c-erbB2和拓扑异构酶IIα蛋白表达独立预测原发性乳腺癌患者的不良生存率：一项回顾性研究

摘要

介绍

c-erbB2和最近拓扑异构酶IIα的蛋白表达状态与乳腺癌临床结局和化疗反应的预测有关[1-5]. 基因扩增是导致这些肿瘤异常表达的主要但非唯一机制（在[6]).c-erbB2型定位于染色体17q12-21，编码跨膜酪氨酸激酶受体蛋白。这种高度糖基化的蛋白质是表皮生长因子受体（EGFR；HER）家族的成员[7]在大多数上皮细胞上表达。体外上皮细胞中c-erbB2的过度表达最终影响细胞增殖、凋亡途径、运动和粘附的调节（综述[8]). 因此，许多研究发现c-erbB2型扩增和c-erbB2蛋白过度表达可预测局部乳腺癌患者的疾病结局（综述[9]).

拓扑异构酶的α亚型是DNA复制中的一种关键酶，也是各种化疗药物（如蒽环类药物或骨骺毒素）的靶点。该基因位于c-erbB2型染色体17q21上的基因，编码170k道尔顿蛋白。这种酶通过诱导两条DNA链上的单链断裂，催化DNA的解卷形成部分未卷曲的形式。这些断裂允许双链DNA通过缝隙[10]. 蒽环类药物是治疗乳腺癌最广泛使用的一类细胞毒药物，通过捕获DNA链断裂中间产物来抑制拓扑异构酶IIα，从而导致DNA持续断裂。

c-erbB2和拓扑异构酶IIα蛋白对乳腺癌患者的预后都有重要作用[11]. 有趣的是，高比例的原发性乳腺肿瘤c-erbB2型扩增还显示其他基因的基因拷贝数改变，如拓扑异构酶IIα位于c-erbB2型17号染色体上的位点[12，13]. 尽管拓扑异构酶IIα基因改变（扩增或缺失）仅见于c-erbB2型-放大的乳腺肿瘤[三，12-14]，关于这两个基因在乳腺肿瘤样本中的蛋白质表达状态的数据存在争议。Jarvinen及其同事报告了c-erbB2和拓扑异构酶IIα蛋白表达的高度相关性[15]. 相反，在最近发表的一项研究中，发现33人中有14人拓扑异构酶IIα-肿瘤扩增后，拓扑异构酶IIα蛋白在不到10%的肿瘤细胞中存在[16]. 另一项研究表明，拓扑异构酶IIα在30%的c-erbB2基因非放大肿瘤[17]. 从这些研究中可以得出结论，基因扩增只是导致拓扑异构酶IIα蛋白高胞内水平的许多机制之一。这与拓扑异构酶IIα的表达在多个水平上受到调控的事实相一致，包括转录、翻译和翻译后机制[18]. 这些数据表明拓扑异构酶IIα和c-erbB2蛋白的表达可能独立预测乳腺癌的临床预后。因此，我们分析了c-erbB2和拓扑异构酶IIα蛋白表达状态对大样本原发性乳腺癌患者预后的影响。

材料和方法

结果

c-erbB2过度表达对预后的影响

免疫反应评分超过2或3的肿瘤被认为过度表达c-erbB2。因此，43例（19.1%）患者显示该癌基因过度表达。c-erbB2过表达患者的年龄、分期、组织学标准和受体状态分布与c-erbB2阴性亚组相似（数据未显示）。

然而，在单变量统计分析中，前患者的生存率明显较低（log秩17.94；P（P）< 0.0001). c-erbB2过度表达肿瘤患者的中位总生存时间为55个月，5年生存率为46.0%。相反，c-erbB2阴性组未达到中位生存时间。该组的5年生存率为78.3%（图。​（图1a）。1a个). c-erbB2过度表达肿瘤患者从蒽环类药物辅助治疗中没有明显获益，甚至在所有分析组中预后最差（log秩10.17；P（P）= 0.001; 见下文）。

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图1

乳腺癌患者c-erbB2和拓扑异构酶IIα蛋白表达的总体生存率。（a）有（实线）或无（虚线）c-erbB2蛋白过度表达的患者。在单变量统计分析中差异显著（log rank 17.94；P（P）< 0.0001).（b）拓扑异构酶IIα蛋白阳性肿瘤患者25%以上肿瘤细胞（实线）与拓扑异构酶IIα阳性肿瘤患者（虚线）的生存时间存在显著差异（对数秩15.59；P（P）= 0.0001).

