。因此，Bmi-1通过抑制神经干细胞的早衰墨水4a和阿尔夫，但其他途径也必须在Bmi-1的下游发挥作用。

关键词：Bmi-1，神经嵴，干细胞，p16墨水4a，第19页阿尔夫，自我更新

干细胞必须在成年后的许多组织中持续存在，以取代因周转、损伤或疾病而丢失的成熟细胞。干细胞在一生中持续存在的机制包括自我更新的干细胞分裂，产生一个或两个子干细胞(Morrison等人，1997年;Molofsky等人，2004年). 包括中枢神经系统（CNS）在内的许多组织中的干细胞出生后自我更新(Maslov等人，2004年)、外周神经系统（PNS）(Kruger等人，2002年)和造血系统(哈里森1979;Morrison等人，1996年).

多梳家族转录抑制因子Bmi-1是造血干细胞自我更新和出生后维持所必需的(Lessard和Sauvageau 2003年;Park等人，2003年)以及来自CNS和PNS的神经干细胞(Molofsky等人，2003年). 在每个组织中B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-干细胞数量正常，分化正常，但表现出出生后的自我更新缺陷，导致其在成年早期耗尽。B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1随着细胞分化而趋于关闭(Lessard等人，1998年)并且不是所有细胞增殖所必需的(Molofsky等人，2003年). Bmi-1作为蛋白质复合体的一部分，通过调节染色质结构维持基因沉默(Valk-Lingbeek等人，2004年). 除了轻微的骨骼转变，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠出生时大小和外观正常(van der Lugt等人，1994年). 然而，他们表现出出生后逐渐发育迟缓，并在成年早期死亡，有造血功能衰竭（骨髓细胞减少）和神经异常（癫痫发作和共济失调）的迹象(van der Lugt等人，1994年).

B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠会出现几种特定的神经异常。出生后第30天（P30），当干细胞严重耗竭时，前脑脑室下区（SVZ；CNS干细胞进行神经发生的区域）的增殖速度降低(Molofsky等人，2003年). 小脑也不能正常发育，部分原因是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1是颗粒前体细胞增殖所必需的(Leung等人，2004年). 最后，成年人B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-随着出生后PNS区域的神经嵴干细胞（NCSCs）耗竭，小鼠肠道肌间神经丛中的神经元数量减少(Molofsky等人，2003年). 这些缺陷表明，Bmi-1调控的途径对神经发育具有重要影响。

Bmi-1抑制墨水4a-Arf轨迹（Jacobs等人。1999年a，b条)编码两种细胞增殖抑制剂(谢尔2001).墨水4a编码p16墨水4a，一种促进Rb活化的细胞周期素依赖性激酶抑制剂。阿尔夫编码p19阿尔夫促进p53激活。第16页墨水4a和第19页阿尔夫在培养的原代细胞中被诱导，并可导致这些细胞衰老（有关综述，请参阅Lowe and Sherr 2003年). Bmi-1过表达可通过降低p16蛋白来防止衰老并延长原代细胞的复制寿命墨水4a和第19页阿尔夫表达式(Jacobs等人，1999a;Dimri等人，2002年;Itahana等人，2003年). 删除墨水4a-Arf从B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠挽救了小鼠胚胎成纤维细胞在培养中的增殖能力，至少部分挽救了小脑发育缺陷(Jacobs等人，1999a). 第16页墨水4a表达式在中提升B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-神经干细胞与缺失墨水4a从B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠在培养中部分挽救神经干细胞的自我更新(Molofsky等人，2003年).

测试是否墨水4a缺失可挽救干细胞频率或神经发育B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，以及p19是否阿尔夫也可以调节Bmi-1对干细胞功能或神经发育的部分作用，我们已经培育出了缺乏B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(van der Lugt等人，1994年)和/或墨水4a(夏普莱斯等人，2001年),阿尔夫(Kamijo等人，1997年)，或墨水4a-Arf(Serrano等人，1996年). 我们的结果表明墨水4a和阿尔夫每一种都是Bmi-1促进神经干细胞自我更新和神经发育的主要机制。神经干细胞的出生后维持依赖于衰老途径的抑制，否则会导致干细胞过早耗尽。

