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分子生物学细胞。2005年6月；16(6): 2891–2902.
doi（操作界面）：10.1091/桶。E04-09-0773号
预防性维修识别码：项目经理1142433
PMID：15800069

CD2相关蛋白参与细胞运动的线索D⃞V \8414]

帕斯卡尔·蒙佐,* 尼尔斯·C·高瑟,† 凯斯莱尔（Frédérique Keslair）,* 阿格尼斯·卢巴特,‡ 克里斯汀·M·菲尔德,§ 扬尼克·勒·马尔坎德·伯斯特尔（Yannick Le Marchand-Brustel）,*和米雷尔·科尔蒙特*
安妮·雷德利，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

细胞分裂需要膜转运与肌动蛋白重塑相结合，并涉及许多转运分子。CD2-associated protein（CD2AP）与动态肌动蛋白重塑和膜转运有关，肌动蛋白重构和膜转运发生在导致降解途径的内吞过程中。在这项研究中，我们对其在胞质分裂中的意义提出了几个论点。首先，内源性CD2AP在后期集中在中区微管的狭窄区域，在晚期集中在中体。此外，我们发现CD2AP是一种膜，而不是微管相关蛋白。其次，CD2AP的前两个Src同源3结构域的过度表达导致了细胞多核化率的显著增加，这两个结构域负责这种定位。第三，CD2AP小干扰RNA干扰细胞分离，表明CD2AP是HeLa细胞胞质分裂所必需的。第四，使用酵母双杂交系统，我们发现CD2AP与苯胺相互作用，苯胺是一种特殊的裂解沟成分，这两种蛋白共同定位于中体。CD2AP和苯胺在有丝分裂早期都被磷酸化，CD2AP磷酸化还与其从细胞膜到胞浆的离域作用相耦合。所有这些观察结果使我们提出CD2AP是胞质分裂中的一个新的参与者。

简介

细胞分裂是有丝分裂后导致子细胞分离的基本细胞过程。这种机制涉及微管和肌动蛋白重塑，它们在一定程度上受磷酸化、降解和膜融合事件控制(罗宾逊和斯普迪奇，2000;《直线与田野》，2000年;Glotzer，2001年). 在这个过程中，分裂细胞形成质膜内陷或分裂沟，这是由质膜下聚集的基于肌动球蛋白的收缩环形成的。在胞质分裂后期，一个狭窄的细胞质桥（定义为中体）连接两个子细胞。这个桥最终被解决，两个细胞分离，从而完成胞质分裂。

沟壑进入伴随着膜泡与进入的质膜的融合(O'Halloran，2000年;Finger and White，2002年). 在分裂位点发现了一些膜转运蛋白。细胞分裂和神经元胞吐都需要Septin(贝特斯等., 1999;菲尔德和凯洛格，1999年). 不同物种的胞质分裂和/或细胞化也需要内化和内吞所需的几种蛋白质，如联蛋白（t-SNARE）、动力蛋白、氯氰菊酯、氯氰化菊酯适配器AP-2和一些Rab蛋白、海胆中的Rab3、Rab11和Rab11效应器Nuf果蝇属(O'Halloran，2000年;Finger and White，2002年;斯特里克兰和伯吉斯，2004年). 此外，膜融合事件似乎可能与肌动蛋白重塑有关(伯吉斯等., 1997;Niswonger和O'Halloran，1997年,Emoto和Umeda，2000年). 的确，在电影化方面果蝇属syntaxin1是一种细胞化所必需的蛋白质，其胚胎突变体缺乏膜变化，同时与沟道相关的组织化肌动蛋白细胞骨架也完全缺失(伯吉斯等., 1997). 此外，粘液菌缺乏网格蛋白的突变体无法构建强大的收缩环(Niswonger和O'Halloran，1997年).

CD2AP，用于CD2-相关蛋白(达斯汀等., 1998)在细胞内降解途径和肌动蛋白重塑中发挥作用。在T细胞的免疫突触中，发现其与CD2受体的相互作用与细胞骨架重组有关(达斯汀等., 1998). CD2AP与肌动蛋白的相互作用(莱赫托宁等., 2002)和几种肌动蛋白结合蛋白(哈钦斯等., 2003;林奇等., 2003)增强CD2AP在动态肌动蛋白重塑过程中的作用。它与肌动蛋白核化Arp2/3复合物和皮质素的共定位也支持这一点(韦尔奇等., 2001)在富含肌动蛋白的动态结构中（lamellipodia和彗星尾巴的前缘）。CD2AP在降解过程中的作用已在内吞途径的不同阶段显示出来。CD2AP与内源性白细胞介素的相互作用以及与AP-2的潜在相互作用被认为与表皮生长因子（EGF）受体的内化有关(布雷特等2002年;林奇等., 2003). 最近，我们发现CD2AP与Rab4和c-Cbl的相互作用与早期和晚期内体之间血小板衍生生长因子受体的转运有关(科尔蒙等., 2003). 根据这一观察，Lee等. (2003)已经表明从CD2AP中分离的T细胞-/-小鼠未能下调T细胞受体，尽管其内化没有受到影响(李等., 2003). 最后，对CD2AP单倍体小鼠足细胞的电镜分析显示，多泡体的形成存在缺陷(基姆等., 2003). CD2AP与两种肌动蛋白结合蛋白CAPZ和皮质素的相互作用参与了激活的T细胞受体和EGF受体的下调，表明受体内吞和肌动蛋白聚合之间存在联系(哈钦斯等., 2003;林奇等., 2003). 因此，与胞质分裂类似，内吞作用中的膜交通事件似乎与肌动蛋白动态重塑密切相关。

由于胞质分裂需要膜转运和肌动蛋白重塑，并且CD2AP参与了这两个过程，我们想知道CD2AP是否也在胞质分裂中发挥作用。为了解决这个问题，我们寻找了CD2AP在HeLa细胞分裂中的分布、调节其表达的效果、与胞质分裂相关的潜在CD2AP相互作用分子的测定以及细胞周期中CD2AP的行为。

