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分子生物学细胞。2005年6月；16(6): 2704–2718.
数字对象标识：10.1091/桶。E04-07-0596号
预防性维修识别码：项目经理1142418
PMID：15772153

EGFR信号传导能力和细胞内分泌学能力膜微结构域之间的关系D⃞

克劳迪娅·普里,*†‡ 丹妮拉·托索尼,†‡§ 里卡多·科迈,*† 安德烈亚·拉贝利诺,*† 丹妮拉·塞加特,* 费德里科·卡内娃,* 保拉·卢齐,*† Paolo Di Fiore码头,†§∥和卡洛·塔切蒂*†
胡安·博尼法西诺，监控编辑器
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摘要

膜微结构域，即所谓的脂筏，起着浓缩受体和组装信号转导机制的平台的作用。在大多数情况下，内化是由不同的特殊结构进行的，即涂有氯氰菊酯的凹坑。在这里，我们表明，在表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）（一种受体酪氨酸激酶）激活后，几种内吞蛋白有效地被招募到形态学上确定的质膜脂筏。对耐洗涤剂膜组分的分析表明，内吞蛋白与筏依赖EGF的结合与信号效应分子（如Grb2或Shc）的结合一样有效。最后，EGFR，而非非信号转铁蛋白受体，可以定位于几乎总是含有筏膜的新生包衣凹坑。因此，专门的膜微域能够组装EGFR效应器信号的细胞内传播和受体内化所必需的分子机制。

简介

在受体酪氨酸激酶（RTK）通过同源配体参与时，其内在激酶活性通过随后的受体自身磷酸化和信号转导机制的招募/激活而受到刺激，进而负责几个效应器功能。同时，激活的受体触发其自身的内吞作用，其最终目的是通过从细胞表面移除受体来熄灭信号(卡彭特，2000). 在表皮生长因子（EGF）受体（EGFR）的情况下，这两个过程的定位具有很好的特征(乔里森等人。，2003). 信号发生在特殊的膜微域、脂筏内(西蒙斯和图姆，2000年;麦克斯菲尔德，2002)而内吞主要发生在氯氰菊酯涂层的凹坑（CCPs；Conner和Schmid，2003年).

膜筏是富含胆固醇和鞘磷脂的膜区，其特征是比大块质膜具有更高的有序度和更低的浮力密度(西蒙斯和图姆，2000年;斯普朗等人。，2001;Kusumi公司等人。，2004). 这些结构的特征还在于它们在4°C时不溶于某些洗涤剂（DRM，耐洗涤剂膜；Brown and Rose，1992年). 据报道，几种跨膜受体与膜筏有关(程等人。，1999;克劳斯和阿尔特沃格特，1999年;米诺等人。，1999;拉马泽等人。，2001;朱里萨托等人。，2003)，包括EGFR(米诺等人。，1999). 受体与脂筏的结合被认为是激活信号级联的功能(程等人。，1999;沃等人。，1999;德雷沃特等人。，2002;Matveev和Smart，2002年;皮尔斯，2002年;斯托达特等人。，2002;德尔波佐等人。，2004). 因此，特定信号(牙龈等人。，1998;岩步町等人。，1998;米开里等人。，1999;金泽尔斯基等人。，2004)和适配器蛋白（例如，shc和grb2；比迪等人。，2003;Ridyard和Robbins，2003年;杨等人。，2004)已发现与木筏有关。然而，脂筏相当小，可能只含有少量分子(之前等人。，2003)，作为稳定的信号平台(Harder和Engelhardt，2004年). 然而，它们是动态的，可能会扩散(普拉勒等人。，2000;斯普朗等人。，2001)并结合成更大、更稳定的结构，以响应信号，形成更大的“信号传输平台”(西蒙斯和图姆，2000年;Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年). 这些较大的筏可能有助于信号放大或衰减（例如，通过蛋白激酶或磷酸酶与同源底物的协同作用；雅各布森和迪特里希，1999年;Kurzchalia和Parton，1999年a;西蒙斯和图姆，2000年;安德森和雅各布森，2002年;Miljan和Bremer，2002年).

据报道，筏相关受体遵循非网格蛋白或网格蛋白依赖的内吞途径(Nichols和Lippincott Schwartz，2001年;Johannes和Lamaze，2002年;Conner和Schmid，2003年;迪古列尔莫等人。，2003;费尔伯鲍姆·科尔蒂等人。，2003). 特别是，EGFR通过促进参与CCP组装的内吞蛋白（例如eps15、AP2和网格蛋白；斯莱普涅夫和德卡米利，2000年;布罗德斯基等人。，2001;Smythe，2002年). 虽然有证据表明这些蛋白质被吸收到了质膜上(米诺等人。，1999;派克和凯西，2002年;Yamabhai和Anderson，2002年)，信号传导和内化能力区室之间的关系还远不清楚。因此，我们努力在EGFR系统中研究这种关系(Johannes和Lamaze，2002年;林格里克等人。，2002;Sandvig和van Deurs，2002年;斯托达特等人。，2002;阿布拉米等人。，2003).