结果和讨论

如p16墨水4a(Molofsky等人，2003年)，第19页阿尔夫缺少B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1第19页阿尔夫未在野生型SVZ或小脑中检测到，但在这些组织中未检测到B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(图1A). 第19页阿尔夫在中上调B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-从SVZ培养的CNS神经球(图1B)和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-从成人肠壁培养的PNS神经球（数据未显示），尽管p19阿尔夫在野生型神经球中也检测到较低水平。两个p16的检测墨水4a(Molofsky等人，2003年)和第19页阿尔夫尽管在体内没有检测到这些蛋白，但在培养的神经球中表明墨水4a和阿尔夫在培养的野生型细胞中诱导，但诱导程度不如B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-细胞。这与我们未能检测到的一致墨水4a或阿尔夫流式细胞术分离的未培养野生型NCSCs的PCR检测(Molofsky等人，2003年).

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第19页阿尔夫在缺乏B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1，并删除阿尔夫或墨水4a-Arf显著增加SVZ和肠道神经干细胞的自我更新B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。(A类)第19页阿尔夫4周龄未培养SVZ和小脑（CBM）增加B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。神经球细胞的蛋白质印迹阿尔夫-/-小鼠显示为阴性对照。(B类)第19页阿尔夫年增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-CNS神经球（NS）培养13天(C类，D类)阿尔夫缺陷显著增加了自我更新（每个亚克隆初级神经圈生成的次级神经圈数量）B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-中枢神经球(C类)和PNS神经球(D类)，以及来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-（但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+)再植后形成次级神经球的初级神经球（补充图6）。在四个独立实验中，CNS数据表示每个基因型2-4只小鼠的平均±SD。PNS数据来自四个独立实验中每个基因型三到七只小鼠。(E类，F类)墨水4a-Arf缺陷显著增加了体内的自我更新能力B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-中枢神经球(E类; 每个基因型2-4只小鼠的平均值±SD，四个独立实验）和PNS神经球(F类; 每个基因型三到六只小鼠，六个独立实验），以及来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-（但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+)再植后形成次级神经球的初级神经球（补充图6）。(★)显著不同(P（P）<0.05）从B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+阿尔夫+/+或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf+/+; （#）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-阿尔夫+/+或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a-Arf+/+; （§）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+阿尔夫-/-或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf-/-所有实验均在4-8周龄小鼠上进行。

阿尔夫缺陷显著增加了两者的自我更新能力B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-来自CNS和PNS的神经球(图1C、D). The ability of阿尔夫缺乏增加自我更新的能力B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+培养中的神经干细胞可能反映了这样一个事实，即原代神经球在培养10天后即p19之后被亚克隆阿尔夫在这些细胞中被诱导。因为只观察到一半左右的自我更新B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-阿尔夫-/-神经球与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+阿尔夫-/-CNS和PNS中的神经球，阿尔夫缺乏似乎只是部分地挽救了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-神经球。与此一致，阿尔夫缺陷也显著增加了神经球的大小（补充图1B）和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-可形成次级神经球的神经球（补充图6B）。

删除墨水4a和阿尔夫(墨水4a-Arf-/-)内部自我更新能力显著增强B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-来自CNS和PNS的神经球(图1E、F). 自我更新率表明墨水4a-Arf缺陷挽救了大部分，但不是全部B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-中枢神经系统自我更新缺陷和大约一半的PNS自我更新缺陷（比较。B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a-Arf-/-与。B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf-/-在里面图1E、F). 观察到更多的自我更新图1F比英寸图1D因为神经球在亚克隆之前培养的时间更长。墨水4a-Arf缺陷也显著增加了神经球的大小（补充图1C、D）和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-可形成次级神经球的神经球（补充图6C）。

Ink4a、Arf，或墨水4a-Arf缺陷部分救援B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-神经干细胞频率

测试是否墨水4a缺乏也可以挽救体内干细胞频率，我们培养了4-8周龄小鼠分离的前脑SVZ细胞，以确定可形成多潜能神经球的新鲜分离细胞的频率。细胞以克隆密度贴壁，培养10天，然后重新放置到贴壁培养物上3-5天，并对神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞进行染色。如前所述B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-SVZ形成多能神经球(图2).墨水4a缺乏显著增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+形成多潜能神经球的SVZ细胞(图2A). 这与p16一致墨水4a中的表达式B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是在B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+体内SVZ细胞(Molofsky等人，2003年). 增长幅度表明墨水4a缺乏部分挽救干细胞的频率B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-SVZ公司。

