非片段负链RNA病毒的基因表达受相对于单个转录启动子的高度保守的基因顺序控制(19). 我们利用这种调节机制来改变原型弹状病毒的基因表达水平，水泡性口炎病毒（VSV）是一种重要的家畜病原体，通过将其转化为cDNA克隆并恢复基因顺序重排的病毒，从而改变了易位基因的表达水平(三,9,21). 这使我们能够测试基因重排作为一种可预测的改变基因表达水平的手段是否会影响自然宿主的疾病潜能。
VSV的负链RNA基因组有五个基因，编码五种病毒结构蛋白：核衣壳蛋白N，在复制过程中基因组RNA包被所需的化学计量量；磷酸蛋白，P；依赖RNA的RNA聚合酶，L；基质蛋白，M；和附着糖蛋白G。这些基因的序列为3′-N-P-M-G-L-5′，其转录是从单个3′聚合酶进入位点开始的(1,4). 由于每个基因连接处的转录减弱，位于最靠近3′启动子的基因转录最丰富，位于更多启动子远端的基因转录依次降低丰度(12).
在之前的工作中，我们证明了复制所必需的单个基因，即核衣壳基因，转移到距离单个转录启动子依次更远的位置，会逐步减少该基因的表达，并降低细胞培养中的生长潜力和小鼠的致死率(21). 复制潜力的降低并没有影响变异病毒对小鼠随后的致命攻击诱导保护性免疫的能力(21). 在随后的工作中，我们还发现，编码主要VSV中和表位的糖蛋白基因靠近3′启动子的运动增加了感染细胞中G蛋白的表达(9). 与具有野生型基因序列的病毒相比，基因工程使G位于3′位的病毒在接种小鼠中诱导了更早且增强的免疫反应(9).
牛、马和猪都会自然感染VSV，这种病毒会导致舌头和口腔上皮的水疱形成和溃疡，有时还会出现脚部和乳头的损伤(14). 这些症状与口蹄疫难以区分，口蹄疫是牲畜最具破坏性的外来疾病之一。因此，VSV因检疫和贸易壁垒造成严重的经济损失，也因疾病本身造成的生产力下降而造成损失。两种VSV血清型，新泽西（VSV-NJ）和印第安纳（VSV-IN），是从墨西哥南部到南美洲北部的地方流行病毒(14). 在美国，VSV偶尔发生，最近由VSV-In引起的疫情发生在1997年和1998年，主要感染马(16). 在此之前，1995年爆发了一场由VSV-NJ引起的大规模牛流感疫情，对科罗拉多州的牛肉业产生了重大影响(5). 家猪很容易感染两种血清型的VSV。
开发VSV亚单位或DNA介导疫苗的努力收效甚微(7,23). 只有在紧急情况下才尝试接种现场活菌株(13). 然而，尽管抗另一种弹状病毒（狂犬病病毒）的减毒活疫苗取得了成功并得到了应用，但还没有研究VSV的减毒疫苗(2). 目前还没有令人满意的VSV感染疫苗。
在本研究中，我们评估了VSV基因重排对VSV三种自然宿主之一猪的病毒复制、致病和引发保护性免疫反应能力的影响。我们比较了病毒的致病性和免疫原性，其中对病毒复制至关重要的核衣壳基因被转移到启动子远端位置以下调其表达，而糖蛋白基因被转移至启动子近端位置以增加其表达(9). 下面的数据表明，操纵单个基因的位置可以改变VSV的发病潜力。由于单分裂负链RNA病毒尚未被报道进行同源重组(18)，基因重排应该是不可逆的。这些研究使我们能够测试基因重排是否为开发稳定减毒病毒提供了合理的策略，这些减毒病毒具有针对此类病毒的活病毒疫苗所需的特性。
材料和方法
动物。
从当地繁殖者处获得的20头雌性约克郡猪（8至10周龄，25至30 kg）被随机分为五组，每组四只动物，每组被安置在梅花岛动物疾病中心生物安全等级3（BL-3）隔离条件下的单独房间中。根据血清中和抗体检测，所有动物的VSV均为阴性。每天监测动物的体温和行为，并由穿戴防护服和便携式HEPA呼吸器的人员按照以下所述的时间间隔收集病毒分离和抗体滴定样品，这些人员在进入每个隔离室时更换了呼吸器。