材料和方法

抗体

抗CD2AP（H-290）、单克隆抗Myc（9E10）和抗Rho GDI（A20）的多克隆抗体从圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）获得。抗CD2AP识别过度表达的CD2AP，但不识别其同源CIN85（补充图1）。抗苯胺的多克隆抗体已在前面描述过(Oegema公司等., 2000). 抗β-微管蛋白-Cy3结合物（TUB 2.1）单克隆抗体（mAb）来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。抗链球菌单克隆抗体（克隆H11-4）和抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体来自罗氏诊断公司（德国曼海姆）。荧光素异硫氰酸盐（FITC）、Cy5和德克萨斯红结合以及辣根过氧化物酶结合二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories（宾夕法尼亚州West Grove）。德克萨斯州红结合性阴茎倍体蛋白来自分子探针（尤金，俄勒冈州）。抗α-微管蛋白单克隆抗体（克隆DM1A）和抗FLAG单抗（克隆M2）来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。从Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY）获得多克隆抗Polo样激酶1（Plk1）抗体（06-813）。抗人转铁蛋白受体单克隆抗体（H68,4）来自Zymed实验室（加利福尼亚州南旧金山）。抗人血凝素（HA）单克隆抗体是从加利福尼亚州伯克利市Covance获得的。

cDNA构建

CD2AP和苯胺全长cDNA(Oegema公司等., 2000;科尔蒙等2003年)亚克隆到酵母双杂交pLexA和pACT2载体中（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）。用PCR扩增了编码CD2AP和苯胺N末端截断形式的cDNA序列，并用编码pACT2 Gal4-DNA结合域的序列在框架中亚克隆。通过使用定点突变（QuickChange试剂盒，Stratagene，La Jolla，CA），在pACT2-苯胺或pACT2-CD2AP的所需位置引入终止密码子，获得了CD2AP和苯胺的各种C末端截断形式。通过PCR扩增全长CD2AP cDNA以及编码各种截断CD2AP形式的序列，并将其亚克隆到pEGFP-C1（BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA）中，与GFP的序列编码框或pCDNA3myc中。pEGFP-CD2AP-1-175是通过定点突变在175位引入氨基酸的终止密码子获得的。使用类似的方法将GST融合CD2AP构建体制成pGEX-2T载体（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。

细胞转染

HeLa细胞在含有谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长，并在5%CO中添加10%胎牛血清237°C时。对于cDNA转染，HeLa细胞瞬时转染Fu-GENE 6（罗氏诊断），如制造商所示。对于延时实验，细胞通过电穿孔转染。简言之，6–8×106将HeLa细胞重新悬浮在含有10μg DNA和40 mM NaCl的250μl DMEM中，置于0.4-cm间隙试管中，并使用EasyJet电穿孔系统（英国阿什福德Equibio）电穿孔（1050μF，290 V）。这种转染过程导致80-90%的GFP转染细胞。对于CD2AP小干扰RNA（siRNA）转染，如制造商所示，使用在DMEM 10%胎牛血清中培养的40-50%融合的HeLa细胞用Oligofectamine（Invitrogen Cergy Pontoise，France）转染。简单地说，对于每个35-mm培养皿，将10μl 10μM CD2AP siRNA（sc-29984；Santa Cruz Biotechnology）稀释成175μl Opti-MEM I（Invitrogen SARL）并培养5分钟。同时，将4μl低聚体胺稀释到11μl Opti-MEM I中。将稀释的低聚体明和siRNA混合并在室温下培养15分钟。将培养基替换为800μl培养基，并将siRNA/寡核苷酸混合物添加到细胞中。细胞在37°C的CO中培养36小时2在延时观察之前培养箱。

单元格同步

在同步实验中，HeLa细胞与2 mM羟基脲或0.1μg/ml秋水仙素（Invitrogen SARL）孵育16–20小时，产生g1/分别是边境逮捕和中期逮捕(杜利克等., 1998;阿尔瓦雷斯等., 2001). 然后通过广泛清洗将细胞释放到细胞周期中，首先使用磷酸盐缓冲液（PBS），然后使用完全培养基。如前所述，细胞周期分析是通过使用FACScan仪器（BD Biosciences，San Jose，CA）在流式细胞术分析中使用碘化丙啶量化DNA含量来进行的(文德洛夫等., 1983).

时间间隔成像

在恒定条件下（5%CO）对细胞进行20小时的涂膜2，37°C），使用全电动Axiover 200显微镜（德国哥廷根卡尔蔡司）和冷却的数字电荷耦合器件（CCD）相机（法国埃弗里Roper Scientific），使用20倍镜头，通过相位控制光学进行观察。以1帧/2分钟的速度记录图像，并使用MetaMorph 2.0图像分析软件（宾夕法尼亚州唐宁镇的Universal Imaging）和QuickTime pro5软件（加利福尼亚州库比蒂诺的Apple Computer）进行处理。

CD2AP免疫沉淀和λ磷酸酶处理

收集HeLa细胞（同步或不同步于前中期），并将其溶解在500μl冷的20 mM Tris-HCl中，pH 7.4，含有137 mM NaCl、10 mM EDTA、1%Triton X-100、2 mM Na的裂解缓冲液中三VO（旁白）4，100 mM NaF，10 mM Na4P（P）2O（运行）7和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（完整；罗氏诊断）。将细胞裂解物蛋白（1 mg）与10μg抗CD2AP抗体孵育，该抗体先前吸附在蛋白A-Sepharose珠上。用800 Uλ磷酸酶（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）在补充有2 mM MnCl的λ磷酸酯缓冲液中在30°C下处理或不处理免疫沉淀90分钟2将免疫沉淀蛋白重新悬浮在含有3%SDS的缓冲液中，通过SDS-PAGE进行解析，转移到聚偏二氟乙烯膜（Immobilon-P；Millipore，Bedford，MA）上，并使用适当的抗体对CD2AP进行免疫检测。对于裂解液上的λ磷酸酶处理，采集前中期同步化细胞，在λ磷酸酯缓冲液中均质，并在30°C下与λ磷酸酯酶孵育30分钟。蛋白质用SDS变性，并如上所述通过SDS-PAGE进行解析。