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删除墨水4a，阿尔夫，或墨水4a-Arf神经干细胞频率显著增加B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。(A类，B类)墨水4a缺乏显著增加SVZ细胞的百分比(A类)或成人肠道NCSC(B类)来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-培养中形成多能神经球的小鼠（四个独立实验的平均值±SD）。(C类，D类)阿尔夫缺乏也显著增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-从SVZ形成多能神经球的细胞(C类; 在六个独立实验中，每个基因型三到六只小鼠）或肠壁(D类; 在四个独立实验中，每个基因型四只小鼠）。(E类，F类)墨水4a-Arf缺乏显著增加了来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-成人SVZ(E类; 每个基因型2至7只小鼠，8个独立实验）或肠壁(F类; 每个基因型三到八只小鼠，三个独立实验），在培养中形成多能神经球。(★)显著不同(P（P）<0.05 byt吨-测试）来自野生型；（#）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a+/+，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-阿尔夫+/+，或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a-Arf+/+; （§）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-/-，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+阿尔夫-/-，或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf-/-所有实验均采用4-8周龄的小鼠。

我们还培养了肠外壁的游离细胞，在肠外壁中，NCSC在成年后一直存在(Kruger等人，2002年). 细胞以克隆密度贴壁，培养10天，然后重新放置到贴壁培养物上5天，并对神经元、胶质细胞和肌成纤维细胞进行染色。墨水4a缺乏显著增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+形成多能神经球的细胞(图2B). 增长幅度再次表明墨水4a缺乏部分挽救干细胞的频率B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-内脏。

为了证实体内神经干细胞频率的部分挽救，我们利用流式细胞术基于未培养NCSC高水平p75神经营养素受体（p75+单元格）(Bixby等人，2002年;Kruger等人，2002年). 在这些实验中，p75的30%-50%+所有基因型的细胞在培养中形成NCSC集落（数据未显示），相对于未分级细胞，NCSC的富集度为30至300倍（0.1%-1.4%的未分级肠道细胞，取决于基因型，在培养中形成干细胞集落）(图2). p75的频率+细胞在缺乏B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(图3A、B).墨水4a缺乏对p75的频率没有影响+单元格来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+但确实显著增加了p75的频率+中的单元格B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠(图3C-E). 这一增长幅度再次表明B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-干细胞耗竭。因此，对前瞻性鉴定的未培养NCSC的分析与培养中的功能测定结果一致，表明Bmi-1通过抑制墨水4a.

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墨水4a缺乏部分挽救了成年肠道中未培养NCSC的频率。墨水4a缺陷部分挽救了p75的频率+NCSC高度富集的细胞，位于B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。(A类-D类)显示p75的指示基因型的代表性流式细胞仪图+新分离的肠壁细胞中的NCSC频率（每个图的方框区域）。(E类)p75的频率+细胞显著减少B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1不足，并且显著增加了墨水4a缺乏。面板中的数据E类表示使用4-8周龄小鼠进行的10项独立实验的平均值±SD。统计显著性如所示图2.

阿尔夫不足(图2C、D)和墨水4a-Arf不足(图2E、F)也部分地挽救了中枢神经系统和PNS干细胞在B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，显著增加来自B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+培养中形成多能神经球的小鼠。SVZ和肠道细胞的百分比B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a-Arf-/-和B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf-/-形成多能神经球的小鼠表明墨水4a-Arf该缺陷挽救了大多数中枢神经系统干细胞维持缺陷，约一半B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-PNS干细胞维持缺陷。这些结果表明p16的表达增加墨水4a和第19页阿尔夫在缺乏Bmi-1的情况下，神经干细胞的自我更新和维护缺陷主要是由B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。

Ink4a、Arf，或墨水4a-Arf缺陷部分挽救神经发育B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠

在没有B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1在成年SVZ中，增殖率（结合BrdU脉冲的细胞百分比）显著下降，在前脑中发生神经发生(图4A).墨水4a缺乏对细胞增殖没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+前脑（数据未显示）但显著增加B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-前脑，提示该表型的部分修复(图4A). 成人小肠横截面上肌间神经丛神经元的数量在缺乏B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1(图4B).墨水4a缺乏能显著增加每节神经元的数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-肠(图4B). 因此墨水4a缺氧部分挽救了大鼠前脑和肠神经系统的增殖/神经发生B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。

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删除墨水4a，阿尔夫，或墨水4a-Arf3-9周龄时部分挽救SVZ增殖和肠道神经发生B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠体内试验。(A类，C类，E类)SVZ中的增殖率（包含BrdU脉冲的细胞百分比）B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠显著增加墨水4a不足(A类),阿尔夫不足(C类)、或组合墨水4a-Arf不足(E类). 请注意，这些基因的缺失对SVZ的增殖没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+老鼠(C类，E类;墨水4a数据未显示；每只小鼠6至8个切片，每种基因型3至5只小鼠）。墨水4a缺乏部分挽救了通过小肠远端每个横截面的肌间神经丛神经元数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠(B类; 每个基因型4到7只小鼠的平均值±SD，每个小鼠7到10个切片）。阿尔夫缺陷倾向于增加每个横截面的神经元数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，尽管这种影响在统计学上并不显著(D类; 每个基因型4-5只小鼠和每个小鼠8-10个切片的平均值±SD）。墨水4a-Arf缺乏能显著增加每横截面肌间神经丛神经元的数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-以一种与完全救援一致的方式(F类; 每个基因型5只小鼠和每个小鼠6至8个切片的平均值±SD）。(★)显著不同(P（P）<0.05 byt吨-测试）来自野生型；（#）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a+/+，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-阿尔夫+/+，或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-墨水4a-Arf+/+; （§）与B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+阿尔夫-/-或B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+墨水4a-Arf-/-.

阿尔夫不足(图4C)或墨水4a-Arf不足(图4E)也显著增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+SVZ，建议部分修复此缺陷。阿尔夫缺陷似乎增加了每个节段的神经元数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小肠，尽管效果没有统计学意义(图4D).墨水4a-Arf缺乏能显著增加每节神经元的数量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-但不是B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+小肠(图4F)在一定程度上与全面救援一致。一些表型（例如肠道神经发生）似乎通过删除墨水4a和阿尔夫，而其他表型（例如SVZ增殖）仅得到部分挽救，这表明Bmi-1下游其他通路的重要性在神经系统的不同区域有所不同。

阿尔夫或墨水4a-Arf缺陷部分挽救小脑发育B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠

B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠小脑形态较小，颗粒细胞和分子细胞层明显变薄，分子层细胞密度降低(图5A-C;van der Lugt等人，1994年;Leung等人，2004年).墨水4a-Arf缺陷部分挽救了小脑的发育B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠(Jacobs等人，1999a)，尽管墨水4a和阿尔夫小脑发育未进行测试。与之前的报告一致，我们发现墨水4a-Arf缺乏对小脑发育没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+小鼠（数据未显示），但确实增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，包括显著增加颗粒层和分子层的厚度，以及分子层的细胞密度(图5C). 尽管如此，所有这些参数仍显著低于野生型同窝婴儿的观察值，表明小脑生长得到了部分挽救(图5C).

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删除阿尔夫或墨水4a-Arf，但不是墨水4a单独，部分挽救小脑发育B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠。成人小脑的苏木精和伊红染色矢状截面。颗粒层厚度（GL）、分子层厚度（ML）和分子层细胞密度的测量（细胞/高功率场[HPF]为100μm2)代表每个基因型在下面相应的图片。(A类)墨水4a缺乏对小脑发育没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠（每个基因型4只小鼠的平均值±SD，每只小鼠7至25次测量）。(B类)阿尔夫4～8周龄小脑发育缺陷可部分挽救B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠（每个基因型三到四只小鼠的平均值±SD，每个小鼠的测量值为10-23）。(C类)墨水4a-Arf该缺陷也部分挽救了小脑的生长B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠（每个基因型3到5只小鼠的平均值±SD，每个小鼠6到32个测量值）。墨水4a，阿尔夫、和墨水4a-Arf缺陷不影响小脑的生长B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+小鼠（数据未显示）。统计显著性如所示图4.