拓扑异构酶IIα表达的影响

拓扑异构酶IIα染色是严格意义上的核染色，在不同组织样品之间差异很大。为了研究拓扑异构酶IIα蛋白不同水平过度表达的影响，我们分析了0-5%、6-25%、26-75%和75%以上阳性细胞患者的生存曲线（数据未显示）。这些分析表明，当拓扑异构酶IIα在25%以上的细胞中高表达时，患者的存活率明显较低。因此，为了进一步分析，过度表达被定义为25%以上阳性染色的肿瘤细胞。77名患者（34.2%）的亚组肿瘤过度表达拓扑异构酶IIα。如图所示。​图1b，1亿在单变量Kaplan–Meier分析中，这些患者的生存期（中位数80个月；5年生存率54.4%）明显低于那些没有拓扑异构酶IIα过度表达的患者（中位数未达到；5年存活率80.3%；对数秩15.59，P（P）= 0.0001). 表达拓扑异构酶IIα的肿瘤比例随着组织学分级而增加（χ²测试，P（P）< 0.001). 在没有拓扑异构酶IIα过度表达的样本中，激素受体阳性肿瘤患者的比例明显较高（χ²测试，P（P）= 0.004).

拓扑异构酶IIα表达对预后的影响取决于分期：尽管无论拓扑异构酶IIα是否表达，IV期患者的预后都同样差（未显示），但当拓扑异异构酶Ⅱα高表达时，II期和III期患者的存活率显著较低（log rank 9.35，P（P）=0.002（WHO II期）；对数秩4.76，P（P）=0.029，对于WHO第三阶段；图。​图2a）。2a个). 在I期患者中，相似程度的生存差异在统计学上并不显著，可能是因为样本量较小（图。​（图2a2a个).

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图2

拓扑异构酶IIα蛋白表达对分期和分级的预后影响。在25%以上的肿瘤细胞（实线）中拓扑异构酶IIα阳性的肿瘤患者与在25%以下的肿瘤细胞中拓扑异构酶IIα表达的肿瘤患者（虚线）的分期进行比较（a）和分级（b）肿瘤。2期和3期肿瘤的差异有显著性(P（P）<0.05）以及2级和3级肿瘤(P（P）< 0.05).

拓扑异构酶IIα的表达增加了组织学分级的预后信息。该分析仅限于2级和3级肿瘤，因为在1级疾病患者中仅观察到少数死亡病例。表达拓扑异构酶IIα的肿瘤患者在两种2级肿瘤中的生存率均较低（log rank 5.08；P（P）<0.05）和3级肿瘤（log秩7.86；P（P）=0.005；图。​图2b2亿).

此外，拓扑异构酶IIα表达对预后的影响明显依赖于肿瘤的类固醇激素受体状态：雌激素或孕激素受体阴性的肿瘤患者无显著差异（log秩0.94；P（P）= 0.33; 图。​图3，三然而，在25%以上的肿瘤细胞中检测拓扑异构酶IIα，发现受体阳性乳腺癌中存在预后不良的亚组（log秩12.0；P（P）= 0.0005; 图。​图3，三，左侧面板）。

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图3

拓扑异构酶IIα蛋白表达对激素状态的预后影响。在激素状态方面，将肿瘤细胞中拓扑异构酶IIα阳性的患者（实线）与肿瘤细胞中表达拓扑异构酶IIα的患者（虚线）进行比较。雌激素受体或孕激素受体阳性的肿瘤之间差异显著（对数秩12.0；P（P）= 0.0005).