细胞和病毒。
幼仓鼠肾（BHK-21）细胞系用于病毒池的生长、病毒分离和中和分析。病毒池通过Vero 76细胞的菌斑试验进行滴定。根据N基因和G基因的位置，野生型病毒的基因序列为3′-N-P-M-G-L-5′，称为N1G4，基因组重排的病毒为3′-G-N-P-M-L-5′（G1N2）、3′-P-M-G-N-L-5′和3′-G-P-M-N-L-5’（G1N4）。前面已经描述了cDNA克隆的构建方法和从这些克隆中回收病毒的方法(9,21). 用于生成重排基因组的cDNA构建使用了不向基因组引入任何其他变化的方法(三). 如前所述，通过转染恢复基因组重排的病毒(9,22). 从37℃转染的细胞中回收病毒N1G4（WT）和G1N2；G3N4和G1N4病毒仅从31°C转染的细胞中回收。如前所述，带有N基因远端移动启动子的病毒复制对温度有不同程度的敏感性，这取决于基因的顺序(21). 除非另有说明，否则在细胞培养中对这些病毒进行的所有后续工作都是在各自的温度下进行的。如前所述，在BHK-21细胞中以低感染多重性传代扩增病毒库(9). 重组的、工程化的VSV病毒在15至45%蔗糖速度梯度上进行了条带，以将其与任何剩余的vTF7-3分离。通过在BHK-21细胞中再传代一次，制备动物感染用的菌种。通过使用逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因组的重排区域，然后进行限制性内切酶分析，确认基因顺序。
接种和取样。
使用双重皮试涂布器（Duotip-test；Lincoln Diagnostics，Decatur，Ill.）和2.5×10刺穿用木聚嗪-氯胺酮-弹性唑镇静过的动物的鼻子表皮20次7将病毒PFU置于100μl Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中的划痕区域。然后通过重复圣礼程序对接种物下的区域进行再敏化，将动物固定在固定位置，直到接种物进入现场。对照组动物以相同的方式进行治疗，仅给予100μl DMEM。在接种程序之后，病毒制剂都在原始滴度的四倍以内。在接种病毒前后的不同时间，使用改良的咽刮器或验证刮器获取食管咽液（OPF）(6; J.Lubroth，个人沟通）。在接种病毒前后的不同时间采集鼻拭子和血清样本。对出现的任何病变进行拭子取样并进行病毒分离测试。将拭子和OPF样本收集到含抗生素的DMEM中。
初次接种后36天，用4.2×107如上所述，通过鼻部表皮划痕和接种，每只N1G4动物的PFU。每天监测动物的体温和行为，并如上所述采集OPF、鼻腔和血清样本。
临床疾病评估。
通过使用基于病变大小和位置的临床评分系统评估病变形成，评估接种不同病毒导致的疾病程度。0分表示无可见病变；接种部位出现直径<2cm的病变，给予1分；2分表示接种部位有直径>2cm的病变或多处病变；3分表示非感染部位病变<2cm；4分表示病变>2cm或非感染部位有多处病变。在一只动物身上发生的一种或多种病变可累积>4分。
病毒隔离。
样品经离心澄清后，将鼻拭子、OPF和病变拭子接种在96个平板的BHK-21细胞单层上，以分析是否存在病毒。将上清液连续稀释并添加到四个孔中的细胞中。给予N1G4和G1N2的动物样品在37°C下培养3天，而来自G1N4和G3N4的样品在31°C下培育4天。
确认病毒身份和基因顺序。