HeLa细胞分离程序

收集同步化细胞，并在含蔗糖的冷缓冲液（3 mM咪唑，pH 7.4，250 mM蔗糖，完全）中均质。通过22号针将细胞破碎20道，并在10000×克在冷却的微型离心机中产生核后上清液。将核后上清液以100000×克4°C时（Optima X100超离心机；加利福尼亚州富勒顿市贝克曼·库尔特）。使用抗CD2AP、抗苯胺和抗α-微管蛋白抗体通过免疫印迹分析膜和细胞溶质部分。抗Rho GDI和抗转铁蛋白受体抗体分别用作分馏过程的细胞溶质和膜对照。

如前所述，在提取胞浆蛋白后获得细胞骨架级分(斯凯夫等., 2003). 简单地说，HeLa细胞在37°C下在含有80 mM PIPES、pH 6.7、1 mM EGTA、1 mM-MgCl的提取缓冲液中培养2分钟2、10%甘油、0.3%Triton X-100、5%聚乙二醇和Complete。回收含有细胞溶质蛋白的缓冲液，而在相同体积的提取缓冲液中去除附着在皮氏培养皿上的不溶物，以获得细胞骨架蛋白。两种馏分均按上述方法进行分析。

按照制造商的说明，使用微管结合蛋白自旋下降分析试剂盒（Cytosketon，Denver，CO）进行体外微管结合分析。简言之，将体外聚合微管与8μg纯化MAP2、3μg牛血清白蛋白（BSA）或100μl有丝分裂HeLa细胞的胞浆（200μg蛋白质）在室温下孵育30分钟。作为对照，蛋白质在没有微管的情况下培养。然后分离微管和可溶性蛋白，并通过考马斯蓝染色分析颗粒和可溶性部分中是否存在MAP2、微管蛋白和BSA，或通过免疫印迹分析是否存在CD2AP。

固定、免疫荧光和显微镜

为了分析内源性CD2AP，将生长在胶原（Vitrogen 100；Cohesion，Palo Alto，USA）涂层盖玻片上的HeLa细胞在-20°C下用甲醇固定5分钟，然后在Tris缓冲盐水（TBS）中清洗（TBS含有20 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）。细胞在含有0.5%Triton X-100的TBS中渗透10分钟，用0.1%Triton X-100TBS清洗，然后在含有0.1%Trito X-100、2%BSA和0.1%叠氮化钠的TBS内饱和。然后在室温下将盖玻片与稀释在饱和缓冲液中的一级抗体培养1 h，即1μg/ml抗CD2AP抗体和1μg/ml抗组蛋白单克隆抗体。清洗后，将盖玻片与FITC-结合的抗兔抗体和德克萨斯州红结合的抗鼠IgG在室温下孵育45分钟。对于微管共染，将1μg/ml抗β-微管蛋白-Cy3结合mAb与二级抗体一起添加。为了分析GFP融合蛋白，将生长在胶原涂层盖玻片上的转染HeLa细胞在PBS中4%多聚甲醛中固定15分钟，然后用10 mM NH中和4随后用PBS清洗细胞三次，用含有0.1%Triton X-100和0.5%BSA的PBS封闭并渗透15分钟。盖玻片在含有1μg/ml抗组蛋白抗体和1μg/ml抗苯胺抗体的封闭缓冲液中培养1小时。清洗后，在室温下与Cy5或德克萨斯州Red-conjugated二级抗体孵育45分钟。对于微管结合，将1μg/ml抗β-微管蛋白Cy3-结合单克隆抗体与二级抗体一起孵育。最后在Mowiol 4-88（德国达姆施塔特Calbiochem）的玻璃载玻片上安装了盖玻片。使用MetaMorph图像分析软件（Universal imaging）在配备Plan-Neofluar 100×1.3数字孔径油浸透镜和冷却数字CCD CoolSnap HQ相机（Roper Scientific）的Axiover 200显微镜（卡尔蔡司）上进行标准细胞成像。为了进行共定位分析，使用PL APO 63×1.40油物镜（TCS SP；Leica Microsystems，Deerfield，IL）用扫描共聚焦荧光显微镜检查细胞。使用Photoshop软件（Adobe Systems，Mountain View，CA）合并图像。

酵母双杂交筛选及相互作用测定

酵母双杂交筛选如前所述（Cormont等.,2001,2003). 简言之，酵母报告菌株L40首先通过使用基于乙酸锂的方法用pLex-CD2AP转化，并在缺乏色氨酸的合成培养基中生长，然后用在pVP16质粒中制备的小鼠cDNA文库进行第二次转化。细胞被镀在缺乏亮氨酸、色氨酸和组氨酸的合成培养基上。对生长菌落进行β-半乳糖苷酶活性测试。阳性克隆的文库质粒被拯救到大肠杆菌HB101细胞接种在无白细胞培养基上，通过L40酵母转化试验和DNA测序进行分析。

为了进行相互作用测量，在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基上选择共转化的L40酵母。报告基因的诱导LacZ公司这表明蛋白质-蛋白质相互作用是通过使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β在复制过滤器上测定的-d日-半乳糖苷（X-Gal）作为底物(科尔蒙等., 2001).

体外结合试验

谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合CD2AP-1-175在E类.大肠杆菌并如前所述进行纯化(博尔托卢齐等., 1996). 将10微克GST融合蛋白固定在谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上，并与45微升在体外转录和翻译的苯胺（1–300）孵育[35S] 蛋氨酸，使用TnT偶联转录翻译试剂盒（Promega，Madison，WI）和pcDNA3-myc-anillin（1-300）作为模板。在4°C的20 mM HEPES缓冲液（pH 7.8，含有50 mM NaCl和1 mM二硫苏糖醇）中培养2小时后，用pH 7.8和50 mM氯化钠的20 mM-HEPES缓冲剂清洗珠子两次，用含有250 mM氯化纳的20 mM/HEPES缓冲剂清洗两次。使用3%SDS洗脱仍与珠相关的蛋白质，然后通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

结果

CD2AP在细胞分裂过程中的定位

为了研究CD2AP在胞质分裂中的潜在作用，我们首先观察了其在细胞分裂期间的细胞内定位(图1). 固定HeLa细胞，并对内源性CD2AP和染色体进行联合免疫标记(图1，a–i，）或微管(图1，j–o). 中期，抗CD2AP抗体在整个细胞内呈弥散标记(图1，a–c). 在后期和末期，CD2AP集中在中区微管附近(图1，d–i). 此外，CD2AP在晚期末期集中在中心体中部(图1，j–l)，许多间期细胞含有一个明亮的CD2AP点，可能与中体残余物相对应(图1，m–o). 与内源性蛋白类似，GFP-CD2AP全长蛋白在后期定位于中区微管附近，在末期集中于中体中部。同样地，许多间期细胞被发现含有一个明亮的GFP-CD2AP点，可能与中体残余物相对应(图2A).