墨水4a缺乏对小脑发育没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠(图5A)尽管p16的表达增加墨水4a在中B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小脑（补充图2）。这表明神经系统某些区域的祖细胞可能对p16不敏感墨水4a表达式。阿尔夫缺乏对小脑发育没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/+小鼠（数据未显示），但在B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，除了显著增加颗粒层和分子层的厚度以及分子层的细胞密度外(图5B)，与从墨水4a-Arf不足（参见。图5C). 观察结果表明阿尔夫不足的影响比墨水4a小脑发育缺陷B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠表明p16的相对重要性墨水4a和第19页阿尔夫不同的祖细胞群体和神经系统区域之间存在差异。

Ink4a、Arf，或墨水4a-Arf缺乏并不能拯救B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-老鼠

尽管墨水4a缺陷，阿尔夫不足，或墨水4a-Arf神经干细胞功能和神经发育各方面的缺陷B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，它们不会影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，明显小于野生型同窝小鼠（补充图3）。墨水4a不足或阿尔夫缺乏也不会显著影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠（补充图4A，B）。墨水4a-Arf另一方面，缺陷确实显著增加了成年人的脑质量B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠，尽管只是轻微的（补充图4C）。The ability of墨水4a缺乏，阿尔夫缺陷，以及墨水4a-Arf缺乏实质性拯救神经干细胞功能，而对大脑生长几乎没有影响B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠表明，Bmi-1对神经干细胞的影响可以与对组织生长的影响分离开来。

墨水4a缺乏，阿尔夫不足，或墨水4a-Arf缺乏也没有挽救B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-尽管出生数量接近预期（数据未显示），但小鼠通常死于P30（补充图3）。墨水4a-Arf删除并没有阻止B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠表现出共济失调（数据未显示）。造血系统等其他组织的异常也不能通过墨水4a-Arf与在神经系统中观察到的情况相比，该基因的缺失可能表现出较少的挽救作用（参见Bruggeman等人[2005]). 很可能B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1-/-小鼠在其他组织的维护方面有着非典型的缺陷，这也可能影响其生存能力。因此，这些小鼠的早期死亡可能是由多种组织缺陷的复杂组合引起的。

很难准确估计每种表型被拯救的比例墨水4a或阿尔夫删除；然而墨水4a-Arf缺陷挽救了SVZ增殖(图4E)似乎不大于删除墨水4a(图4A)或阿尔夫独自一人(图4C). 同样墨水4a-Arf缺陷挽救神经干细胞频率(图2E、F)似乎小于墨水4a不足(图2A、B)和阿尔夫不足(图2C、D). 这表明p16之间存在交叉调节墨水4a和第19页阿尔夫路径。p16的许多机制墨水4a和第19页阿尔夫已经确定了相互影响的途径(Lowe and Sherr 2003年). 例如，由于p21计算机集成电路1，如p16墨水4a，促进Rb激活，改变p21计算机集成电路1表达影响p16的水平墨水4a抑制增殖所必需的(Lowe and Sherr 2003年). 与此一致，我们发现计算机集成电路1RNA水平降低了阿尔夫不足并增加了B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1缺陷（根据p19的假定变化预测阿尔夫以及这些细胞中的p53活性）（补充图4）。这些变化计算机集成电路1水平提供了一种可能的交叉调节来源，可以解释墨水4a和阿尔夫缺失，特别是考虑到p21计算机集成电路1调节神经干细胞自我更新(邱等人，2004;Kippin等人，2005年).

墨水4a和阿尔夫抑制是Bmi-1促进出生后干细胞自我更新、干细胞维持和神经系统发育的重要机制。自p16诱导以来墨水4a和第19页阿尔夫与细胞衰老有关(Lowe and Sherr 2003年)，神经干细胞似乎在缺乏Bmi-1的情况下过早衰老，并在成年时耗尽。这表明抑制这些衰老途径是神经干细胞终生维持的基本要求。

材料和方法

这个B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/-，阿尔夫+/-、和墨水4a-Arf+/-小鼠在C57BL背景下回交至少八次。采用的初步实验墨水4a+/-以FvB为背景的小鼠，但所有结果随后都通过使用墨水4a+/-老鼠五次回交到C57BL背景上。使用补充材料中描述的引物，通过PCR对所有小鼠进行基因分型。