收集细胞病变效应（CPE）阳性的培养孔，并使用VSV特异性引物通过RT-PCR确认病毒分离物的身份。VSV引物的设计使得它们能够区分重排的病毒基因组。引物以其基因靶点（N、P、M、G或L）、核苷酸位置和意义命名，即正向（f）或反向（r），野生型序列为N-1314f/P-1956r和M-2844f/G-3198r，G1N2为G-4284f/N-121r和M-2804f/L-4925r，G3N4为G-4284/N-121r和N-1314f-L-4925r，G1N4为G4284f/P-1956r。
中和试验。
收集血清，并在56°C下热灭活30分钟。将两倍的血清系列稀释液与150 50%的组织培养感染剂量N1G4/ml在37°C下孵育1小时。将样品添加到BHK-21细胞中，在96个平皿中进行四次检测，在37°C下培养3天，然后用10%甲醛固定，并用结晶紫染色。记录了对野生型N1G4 VSV的CPE产生100%抑制作用的稀释倍数的倒数。
结果
猪中工程病毒的发病机制。
具有N基因的病毒的致病性在基因顺序上从第一个移动到第二个或第四个，而G基因在基因顺序中从第四个移动到第一个或第三个，如图所示。与VSV自然宿主猪中具有野生型基因序列的病毒进行了比较。四组年轻雌性约克郡猪用2.5×10的鼻子划痕法皮下接种7以下病毒之一的每只动物的PFU：N1G4（WT）、G1N2、G3N4或G1N4。第五组只接种培养基，作为模拟感染对照组。在BL-3条件下，每组均被保存在单独的隔离室中，并每天监测VSV感染特征性水泡损伤的形成和直肠温度(11).
3天前接种了基因序列重新排列的工程VSV的猪的鼻子，如下图所示（“le”和“tr”分别表示3′先导序列和5′拖尾序列）。猪被麻醉，2.5×107按照材料和方法中的描述应用所示病毒的PFU。动物感染了N1G4（WT）、G1N2、G3N4、G1N4（分别为面板A至D）。
在接种后的第二天，所有感染野生型N1G4病毒的动物的接种区域都出现了直径小于2 cm的小泡。接种N1G4的动物在接种后的第3天和第4天，皮损的大小增加到直径>2 cm，并且出现了多个皮损。接种后3天出现在鼻部的这些损伤示例如图所示。A.图中总结了接种四种不同病毒之一的每头猪随时间的临床得分。临床评分由材料和方法中描述的病变大小、数量和分布决定。在四只接种N1G4的猪中，有三只的病变仍然局限于猪的鼻子（图。A和A） ●●●●。然而，其中一只接种N1G4的猪在蹄上出现水泡，另一只在舌头上出现水疱，使其临床评分增加到6分（图。A） ●●●●。一般来说，这些病变的大小、分布和严重程度与现场分离的VSV-In引起的病变无明显区别（L.L.Rodriguez，未发表的结果）。值得注意的是，从我们的cDNA克隆中回收并用于这些研究的N1G4野生型VSV-IN引起的临床疾病相当于VSV-IN的现场分离物，尽管重组病毒自回收以来在细胞培养中仅繁殖了有限的次数，并且从未通过动物传代。
每组四只动物接种重组病毒后的临床评分。猪接种2.5×107材料和方法中描述的病毒PFU，以及每天评估损伤的形成。临床评分基于病变的大小和位置。每个符号代表一种动物。
接种G1N2病毒后，到第2天，所有猪的接种部位都会形成小水泡（<2 cm）（图。B和B） ●●●●。然而，与野生型N1G4病毒引起的发病机制相反，接种G1N2的猪身上存在的水泡并没有随着时间的推移而增大，也没有出现多处病变。此外，G1N2接种动物的病变仅限于接种部位。N1G4-和G1N2-接种动物在第2天开始出现病变。接种N1G4野生型病毒的动物在第9天之前病变仍然可见，之后感染组织的愈合变得明显。相反，G1N2感染动物的病灶在第6天完全愈合。总的来说，G1N2感染引起的临床表现不如野生型病毒引起的严重，表明G1N2病毒部分减弱（图。和，面板A和B）。