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CD2AP在细胞分裂过程中的定位。在随机生长的HeLa细胞中，沿着有丝分裂过程研究内源性CD2AP定位。电池用甲醇固定，如材料和方法与抗CD2AP和抗组蛋白抗体孵育以检测染色体（a–i），或与Cy3偶联的抗β-微管蛋白抗体以检测微管（j–o）。使用抗兔FITC-结合抗体（a、d、g、j和m）显示CD2AP标记。组蛋白标记采用抗小鼠德克萨斯红结合抗体（b、e和h）。使用Adobe Photoshop软件（覆盖c、f、i、l和o）合并每个有丝分裂图的绿色和红色图像。棒材，10μm。

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细胞分裂期间GFP-CD2AP结构的定位。（A） 用GFP-CD2AP构建物转染HeLa细胞，用多聚甲醛固定，并用抗组蛋白抗体或微管与Cy3（红色）偶联的抗β-微管抗体对染色体进行共染色。（B） 如图所示，用GFP构建物转染HeLa细胞，并使用与Cy3（红色）偶联的抗β-微管蛋白抗体对微管进行共染色。使用Adobe Photoshop软件合并图像。显示了中身区域的放大（缩放/覆盖）。棒材，10μm。

CD2AP的前两个Src同源（SH）3结构域是其定位到中体所必需的

因为CD2AP是一种多域衔接蛋白，我们想确定在细胞分裂期间其中体定位所需的CD2AP域。在与GFP融合的过程中生成了几个CD2AP构建物，并转染到HeLa细胞中。我们首先观察了蛋白质的过度表达水平，考虑到细胞的50%转染水平，该水平似乎低于内源性蛋白质水平的两到三倍（补充图2A）。此外，未产生较小的蛋白质片段（补充图2B）。如所示图2BGFP-CD2AP-（1-175）是一种与蛋白质的前两个SH3结构域相对应的结构体，它集中在中体的中部，如与微管的交叉标记所示。相反，GFP-CD2AP-（194-639），对应于相反的结构，分布在整个细胞中，在中体没有特定浓度。本实验表明CD2AP的前两个SH3结构域负责其靶向中体中部。

CD2AP或其前两个SH3结构域的过度表达对细胞分裂的影响

CD2AP在HeLa细胞中体的定位提示CD2AP可能在细胞分裂过程中发挥作用。为了检验这种可能性，我们寻找过表达CD2AP或其缺失突变体对胞质分裂的影响。HeLa细胞转染GFP-CD2AP、GFP-CD2AP-（1-175）、GFP-CD2AP-（194-639）或单独转染GFP（作为对照）。转染后48小时固定细胞，标记染色体，并对多核转染细胞进行计数。如所示图3与对照组相比，全长蛋白或GFP-CD2AP-（1-175）的过度表达导致多核率增加。当考虑到转染细胞的总数量时，这种影响是适度的，尽管是显著的(图3B). 为了证实这一观察结果，我们通过检查细胞的荧光强度，确定了多核细胞的比例作为蛋白质表达水平的函数(图3C). 随着GFP CD2AP或1-175突变蛋白的高表达水平，观察到更多的多核事件。相比之下，作为对照的交叉蛋白SH3结构域的表达并没有导致多核化率的增加，这种结构也没有局限于中体（我们的未发表的观察结果）。此外，在晚期，GFP-CD2AP和GFP-CD2AP-（1-175）的过度表达可使许多细胞计数(图3B)使用典型的微管蛋白标记确定。这些结果进一步证实了我们的假设，即CD2AP在胞质分裂中起作用，并表明CD2AP可能参与了最新的步骤，即分裂。为了测试这一提议，通过延时视频显微镜分析过表达CD2AP突变体1-175的细胞（补充影片1）。与对照细胞相比，我们观察到导致双核突变细胞的细胞动力学失败次数增加：在20小时的薄膜中，GFP-1-175转染细胞分裂失败的比例为10%，而GFP转染细胞为2.5%。

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CD2AP过度表达影响胞质分裂。如图所示，转染HeLa细胞以过度表达GFP蛋白。转染48小时后，固定细胞并标记染色体以计数每个细胞的细胞核数，或标记微管以计数中体。（A） 转染GFP、GFP-CD2AP和GFP-CD2AP-（1-175）的细胞的代表性区域共染细胞核（红色）。箭头指向多核细胞。实验重复三次，每种情况下至少分析100个转染细胞。（B） 多核细胞（□）或由中心体连接的细胞数量增加数倍(▪), 在转染细胞中，与GFP条件表达为1相比。结果显示为三到五个不同实验的平均值±SEM。（C） 多核化率与GFP蛋白表达水平的关系。使用恒定曝光参数的冷却数码相机拍摄转染GFP和GFP融合蛋白的HeLa细胞图像。GFP蛋白的表达水平通过量化细胞间位移的恒定平方像素来估计。这使我们可以将转染细胞分为三组：表达低水平GFP蛋白的组（<1）、表达高水平GFP蛋白质的组（>10）和中间组。分析各组细胞中是否存在一个或多个细胞核。该图表示两个独立实验的平均值，结果表示为转染细胞中多核细胞的百分比。

siRNA敲除CD2AP导致细胞分裂晚期缺陷

为了深入了解CD2AP在胞质分裂中的作用，siRNA转染降低了内源性蛋白的表达(图4A). 36小时后观察细胞(图4B和补充电影2）或72小时（补充图3和电影3）后通过延时视频显微镜转染20小时。虽然大量细胞明显出现正常分裂，但仔细检查表明，在某些情况下，两个子细胞没有完全分离。电影（补充电影2和3）可以遵循完整的流程，以及图4（和补充图3）显示了框架的选择。如上所述，有丝分裂似乎正常进行（0-5小时），因为在6小时00分，两个子细胞似乎完全分离。然而，在稍后时间点获得的图像清楚地表明情况并非如此。事实上，在第6小时54分时可以看到一个小的共同胞质区，并迅速扩大，导致在第7小时10分时出现一个双核细胞。对siRNA处理细胞的定量分析证实了这一观察结果(图5). 用CD2AP siRNA对HeLa细胞进行三维处理，与不相关的siRNA处理相比，多核细胞的百分比显著增加（10.7±0.7 vs.1.8±0.5）(图5，A和B)中体期细胞百分比（14.4±1.0 vs.2.1±0.8）(图5B).