CNS和PNS祖细胞的分离

成人SVZ是在冰冻Opti-MEM培养基（Gibco）中通过冠状切片获得的。将侧脑室的侧壁取出，切碎，然后在37°C的0.025%胰蛋白酶/0.5 mM EDTA（钙生物化学）+0.001%DNase1（罗氏）中分离20分钟。用含有0.014%大豆胰蛋白酶抑制剂（Sigma）和0.001%DNase1的染色培养基（含有1 mg/mL BSA[Sigma A-3912]的L15培养基、pH 7.4的10 mM HEPES和1%青霉素/链霉素[BioWhittaker]）淬灭细胞。离心后，将细胞重新悬浮在染色介质中，研磨，通过尼龙筛（45μm，Sefar America）过滤，用血细胞仪计数，然后电镀。

为了分离PNS祖细胞，将成年小鼠内脏解剖成冰镇PBS。如前所述，将外层肌肉/神经丛层从下面的上皮中剥离(Kruger等人，2002年)然后切碎，在0.025%胰蛋白酶/EDTA（Gibco 25300-054）和1 mg/mL无钙、无镁HBSS中的4型胶原酶（沃辛顿）中解离45分钟，37°C，每5分钟搅拌一次。然后在染色介质中淬火解离的细胞，重新悬浮，并如上所述进行过滤。如前所述，分离的肠道细胞有时用抗p75抗体（Ab 1554；Chemicon International）染色(Bixby等人，2002年). p75的分析和分类+细胞通过FACS VantageSE流式细胞仪（Becton Dickinson）进行。

细胞培养和自我更新检测

以克隆密度（6孔板每孔2000个细胞；培养基每μL 1.3个细胞）将细胞接种在超低结合板（Corning）上，以生长神经球。培养基基于5∶3的DMEM-低葡萄糖混合物：补充有20 ng/mL人bFGF（R&D Systems）、1%N2补充物（Gibco）、2%B27补充物（Gibco）、50μM 2-巯基乙醇和1%pen/strep（Biowittaker）的神经基础培养基（Gibco-）。CNS培养物还含有20 ng/mL EGF（研发系统）和10%鸡胚提取物（按说明制备[Stemple和Anderson 1992年]). PNS培养物含有15%鸡胚提取物、35 mg/mL（110 nM）维甲酸（Sigma）和20 ng/mL IGF1（研发系统）。所有培养物均保持在37°C的6%CO中2/平衡空气。

为了测量自我更新，通过研磨分离单个CNS神经球，然后在非黏附培养物中以克隆密度替换。5-10天后对继发性神经球进行计数，以确定每个原发性神经球形成的继发性神经球的数量。将单个PNS神经球重新放置在粘附板上48小时，使其在培养皿上展开。然后在37°C下用胰蛋白酶和胶原酶（四份0.05%胰蛋白酶-EDTA加一份10 mg/mL胶原酶IV）处理粘附的菌落5分钟，然后研磨。在6孔板的每孔中重新放置5000个分离的细胞，10天后计算次级神经球。

按照补充材料中的描述进行蛋白质印迹、qRT-PCR和免疫组化。

致谢

感谢David Adams、Anne Marie Deslaurier和密歇根大学流式细胞术核心设施（由UM-综合癌症NIH CA46592和UM-多用途关节炎中心NIH P60-AR20557支持）。感谢杂交瘤核心设施的Elizabeth Smith（由密歇根糖尿病研究与培训中心NIH5P60-DK20572和风湿病中心P30 AR48310提供支持）。感谢Kelly Yeager的组织切片。感谢Maarten van Lohuizen提供B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1+/-并分享未发表的结果，向Charles Sherr提供阿尔夫+/-老鼠和罗纳德·德皮尼奥墨水4a+/-和墨水4a-Arf+/-老鼠。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 NS40750）、詹姆斯·麦克唐纳基金会和霍华德·休斯医学研究所的支持。A.V.M.获得了美国国立卫生研究院颁发的国家研究服务奖（F30 NS048642）。R.P.得到了西班牙科技部博士后奖学金的支持。S.H.得到了密歇根大学细胞和分子生物学项目的奖学金支持。

笔记

补充材料可在http://www.genesdev.org。

文章和出版物位于http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.1299505。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社