与野生型或接种G1N2的动物的结果相反，在接种G3N4或G1N4的动物中未观察到水泡（图。和，C和D）表明这些病毒被高度减毒。在所有动物中均未观察到每日直肠温度的变化（数据未显示）。这与以前对很少引起发热的现场VSV分离株进行皮内接种的结果一致(11,20). 仅接受DMEM的模拟接种动物对接种程序无不良反应（数据未显示）。
总之，第一位N的野生型病毒N1G4引起的疾病与印第安纳州VSV现场分离株相似，而第二位N的G1N2引起的临床症状减轻，第四位N的病毒G1N4或G3N4没有引起可检测到的疾病（图。和). 综上所述，这些结果表明，N基因转移到远离启动子的连续位置导致临床疾病逐步减少。
接种后的病毒分离。
为了检测病毒在给药后的复制能力，鼻腔拭子和OPF是可靠的感染指标(20). 按照材料和方法中的描述进行病毒检测。从感染后第1天到第6天，从所有给予N1G4（WT）的动物的鼻拭子或OPF样本中回收病毒（图。). 也从感染后第1天开始接受G1N2的所有动物中回收病毒，但除第7天的单个样本外，G1N2病毒通常在第5天之后未被分离。除了鼻腔和OPF样本外，在所有注射N1G4的动物中，还从接种区域长达6天的拭子中鉴定出病毒。这与给予G1N2的组形成对比，在G1N2组中，没有从一只动物的鼻子中分离出病毒，并且在剩余的动物中，在3-4天后在鼻子上没有发现病毒，这再次表明该病毒的表型减弱（数据未显示）。
用重组病毒接种后从猪中分离出病毒。猪接种2.5×107材料和方法中描述的病毒PFU。按照指示采集鼻拭子和待检拭子。对样品进行滴定，并通过在BHK-21细胞上37°C培养3天（N1G4（WT）和G1N2）或31°C培养4天（G3N4和G1N4）回收病毒。每个盒子代表一只动物，显示了病毒性CPE阳性（■）或阴性（□）的样本。RT-PCR证实了病毒的存在和基因序列。
尽管在类似样品中检测到N1G4和G1N2相对容易（图。). 此外，G3N4或G1N4病毒并没有从鼻部接种区域的拭子中回收（数据未显示）。这些数据表明，这些病毒在猪体内复制时高度减毒。
基因顺序和基因间连接保持稳定。
为了测试从感染N1G4和G1N2的动物体内传代后回收的病毒是否具有遗传稳定性，从选择的病毒阳性培养物中提取病毒RNA，并使用特定的引物集，通过RT-PCR扩增每个病毒特有的基因末端和基因连接区。PCR产物在相关基因连接处测序。未观察到基因顺序、基因末端序列或基因间连接的变化（数据未显示），表明重排的基因顺序在自然宿主中复制期间是稳定的。
体液免疫反应。
通过评估接种后不同时间血清中的中和抗体水平，测定野生型和重排病毒刺激体液免疫反应的能力。接种N1G4（WT）的动物的血清中和抗体水平为2.5至4.0 log10，平均滴度为2.9 log10免疫后7天（图。A） ●●●●。在随后的4周观察中，这些中和抗体水平保持不变。接受G1N2的动物具有类似的高滴度，平均为2.9 log10在第7天，滴度在整个研究期间保持较高（图。B） ●●●●。接受G3N4的动物的中和抗体滴度上升至平均值2.0 log10该值虽然比接种N1G4或G1N2后的滴度低10倍，但表明G3N4病毒能够通过单次接种刺激体液反应，而鼻拭子或OPF样品中没有检测到复制病毒水平（图。C） ●●●●。
接种重排病毒后的血清中和抗体滴度。猪接种2.5×107材料和方法中描述的病毒PFU。每隔7天收集一次血清，并测定中和抗体水平。给予G1N4的动物增加5.7×107第28天的PFU。条形图显示每组的平均值和范围。（虚线表示分析的灵敏度极限。）