我们进一步研究了拓扑异构酶IIα表达对预后的影响是否仅限于接受非蒽环类或蒽环族辅助治疗方案的患者。与c-erbB2-过表达肿瘤的结果类似（图。​（图4b），4b个)蒽环类药物治疗不能逆转拓扑异构酶IIα表达对预后的负面影响（log秩4.74；P（P）= 0.02; 图。​图4a4a类).

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图4

接受非蒽环类药物治疗或蒽环类药物化疗的患者的生存率。（a）拓扑异构酶IIα阳性细胞少于25%（虚线）和阳性细胞多于25%（实线）的患者之间的差异在两组患者中均显著(P（P）< 0.05).（b）在接受非蒽环类药物辅助治疗的患者组中，c-erbB2过度表达（实线）或不过度表达（虚线）的患者之间存在显著差异（左图；P（P）=0.002）或含蒽环类的方案（右侧面板；P（P）= 0.001)

c-erbB2和拓扑异构酶IIα的共表达

过度表达c-erbB2和拓扑异构酶IIα的亚组重叠但不相同。126例肿瘤（56%）未显示c-erbB2或拓扑异构酶IIα过度表达。五十六（25%）名患者的肿瘤仅过度表达拓扑异构酶IIα；22例（9.8%）仅显示c-erbB2过度表达。21例（9.3%）肿瘤的两种蛋白染色增强。这些组在临床分期方面无显著差异（表​（表4）。4). 然而，在研究过的一种或两种蛋白过度表达组中，观察到激素受体阴性癌症的比例在统计学上显著高于对照组（χ²测试，P（P）= 0.006; 表​表4）。4). 对这四组患者的生存分析表明，任何一种过表达都会对预后产生独立的负面影响。如图所示。​图5，5c-erbB2和拓扑异构酶IIα均无过表达的乳腺癌患者的远期预后最好（未达到中位生存时间；5年生存率为84.4%）。c-erbB2或拓扑异构酶IIα的过度表达与中间生存期相关（对于c-erbB2-过度表达的肿瘤，中位生存期为68个月，5年生存率为57.7%；对于拓扑异构酶IIα-过度表达的患者，中位存活期为104个月，五年生存率是63.7%）。这两种蛋白过度表达的患者预后最差，中位生存期为45个月，5年生存率为33.0%（对数秩29.71；P（P）< 0.0001; 图。​图55).

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图5

c-erbB2和拓扑异构酶IIα过度表达和不过度表达患者的生存率。c-erbB2或拓扑异构酶无过度表达的患者（虚线）、肿瘤过度表达这两种蛋白之一的患者（c-erbB2，点虚线；拓扑异构酶IIα，实线）和肿瘤同时过度表达c-erbB和拓扑异酶IIα的患者（实线）之间的差异显著（对数秩29.71；P（P）< 0.0001).

表4

c-erbB2和拓扑异构酶IIα过表达患者的临床特征

参数	价值
拓扑异构酶过度表达	不存在	不存在	出席	出席
c-erb B2过度表达	不存在	出席	不存在	出席
阶段，n个(%)
我	29 (24.2)	3 (15.0)	6 (11.1)	2 (10.0)
二	59 (49.1)	7 (35.0)	36 (66.6)	11（55.0）
三	29 (24.2)	9 (45.0)	9 (16.7)	6 (30.0)
四、	3 (2.5)	1（5）	3 (5.6)	1 (5.0)
总计一	120	20	54	20
受体状态，n个(%)
ER或PR阳性	92（79.3）	12 (57.1)	32 (58.2)	10 (52.6)
PR和PR阴性	24 (20.7)	9（42.9）	23 (41.8)	9 (47.4)
总计b条	116	21	55	19

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^一对214例资料完整的患者进行分期分析；^b条对211例资料完整的患者进行受体状态分析。雌激素受体；PR，孕酮受体。