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HeLa细胞中被siRNA击倒的CD2AP导致晚期胞质分裂缺陷。如图所示，使用低聚体胺将CD2AP siRNA转染HeLa细胞材料和方法（A）通过Western blot检测CD2AP在转染CD2AP siRNA（+）或仅转染寡聚体胺（-）后60 h制备的细胞提取物中的表达。当用不相关的siRNA、单独的Oligofectamine处理细胞或保持未处理时，我们观察到CD2AP的表达没有变化（我们未发表的观察结果）。转染36小时后，CD2AP表达也出现了类似的下降（我们未发表的观察结果）。（B） 转染后36小时，将细胞置于延时相差显微术中20小时。从视频2中选择20个不同的时间点，用siRNA CD2AP转染HeLa细胞的图像可见。

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定量分析siRNA对HeLa细胞CD2AP敲除的影响。HeLa细胞每3天用siRNA（针对CD2AP或非相关siRNA）转染一次，方法是使用寡效胺，如图例所述图4和中材料和方法多核细胞和体中部细胞的百分比按图3（A）相位对比显微镜下对照细胞（单独用低聚体胺处理）和siRNA处理细胞的代表区域。（B） siRNA处理后第3天（3次实验的平均值±SEM）或第6天（2次测定的平均值？范围）的双核细胞或中期细胞的百分比。在独立实验的每种条件下分析200至350个细胞。

苯胺作为CD2AP相互作用蛋白的鉴定

CD2AP作为一种多域衔接蛋白的结构促使我们寻找潜在的相互作用蛋白，这些蛋白可能参与其在胞质分裂中的功能。我们使用全长CD2AP作为诱饵进行了酵母双杂交筛选。用编码CD2AP的质粒转化L40酵母，与LexA的DNA结合域融合，该结合域与HIS3型和LacZ公司报告基因。用与VP16转录激活域融合的酵母双杂交小鼠文库转化建立的菌株。筛选后分离出三个克隆，它们与CD2AP强烈相互作用，但与层粘连蛋白没有相互作用，并且编码肌动蛋白结合蛋白苯胺的前110个氨基酸序列。有趣的是，苯胺最初在黑腹果蝇(菲尔德和阿尔伯茨，1995年)，是胞质分裂所需的进化保守蛋白(菲尔德和阿尔伯茨，1995年;Oegema公司等., 2000;索玛等., 2002;柏林等., 2003;塔斯托等., 2003). 随后将苯胺和CD2AP的cDNA亚克隆到两个杂交载体pLexA和pAct2中，以确保全长蛋白能够相互作用。图6A显示CD2AP与苯胺相互作用，与所使用的载体无关。拉明被用作阴性对照。使用各种结构，我们进一步确定CD2AP的前两个SH3结构域对CD2AP与苯胺的相互作用至关重要(图6A).

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CD2AP与苯胺相互作用，并在晚期与苯胺部分共定位。（A） 利用酵母双杂交系统确定了CD2AP和苯胺的相互作用区域。L40报告酵母细胞与pLex-anillin和指示的pAct2-CD2AP结构域构建体或与pLex-CD2AP和指示的pAct2-anillin结构域构建体共转化。在没有亮氨酸和色氨酸的情况下培养酵母细胞，并使用X-Gal作为底物在复制过滤器上测定β-半乳糖苷酶活性，45分钟内出现蓝色；-，8小时内未出现着色。所有结构的表达均通过免疫检测进行了验证（我们的未公开数据）。（B） CD2AP的前两个SH3结构域在体外与苯胺1-300片段相互作用。结合到谷胱甘肽-硫粒的GST或GST-CD2AP-（1-175）与[35S] 蛋氨酸标记在体外翻译的苯胺1-300中。结合蛋白洗脱，SDS-PAGE分析，并进行放射自显影。（C） 晚期同步表达或不表达Myc-CD2AP的HeLa细胞，制备裂解物，并使用抗Myc抗体免疫沉淀Myc-CD2AP。通过免疫印迹法在免疫沉淀物（IP-myc）中检测苯胺和CD2AP的存在。（D） GFP-CD2AP转染细胞（a、e和i）通过使用抗苯胺抗体，然后使用德克萨斯州红偶联抗兔抗体，对苯胺（b、f和j）进行共标记，并使用抗组蛋白抗体和Cy5偶联抗鼠抗体（c、g和k）进行染色体检测。使用Adobe Photoshop软件（d、h和l）合并绿色、蓝色和红色图像。每张图片代表八个连续共焦部分的投影。棒材，10μm。

为了确定哪些苯胺结构域参与了与CD2AP的相互作用，对几个pAct–苯胺结构体进行了结合CD2AP能力的测试。我们发现含有脯氨酸富集区的苯胺N末端片段（1-155）需要与CD2AP相互作用。PX（P/A）XXR共识位点最近被确定为CD2AP或CIN85（用于85 kDa的c-Cbl相互作用蛋白）的SH3结构域的靶点，这是一种密切相关的CD2AP蛋白(库拉金等., 2003). 对苯胺序列的仔细检查使我们提出其26-PTAAPR-31序列可能是这种相互作用的候选序列。因此，将精氨酸-31替换为丙氨酸（苯胺-R31A）足以消除酵母双杂交系统中苯胺和CD2AP之间的相互作用(图6A). 使用包含CD2AP（GST-1-175）的前两个SH3结构域的GST融合的下拉实验，我们观察到与放射性标记的体外翻译苯胺（1-300）的相互作用，符合酵母双杂交结果(图6B).