接受G1N4病毒感染的动物的滴度上升很低，仅在背景水平以上检测到，并且这些滴度并没有随着时间而显著增加（图。D） ●●●●。由于反应不佳，该组动物于第28天重新接种在鼻子上，接种量为5.7×107每头猪的G1N4病毒PFU。在这些动物中未发现任何临床症状。7天后收集血清，滴度急剧上升至3.3 log10在所有四只动物中观察到（图。D） ●●●●。这些数据表明，尽管我们无法在这些动物中检测到复制病毒，但它们在接种后7天内仍有免疫反应，免疫反应的强度等于或大于N1G4野生型病毒免疫后7天的强度。激发当天（第36天）各组免疫动物中出现的中和抗体的平均滴度如图所示。接种N1G4和G1N4的动物的平均滴度分别为3.1和3.3 log10分别是。接种G1N2的动物的滴度为2.4 log10接种G3N4的人的滴度为1.9 log10.
具有重排基因序列的病毒具有抵御野生型病毒攻击的能力。
为了评估重组病毒的疫苗潜力，所有接种病毒的动物和模拟接种对照组均接受4.2×10的攻击7首次接种病毒后36天和第二次接种G1N4组后7天，每头猪的野生型N1G4病毒PFU。挑战的途径与最初接种的相同：通过鼻子表皮的划痕。观察动物的临床症状并按上述方法进行评分。此外，在发病后的第一周每天采集鼻拭子和OPF样本，并检测是否存在病毒。
激发后，接种N1G4、G1N2或G1N4组的任何动物均未观察到损伤，表明这些动物完全免受临床疾病的影响（图。A、 B和D）。给予G3N4的动物获得了部分保护，从激发后第2天到第4天，两只动物出现了可见的损伤。1例病灶较小（<2cm），2例病灶>2cm。在这两种情况下，病变仅出现在接种部位，并在第5天完全愈合（图。C） ●●●●。
猪感染N1G4（WT）病毒后的临床评分。首次注射4.2×10病毒36天后，对猪进行麻醉和激发7材料和方法中描述的野生型病毒PFU。每天监测病变的形成。临床评分基于材料和方法中描述的结果病灶的大小和位置。每个符号代表一种动物。
相比之下，未接种疫苗的对照组中的所有动物在激发后第1天和第2天开始并持续到第5天出现损伤（图。E） ●●●●。最初，病灶较小（<2cm），但在所有病例中都增加到>2cm。四只动物中有三只在接种部位以外的部位出现病变；两例病变出现在舌上，另一例出现在蹄冠状带上。
从第1天开始到第5天，从所有受攻击的未接种疫苗的对照动物的鼻拭子或OPF中回收病毒，证实了临床数据（图。). 从第1天到第3天，从两只接种了G3N4的动物的鼻拭子中回收病毒，这两只动物在攻击后的鼻子上出现了损伤；接种G3N4的动物在攻击后没有发现病毒，这些动物没有受到损伤（图。). 为了确定攻击后从两个G3N4免疫动物中回收的病毒是N1G4攻击病毒还是免疫G3N5基因型，从组织培养样品中提取病毒RNA，并用RT-PCR分析基因间连接，然后进行序列分析。对于这两种动物，发现回收的病毒是N1G4挑战病毒（数据未显示）。
用N1G4（WT）病毒攻击后从猪中分离病毒。服用挑战性病毒后，在指定的时间点采集鼻拭子和待检拭子。按照材料和方法中的描述滴定样品。每个方框代表一只动物，显示了病毒性CPE阳性（■）或阴性（□）的样本。RT-PCR证实了病毒的存在和基因序列。
在激发后第1天的单个时间点，从N1G4免疫组中一只没有临床症状的动物的鼻拭子中培养病毒（图。). 不可能知道这是输入挑战病毒的恢复还是挑战病毒的复制。
这些数据表明，对临床症状的保护作用与中和抗体滴度之间有着密切的联系。用G3N4免疫的两只动物在激发后没有出现疾病，激发前抗体滴度较高（2.1和2.3 log10)两只患临床疾病的动物（1.6和1.9 log10).