在多元Cox回归模型中（表​（表55和​和6），6)肿瘤分期、雌激素受体、拓扑异构酶IIα和c-erbB2均独立预测疾病相关死亡。随后纳入分级远远超出了统计显著性（表​（表5）。5). 通过分级（拓扑异构酶IIα×分级；表​表5）5)似乎值得考虑。然而，在Wald统计中，评分与最后提到的交互作用项并没有达到显著性(P（P）= 0.11). 通过分级（c-erbB2×分级；表​表5）5)拓扑异构酶IIα（c-erbB2×拓扑异构酶IIα；表​表5）5)没有明显的优势。因此，表中所示的最终模型中不包括最后两个交互项​表66.

表5

Cox回归模型的选择(N个=196）

逐步包含变量	部分对数似然增加2倍（χ2分布式）	数据流	P（P）
阶段	23.43	三	< 0.0001
雌激素受体	7.92	1	0.005
c-erbB2型	7.34	1	0.01
拓扑异构酶IIα	9.85	1	0.002
分级	0.01	1	0.92
拓扑异构酶IIα×分级	4.64	1	0.03
c-erbB2×分级	1.74	1	0.19
c-erbB2×拓扑异构酶IIα	0.17	1	0.68

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从零模型开始，上述变量的连续添加在前四个步骤中显著改进了考克斯比例风险模型。在这个意义上，前四个变量可以被视为独立的预后因素。df，自由度。

表6

最终Cox回归模型中线性预测器的系数(N个= 196)

变量	B类	经验(B类)	P（P）	95%CI用于exp(B类)
阶段
二一	0.72	2.06	0.14	0.79–5.36
三一	1.69	5.4	0.001	1.97–14.74
四、一	3.25	25.68	<0.001	6.72–98.17
雌激素受体（阳性与阴性）	0.58	1.79	0.039	1.03–3.11
c-erbB2（正与负）	0.82	2.26	0.0036	1.31–3.93
拓扑异构酶IIα（阳性与阴性）	0.39	1.48	0.005	0.77–2.83
分级（3与｛1,2｝）	t0.62	0.54	0.15	0.23–1.25
拓扑异构酶IIα×分级b条	1.21	3.35	0.035	1.09–10.36

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^一危险比exp(B类)给定阶段的相对风险是该阶段相对于阶段I的相对风险。^b条相互作用项对存活率的影响可以描述为：如果分级等于G1或G2，拓扑异构酶IIα阳性与阴性的危险比为1.48（95%置信区间（CI）0.77至2.83）；如果等级等于G3，则该危险比为4.96（95%置信区间2.00至12.29）。

讨论

c-erbB2和拓扑异构酶IIα的过度表达独立地预测了这一回顾性系列患者的不良生存率。拓扑异构酶IIα和c-erbB2在重叠但不同的患者亚群中过度表达。此外，拓扑异构酶IIα过度表达对预后的影响似乎独立于多变量分析中的其他预后变量，并使c-erbB2阳性和c-erbB2-阴性患者的预后显著恶化。此外，拓扑异构酶IIα过度表达对预后的影响取决于类固醇受体状态。本研究结果表明，蒽环类药物治疗不能逆转拓扑异构酶IIα或c-erbB2表达对预后的负面影响。

最近的报道研究了拓扑异构酶IIα的表达与乳腺癌的病理变量、化疗反应和增殖率之间的相互作用。然而，只有非常有限的系列报道了依赖拓扑异构酶IIα的原发性乳腺癌患者的长期预后。Di Leo和同事[2]参与一项随机临床试验的受试患者比较了CMF（环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶）和蒽环类药物治疗方案。以下患者的亚组拓扑异构酶IIα放大效果并没有比其余患者明显差。然而，结果在很大程度上取决于所应用的辅助治疗。另一系列通过免疫组织化学方法测量拓扑异构酶IIα蛋白的结果显示，拓扑异构酶IIα的表达受到了与我们研究中相似程度的显著不利影响[23]. 杜贝克及其同事[16]已经表明，蛋白质表达和基因扩增的测量可以识别不同的患者亚群。这些数据表明，检测该蛋白可能与肿瘤的生物学特性更好地相关，因此可能比基因分析更准确地预测临床结果。我们研究的数据支持拓扑异构酶IIα的蛋白表达是独立于c-erbB2的新诊断乳腺癌患者预测长期预后的相关因素的观点。