然后我们观察CD2AP和苯胺的相互作用是否会在分裂细胞中发生。因此，我们研究了CD2AP和苯胺在有丝分裂期间的共定位程度。转染GFP-CD2AP cDNA的HeLa细胞标记内源性苯胺(图6D，红色）和染色体(图6D，蓝色）。在后期，苯胺集中在细胞皮层的收缩环中(图6D，b)而CD2AP定位于中区附近(图6D，a). 在晚期末期，CD2AP被苯胺环包围，两种蛋白质在环的边缘共定位(图6D，e–h). 这一结果表明，这两种蛋白在胞质分裂的最后一步可以相互作用。为了证实这一假设，我们利用细胞在末期同步的共免疫沉淀实验检测到这两种蛋白之间的相互作用(图6C). 胞质分裂后，中体苯胺环消失，出现一些苯胺标记，类似于串上的珠子（6D，i–l）。

CD2AP和苯胺在有丝分裂过程中磷酸化

由于CD2AP似乎与胞质分裂有关，我们研究了该蛋白在整个细胞周期中相对于苯胺的表达(图7A). HeLa细胞在G1/分别使用羟基脲和秋水仙素处理S边界和前中期，并在广泛洗脱后在细胞周期中释放(杜利克等., 1998;阿尔瓦雷斯等., 2001). 羟基脲释放后，细胞在G1（H0），G1/S转变（释放6小时，H6）和S/G2过渡期（释放10小时，H10），由流式细胞术分析控制（补充图4）。通过使用抗β-微管蛋白检测有丝分裂纺锤体和中体的荧光显微镜（我们未发表的数据）证实，它们主要出现在秋水仙素释放1小时后的中期（通道C1）和3-4小时后的晚期（C3-C4）。释放6小时后（C6），细胞开始返回G1相位由流式细胞术分析控制（补充图4）。如前所述，同步化过程通过Plk1表达进行验证，Plkl表达在有丝分裂期间显著增加(戈尔斯廷等., 1994). 虽然CD2AP的整体表达水平在整个周期中没有改变(图7A)苯胺的表达受细胞周期调控。苯胺在G中含量低0/G公司1期，其表达随着细胞进入S期而增加，然后当细胞再次进入G期时逐渐减少1相位(图7A，C6–C8车道）。苯胺的表达谱与所提出的模型一致(菲尔德和阿尔伯茨，1995年)这描述了依赖细胞周期的苯胺的表达和定位。事实上，苯胺的表达随着细胞核年龄的增长而增加。细胞分裂后（早期G1)当细胞接近有丝分裂时增加（S/G2).

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CD2AP在有丝分裂中磷酸化。（A） 使用colcemid（C0-C8）或羟基脲（H0-H10）处理16–20小时，将HeLa细胞阻滞，然后用新鲜的无药物培养基在指定的时间内释放到细胞周期中。例如：H6=羟基脲释放后6小时。细胞提取物（20μg）用CD2AP和苯胺抗体进行免疫印迹分析。对照细胞用秋水仙素处理1小时。未经处理的细胞是随机生长的细胞。Plk1用作同步对照，α-微管蛋白用作负荷对照。（B） 用0.1μg/ml colcemid将HeLa细胞阻滞在前中期，洗涤，并在无药物培养基中孵育，使其退出有丝分裂。样品在去除水杨酸后3小时内收集并在洗涤剂中溶解。CD2AP被免疫沉淀，并在有或无λ磷酸酶的情况下培养，如材料和方法，免疫检测前。（C） 前中期阻断的HeLa细胞被裂解并与λ磷酸酶孵育，如材料和方法.

此外，在前中期（C0），CD2AP和苯胺以不同的物种迁移。当细胞进入末期时，这些补充带消失。这两种蛋白的电泳位移都是细胞周期依赖性的，而不是由微管解聚引起的。事实上，当细胞用秋水仙素处理1小时（持续时间足以观察微管的改变）时，两种蛋白质的流动性都没有变化(图7A，控制车道）。为了确定CD2AP和苯胺的迁移是否是由于磷酸化引起的，用丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸λ磷酸酶处理有丝分裂细胞的CD2AP免疫沉淀或裂解物。λ磷酸酶处理后，这两种蛋白的迁移率变化受到抑制(图7、B和C)由此得出结论，CD2AP和苯胺在早期有丝分裂中特异性磷酸化。

我们进一步检测了CD2AP和苯胺在细胞周期中的亚细胞分布。如上所述，HeLa细胞同步化并均质。如实验程序所述，从细胞液中分离膜组分。在未经处理或S相同步化细胞（H0）中，CD2AP主要与细胞膜相关(图8A而在前中期同步化细胞（lane C0）中，CD2AP在胞浆部分富集。到有丝分裂结束时，CD2AP逐渐与膜部分（C1、C3和C6）重新关联。此外，存在于有丝分裂细胞胞浆部分（C0、C1和C3）中的CD2AP以较高的表观分子量迁移，表明磷酸化形式的CD2AP主要游离于胞浆。此外，在整个细胞周期中，苯胺主要与细胞膜相关。Rho-GDI和转铁蛋白受体分别用作细胞溶质和膜控制，用于分馏过程，在细胞周期中没有改变(图8A). 在细胞溶质部分中发现了微管蛋白，这可能是因为分馏过程是在4°C的温度下进行的，已知该温度会诱导微管解聚。

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CD2AP和苯胺沿细胞周期的亚细胞分布。（A） 使用羟基脲（H0）和秋水仙素（C0–C6）处理在细胞周期的不同点同步细胞，并将其释放到细胞周期中。用核后上清液制备的膜（Mb）和细胞溶质（Cyt）组分的免疫印迹法监测苯胺和CD2AP的亚细胞分布。未经处理的细胞是随机生长的细胞。Rho GDI用作细胞溶质控制，转铁蛋白受体（TfR）用作分馏过程的膜控制。同时对微管蛋白进行免疫检测。（B） CD2AP在间期与微管无关。用或不用秋水仙素处理细胞1小时，并按材料和方法免疫检测50微克总裂解物（T）、可溶性和不溶性蛋白质中是否存在CD2AP和微管蛋白。（C） 体外有丝分裂同步化HeLa细胞的胞浆CD2AP与微管无关。将体外聚合微管（MT）与8μg纯化MAP2、3μg BSA或100μl胞浆（200μg）在室温下孵育30分钟。作为对照，蛋白质在没有微管（-）的情况下孵育。然后通过缓冲液离心分离微管和可溶性蛋白质。考马斯蓝染色法检测颗粒（P）和可溶性组分（S）中MAP2、微管蛋白和BSA的存在，而免疫印迹法分析CD2AP的存在。