激发后抗体水平。
在激发当天以及之后的第3、5和7天，分析所有动物的中和抗体滴度。用N1G4免疫的动物的滴定度在激发时已经很高，但仍接近该水平，并略有增加（图。A） ●●●●。最初用G1N2免疫的动物在攻击到接近N1G4水平后5至7天，其滴度上升了约10倍（图。B） ●●●●。用G3N4免疫的动物在激发时滴度最低（1.9 log10)在挑战到与野生型相同的水平后，显示在第3天到第5天期间滴度增加了近100倍（图。C） ●●●●。G1N4免疫的动物在第28天的滴度较低，并且在激发前7天进行了第二次免疫，它们保持了通过增强获得的高滴度，但激发后没有进一步升高（图。D） ●●●●。
N1G4（WT）病毒攻击后的血清中和抗体滴度。如图图例所示，在注射激发病毒后的指定时间点采集血清。中和抗体水平通过材料和方法中所述的终点试验测定。条形图显示每组的平均值和范围。（虚线表示分析的灵敏度极限。）
讨论
我们测试了基因重排作为一种可预测的改变基因表达水平的手段是否可以改变自然宿主中VSV的疾病潜能，正如我们之前在小动物模型中所显示的那样(9). 数据表明，将VSV的核衣壳基因移动到连续的启动子远端位置，从而下调其表达，从而导致自然宿主中临床疾病的系统性逐步减少。据我们所知，这是首次报道一种方法，可以对负链RNA病毒引起的临床疾病进行增量操作。
基因重排使疾病逐步减少。
值得注意的是，从我们的cDNA克隆中恢复的VSV-IN在家猪中引起的临床疾病相当于通过现场分离物感染所观察到的疾病。这是首次使用来自cDNA克隆的VSV在自然宿主中诱导临床疾病。此外，该cDNA克隆的基因重排以恢复病毒，使N基因的启动子远端移到第二位置（G1N2），导致感染猪的临床病变程度降低（图。和). 该病毒在猪体内的复制似乎也略有减弱，因为从鼻子、鼻腔和OPF拭子中回收病毒的时间比使用N1G4病毒的时间短（图。). G1N2病毒也使G基因更靠近启动子，之前在小鼠中的实验表明，这导致免疫反应更早和增强(9). 感染G1N2病毒的猪的免疫反应与野生型几乎相同。这些发现表明，该病毒致病潜力的减弱是由于N基因表达减少和复制潜力降低所致。G基因向前移动可能有助于补偿复制潜力的降低，以帮助获得与接种野生型病毒后获得的中和抗体类似的中和抗体水平。
将N基因从启动子移到第四个位置，产生病毒G3N4和G1N4，这两种病毒都不会在自然宿主中引起临床疾病。它们在猪体内的复制能力也降低了，因为接种后在鼻子、鼻腔或OPF样品中都没有检测到病毒。与此同时，单次接种这些病毒的免疫反应导致中和抗体反应低于N1G4或G1N2（图。). 然而，尽管猪的复制潜能严重降低，这些病毒仍然能够诱导免疫反应。G3N4病毒在给药后抗体水平略有增加。此外，在第36天受到野生型病毒的攻击后，G3N4动物在5天后迅速反应，抗体滴度显著增加100倍。
同样，G1N4病毒在初次接种后诱导低抗体滴度；然而，当第28天进行第二次G1N4强化接种时，出现的快速反应等于或高于首次接种后7天野生型病毒的反应（图。). 在先前对小鼠的研究中，G1N4和G3N4病毒比G1N2或N1G4病毒诱导了更早且更高的抗体反应(9). 在猪身上，情况并非如此，我们将这些差异归因于自然宿主与小鼠模型中病毒接种途径和复制能力的差异。这些结果强调了尽可能研究自然宿主中病毒-宿主相互作用的重要性。
保护免受野生型病毒的挑战。
激发后，在接受过N1G4或G1N2单次接种或接受过两次G1N4接种的任何动物中均未观察到任何临床疾病。这三个组的中和抗体滴度在激发当天都很高（图。)和等于或大于家猪通过多种途径接种VSV现场分离株后报告的中和抗体滴度(20; L.Rodriguez，未发表的结果）。四只G3N4免疫动物中有两只受到保护，免受攻击。这些动物被证明是攻击前中和抗体滴度最高的动物。这些数据表明，中和抗体滴度与临床疾病防护之间有着密切的联系。使用表达VSV-G的重组痘苗病毒免疫牛也有类似发现(15).