在拓扑异构酶IIα低表达的细胞中，蒽环类药物对细胞株的治疗效果较差[24，25]. 一项随机临床试验的回顾性亚组分析表明拓扑异构酶IIα基因扩增仅限于未接受蒽环类化疗的患者[2]. 此外，与蒽环类药物相关的肿瘤反应的其他研究也表明，肿瘤细胞的基因扩增状态与拓扑异构酶IIα和临床反应[三-5]. 这与最近发表的一项回顾性研究形成对比，在该研究中c-erbB2型和拓扑异构酶IIα不能预测蒽环类药物的反应[26]. 我们的分析表明，拓扑异构酶IIα蛋白过度表达对接受含蒽环类药物辅助化疗的患者和未接受此类药物辅助化疗患者的预后都有负面影响。此外，拓扑异构酶IIα阳性和拓扑异构酶IIα阴性患者的生存率差异超过了预期通过化疗治愈的患者比例。蛋白质过表达与多种其他预测高增殖率或高恶性程度的分子标记物有关，如Ki67表达或非整倍体[16，23，26，27]. 这些发现支持这样的观点，即拓扑异构酶IIα蛋白的过度表达表明无论采用何种治疗，预后都很差。拓扑异构酶IIα基因扩增与c-erbB2型蛋白质表达状态的扩增（概述[6]). 因此，基因扩增对临床和长期结果的预测价值可能与c-erbB2型或拓扑异构酶IIα基因。由于共同扩增是这两个基因在乳腺癌中发生遗传改变的主要机制，临床观察将每个基因在蒽环类药物辅助治疗的临床反应中的作用分开。

拓扑异构酶IIα过度表达的生物学作用尚不清楚。缺乏拓扑异构酶II的细胞不能完成正常的细胞周期，因此不能存活[28，29]. 此外，研究表明，拓扑异构酶IIα在不同人类细胞系中的实验性过表达会导致细胞凋亡[30]. 从这些观察结果可以得出结论，低强度染色的细胞不是完全缺乏拓扑异构酶IIα功能的细胞。这与正常细胞拓扑异构酶IIα也呈弱阳性的观察结果一致。高表达可能与高增殖率有关。我们发现拓扑异构酶IIα的表达与组织学分级有关，并且观察到拓扑异构酶IIα与Ki67表达和其他增殖标记物有一定的相关性，这一观点得到了支持[23，27]. 然而，具有结构性过表达的活细胞也可能间接表明凋亡途径的缺陷。这两种假设都可能为拓扑异构酶IIα过度表达与更具侵袭性的肿瘤表型相关的观察提供了合理的解释。

结论

我们的数据表明拓扑异构酶IIα的蛋白表达是一个预后因素，与c-erbB2、分期和组织学分级无关。此外，这项探索性研究的结果表明，蒽环类药物治疗不能逆转拓扑异构酶IIα或c-erbB2表达对预后的负面影响。然而，由于这些亚组中仍有少量患者，关于拓扑异构酶IIα或c-erbB2对蒽环类药物敏感性的预测价值尚不能得出确切结论。我们的结果支持以下观点：拓扑异构酶IIα基因或拓扑异构酶IIα蛋白可能产生不同的结果，这取决于所用的方法。在规划拓扑异构酶IIα的预测和预后价值的前瞻性研究时，应考虑到这一点。

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

PF、WS、WEA、JD和HvdK负责生成假设并更正手稿。PF、AG和WS负责手术和收集患者资料。PF、CMC和HvdK负责免疫染色以及检查和解释结果。PF、JD和WEA对数据进行了统计分析。PF、HvdK和WEA负责撰写手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

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