由于CD2AP被发现富集为中心纺锤体中区，我们想知道CD2AP是否与微管相关。为此，如前所述，在37°C下从不溶性物质中分离细胞溶胶(斯凯夫等., 2003) (图8B). CD2AP主要存在于对照条件下的不溶部分，而α-微管蛋白则存在于不溶部分（聚合微管）和可溶性部分（未聚合微管蛋白）中。当细胞用秋水仙素处理1小时（持续时间足以诱导微管解聚）时，CD2AP留在不溶性部分，而α-微管蛋白则转移到可溶性部分，这表明CD2AP在相间细胞中不与微管结合。最后，我们寻找胞浆磷酸化CD2AP与微管的可能相互作用。为此，利用有丝分裂细胞的胞浆作为磷酸化CD2AP的来源，进行微管结合试验(图8C). MAP2被用作对照，与微管结合，但CD2AP没有。

讨论

在本报告中，我们提出了几个线索，证明CD2AP与HeLa细胞的胞质分裂有关。CD2AP定位于中区微管中部和中体，CD2AP或其前两个SH3结构域过度表达细胞中多核率显著增加，CD2AP-siRNA诱导的晚期胞质分裂缺陷，有丝分裂CD2AP磷酸化及其与苯胺的相互作用，一个特定的解理沟元素都支持这一含义。

CD2AP在中区微管中的定位暗示其在细胞分裂中的潜在作用

我们发现CD2AP被招募到中区的狭窄区域。在这个区域通常只发现细胞分裂所需的有限数量的蛋白质。其中包括一些驱动蛋白亚型、染色体乘客分子（如内着丝粒分子INCENP和末期盘抗原TD-60）、Plk和Aurora家族的有丝分裂激酶，以及Rho/Rac GTPases ECT2和MgcRacGAP的调节器(《直线与田野》，2000年; 格洛泽，2001,2003). 与这些分子不同，我们从未观察到CD2AP在中期和后期早期与着丝粒、动粒或有丝分裂纺锤体相关，这表明CD2AP可能在胞质分裂后期发挥作用。CD2AP在中区微管中的定位意味着它通过其前两个SH3结构域与这种特殊的微管结构相互作用。然而，CD2AP在体外并没有直接与微管结合，也没有与相间细胞中的微管共定位，也没有在有丝分裂细胞中与微管纺锤体共定位。这些观察结果表明，CD2AP在中区微管附近的定位需要特定的微管结合蛋白。另一种可能是CD2AP与围绕中心纺锤体的膜有关。一个有吸引力的想法是，这种膜可能对应于进入卵裂沟的前缘，因为CD2AP定位于迁移细胞的前缘(基尔希等., 1999;韦尔奇等2001年;莱赫托宁等., 2002).

CD2AP有丝分裂磷酸化在细胞分裂中的潜在作用

CD2AP的有丝分裂磷酸化支持CD2AP在细胞分裂过程中的作用。有丝分裂需要一系列复杂的事件，这些事件受到磷酸化/去磷酸化的高度调节(Straight和Field，2000年; 格洛泽，2001,2003). 此外，有丝分裂激酶对胞质分裂至关重要(卡梅纳和恩肖，2003年;戴等., 2003;Ohkura，2003年). 至少可以设想有丝分裂CD2AP磷酸化的两种作用。首先，在内吞作用中抑制CD2AP功能可能很重要。如Rab4所述，CD2AP的磷酸化与其从膜到胞浆的离域相关(贝利等., 1991;范德斯鲁伊斯等., 1992). 这将导致在有丝分裂的第一步有效地灭活由Rab4和CD2AP控制的贩运途径。其次，CD2AP磷酸化可以激活CD2AP蛋白的特定有丝分裂功能。例如，Rho-GEF ECT2的有丝分裂磷酸化是其交换活性所必需的(辰基等., 1999). Aurora B对MgcRac-GAP的磷酸化将其RacGAP活性转化为RhoGAP活性(广岛等., 2003). Rab6KIFL是Rabkinesin 6的人类同源物，在相间细胞中沿高尔基体逆行交通中发挥作用。类似地，在有丝分裂期间，激酶Plk1对其磷酸化是Plkl在中区正确定位所必需的(尼夫等., 2003).