此外，这些数据表明，尽管G1N2病毒的致病潜力降低，但其诱导的保护性免疫反应与只接种一次疫苗的野生型病毒一样强烈。N位于第四位的病毒在自然宿主中被完全减弱，在单次接种后表现出较低的免疫反应。然而，再次接种G1N4可诱导与野生型病毒诱导的免疫反应相同的免疫反应。因此，这些数据表明，有可能通过基因重排降低疾病可能性，并保留一种病毒，这种病毒可以充分复制，在没有临床疾病的情况下诱导保护性免疫反应。
由于水疱性口炎是一种强制性报告的疾病，任何减毒活疫苗不仅必须安全有效，而且必须与现场菌株区分开来，以便获得批准用于家畜。我们表明，通过基因间区域的RT-PCR可以很容易地将基因组重排的病毒与田间菌株区分开来。此外，通过使用cDNA衍生的病毒，可以在基因组中引入特定的变化，例如删除可用于血清学测试的特定抗原决定簇，以区分接种疫苗的动物和自然感染的动物。
基因重排在疫苗开发中的优势。
自从单核糖核酸尚未观察到进行同源重组(18)，基因重排被预测为不可逆。我们迄今为止对这些病毒和其他重新排列基因顺序的病毒所做的研究，没有理由怀疑这种预期。由于几个原因，基因重排可能提供一种合理的替代方法，用于开发针对非片段负链RNA病毒的稳定减毒活疫苗。经证明，减活病毒对人类和动物的许多疾病都有效，例如天花、黄热病、犬狂犬病、麻疹、腮腺炎和脊髓灰质炎。然而，衰减策略在很大程度上是经验的。RNA病毒基因组因其高突变率而引人注目，这归因于其聚合酶错误率以及缺乏校对和纠错机制。大多数RNA病毒以复杂的准种群存在(8,10)这对它们的生物学有重大影响。最明显的是，病毒种群构成了一个巨大的变种库，在面对环境变化时具有潜在有用的表型。病毒聚合酶的错误率、病毒群大小、传播历史和适应环境变化之间存在复杂关系的研究进展表明，经验衰减方法在本质上可能不如先前认为的可靠(17; 参考10以及其中的参考）。复制所需基因的重排利用控制基因表达的基本原理，即基因位置，来影响复制所需基因的表达变化，从而利用缺乏天然手段来逆转重排，即缺乏同源重组。这种衰减方式避免了病毒因有限数量的单碱基突变而衰减，通过聚合酶错误和随后的选择而恢复毒性的固有潜力。在这些研究中使用的重排病毒的基因序列在其自然宿主之一猪中引入和复制后是稳定的。
评估这些病毒长期进化和竞争适应性的研究正在进行中。预期会选择代偿突变；然而，很难想象可能补偿基因重排所导致的基因表达高度改变的突变，因为任何影响一个基因表达水平的突变也会影响所有下游基因的表达，因此恢复毒力的能力有限。