CD2AP似乎在细胞分裂后期起作用

CD2AP表达沉默诱导的表型有利于该蛋白在胞质分裂后期发挥作用，因为我们观察到子细胞的分裂明显受阻。这个断裂步骤需要在分裂的子细胞之间形成稳定的细胞间桥，收缩环的解体，膜重塑事件和中体脱落(Schweitzer和D’Souza-Schorey，2004年). 由于CD2AP似乎参与了间期细胞中肌动蛋白和膜的运输，因此很难准确确定CD2AP在胞质分裂中的确切功能。CD2AP在酵母双杂交系统中与苯胺相互作用，这两种蛋白在完整细胞中部分共定位。此外，这两种蛋白质在体外和细胞内表现出相互作用。苯胺是一种与胞质分裂有关的特定沟成分，而其他卵裂沟成分，如隔膜蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白，则定位在其他地方并参与其他过程(菲尔德和阿尔伯茨，1995年;Oegema公司等., 2000). 苯胺与CD2AP相互作用所需的PX（P/A）XXR基序在哺乳动物之间是保守的，非洲爪蟾，以及D.黑腹果蝇加强了这种互动的重要作用。与CD2AP一样，苯胺在有丝分裂中被磷酸化，两者的去磷酸化遵循相似的时间过程。苯胺磷酸化的确切作用及其与CD2AP结合的潜在意义尚不清楚。考虑到它们已知的分子性质，可以提出它们相互作用的至少三种假定作用。首先，CD2AP和苯胺之间的相互作用可能在胞质分裂所必需的肌动蛋白重塑中发挥作用。在体外，苯胺结合并捆绑丝状肌动蛋白，并将七肽蛋白招募到肌动蛋白束中(菲尔德和阿尔伯茨，1995年;Oegema公司等., 2000;木下等2002年)而CD2AP参与了几个细胞过程中肌动蛋白的重组(达斯汀等., 1998;谢弗等., 2000;韦尔奇等., 2001;莱赫托宁等., 2002;哈钦斯等., 2003;林奇等., 2003). 因此，CD2AP和苯胺在末期的相互作用可以将控制中体肌动蛋白动力学所需的所有多蛋白复合物聚集在一起。其次，这种相互作用可能参与细胞分裂所需的膜贩运事件(O'Halloran，2000年;Finger and White，2002年). 在缺乏苯胺的S2细胞中都观察到末期的重要缺陷(索玛等., 2002)HeLa细胞中CD2AP和CD2AP过度表达（1-175）或缺乏CD2AP（本研究）。苯胺缺乏细胞在卵裂区显示出异常的膜组织，这可能是由于细胞内小泡对卵裂沟膜的缺陷膜交通事件所致(索玛等., 2002). 有趣的是，syntaxin 2和endobrevin这两种参与膜融合事件的蛋白质与断裂有关(低等., 2003)，与CD2AP一样，与相间细胞的内胚体隔室相关(Wong（王）等., 1998;醌类等., 1999;安东宁等., 2000). 此外，在芽殖酵母中，CD2AP/CIN85的同源物Sla1p将肌动蛋白动力学与内吞作用耦合(杜瓦牌汽车等., 2002;沃伦等., 2002)和缺乏Sla1p的酵母表现出细胞分裂缺陷，可能是由于向出芽部位的极化分泌物缺陷所致(唐等2000年;锂等., 2002). 因此，为了在中体水平上正确协调囊泡膜的运输和融合，可能需要苯胺和CD2AP之间的相互作用，这是一个断裂所需的过程。第三，苯胺与CD2AP的相互作用可能有助于将苯胺靶向降解途径。事实上，当细胞经历有丝分裂时，苯胺表达迅速下降。这可能是由于其被泛素介导的蛋白水解降解所致(直线等., 2003). 因为CD2AP和CIN85参与相间细胞中的蛋白质降解，并且因为它们结合泛素连接酶(迪基克，2002年)，他们可以给苯胺带来泛素化机制，允许其降解。

CD2AP基因敲除（KO）小鼠中没有发现细胞因子缺陷，尽管尚未仔细研究其表型(施等., 1999)，表明其他（s）蛋白可以补偿CD2AP的有丝分裂功能。CD2AP与CIN85属于同一家族(迪基克，2002年). 虽然CD2AP（但不是CIN85）与Rab4（未发表的数据）和肌动蛋白相互作用，但这两种蛋白质具有相似的结构域组织和结合伙伴(莱赫托宁等., 2002). CIN85在酵母双杂交系统中也与苯胺相互作用（我们未发表的数据），可以在KO小鼠中替代CD2AP。根据这一假设，CIN85和CD2AP都可以在体内外（Dikic，个人通信）中补偿它们在调节受体酪氨酸激酶内吞中的作用。此外，可以获得缺乏柠檬激酶（一种参与胞质分裂的蛋白质）的小鼠，它们只在某些特定细胞中表现出胞质分裂缺陷(迪库托等., 2000). 有必要对CD2AP KO小鼠进行仔细分析，以排除这种缺陷在某些细胞类型中没有发生。

足突与裂沟的相似性

CD2AP是一种广泛表达的蛋白，但在肾脏的足细胞中其表达上调。足细胞是具有复杂细胞组织的独特细胞。它们形成了肾小球滤过器所需的富含肌动蛋白的特殊结构，称为足突(帕文斯塔特等., 2003). CD2AP参与足突的维持，CD2AP肾脏中这些特殊结构的回归揭示了这一点-/-老鼠(施等., 1999). 有趣的是，足细胞足过程中存在一个完整的肌动蛋白收缩装置(Asanuma和Mundel，2003年). 在足细胞器和分裂细胞的收缩环器中发现了相同的蛋白质组成（肌动蛋白、肌球蛋白II和α-肌动蛋白）。此外，CHO1/MKLP1需要在足细胞中建立过程形成所必需的反平行微管网络(小林等., 1998)以及形成中间区域所需的反平行微管束，以推进和稳定闭合卵裂沟(Glotzer，2004年). 这表明，CD2AP在胞质分裂和足细胞过程形成中的分子机制可能是相似的，至少部分是相似的。

致谢

我们感谢Hollenberg博士（华盛顿州西雅图弗雷德·哈奇森癌症研究中心）赠送小鼠cDNA酵母双杂交文库，感谢K.Kirsch博士（马萨诸塞州波士顿医学院波士顿大学）赠送人类FLAG-CD2AP cDNA，感谢S.Giordano博士（意大利都灵癌症研究与治疗研究所）赠送CIN85 cDNA，以及P。麦弗逊为GFP-intersectin-SH3礼物。我们感谢P.Boquet、E.Lemichez、C.Treins、J.Vukmirica、V.Kaddai和P.Gual鼓励讨论和批判性阅读手稿，感谢A.Doye、T.Gonzalez和L.Boyer提供技术援助。这项工作得到了国家圣母院医学研究所、尼斯-索菲亚-安蒂波利斯大学、癌症康复协会（ARC拨款5634和3240）、法国肌病防治协会（拨款7989）、普罗旺斯-阿尔卑斯山-蓝色地区、，和阿尔卑斯山海岸咨询委员会。感谢贝当古-舒勒基金会的支持。P.M.先后获得了La Legue contre le Cancer、The Association pour La Recherche contre ler Cancer和Fondation Bettencourt-Schueller的奖学金。N.G.得到了法国教育部的支持。

笔记

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E04-09-0773)2005年3月30日。

D⃞V \8414]本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org).

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会