我们的结果表明，专门的膜筏能够组装EGFR效应器信号的细胞内传播和受体内化所需的分子机制，并表明EGFR内化CCPs可以在脂筏平台内组装。

材料和方法

抗体和细胞

使用的抗体有：兔抗eps15（577）、兔抗辣根过氧化物酶（HRP；Sigma，圣路易斯，密苏里州）、小鼠抗AP2（Sigma）、小鼠反TfR（Zymed，旧金山，加利福尼亚州）、鼠抗TfR抗体（胞外结构域；5E9C11克隆，ATCC，Rockville，MD）、鼠反EGFR抗体（胞外结构域；AB-5，癌基因，加利福尼亚州圣地亚哥，13A9，基因泰克，加利福尼亚州旧金山），兔抗EGFR（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司），兔抗EGFR（马萨诸塞州贝弗利细胞信号技术公司）、兔抗钙联蛋白（圣克鲁斯生技公司），兔子抗β1整合素（由F.Giancotti善意提供），小鼠抗网格蛋白HC（BD Biosciences，San Jose，CA）、兔抗鼠（DAKO，Glostrup，Denmark）、兔抗血小板活化蛋白（PLAP）（Rockland，Gilbertsville，PA）、ECL的HRP偶联二级抗体（DAKO）、兔对抗Caveolin-1（Santa Cruz Biotechnology或BD Biosciences）。ProteinA/gold来自Dr.J.W.Slot（荷兰乌得勒支乌得勒支特大学）、兔抗Grb2（圣克鲁斯生物技术）、兔抗Shc（圣克鲁兹生物技术）。次级荧光标记抗体来自杰克逊免疫研究实验室（宾夕法尼亚州西格罗夫）。

对于EGF治疗，细胞在无血清DMEM中饥饿18小时，并在有或无EGF的情况下培养（除非另有说明，否则为100 ng/ml；纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology）。如图所示，在37°C或冰上进行EGF刺激。在后一种情况下，细胞在刺激前在0°C的饥饿培养基中预冷30分钟。如有指示，细胞随后在37°C下移动不同的时间长度。对于CT-B/HRP（Sigma）标记，HeLa细胞在无血清培养基中饥饿18 h，然后在有或无EGF的情况下，在冰上与CT-B/HRP（Signa；4μg/ml）孵育1 h。

对于甲基-β-环糊精（MβCD）治疗，HeLa细胞在无血清培养基中饥饿18小时，在饥饿的最后一小时，用（或不用）10 mM MβCD（西格玛，圣路易斯，密苏里州）、0.2%牛血清白蛋白、20 mM HEPES的混合物在无血清介质中培养。用0.5%十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中溶解细胞，测定残余胆固醇。然后从培养皿上刮下细胞，用25号针头穿过注射器，剪切DNA。根据制造商的说明，使用酶比色法“Colesterolo SL”试剂盒（实时诊断系统，意大利维特博）估计细胞裂解液中的胆固醇含量。

电子显微镜

钌红/戊二醛固定根据之前描述的方案制备用于钌红/戊二醛固定的细胞(达姆克等人。，1994). 简单地说，HeLa细胞在室温下用含2%戊二醛的66 mM二羧酸缓冲液（pH 7.2）和0.5 mg/ml钌红（瑞士布赫市福禄卡）固定1小时。用pH 7.2的150 mM二羰酸缓冲液洗涤后，用含1%OsO的33 mM二甲羧酸缓冲溶液对细胞进行后固定4，和0.5mg/ml钌红，在室温下保持3小时。然后用150mM二甲酰二甲酸缓冲液洗涤细胞，并处理用于Epon包埋（Polybed 812，Polysciences，Warrington，PA）。

预埋CT-B/HRP标签如前所述，用CT-B/HRP标记HeLa细胞，用2%多聚甲醛/0.2%戊二醛固定在PBS中2O（运行）2在PBS中。用含有0.02 M甘氨酸的PBS清洗细胞，刮下培养皿，离心，并将其包埋在PBS的12%明胶中。用2.3 M蔗糖在4°C下培养小块包埋细胞过夜，将其安装在铝钉上，并在液氮中冷冻。在–107°C下切割100 nm的超薄冷冻切片，并在1.15 M蔗糖中提取1%甲基纤维素。与标准的60 nm相比，切片的厚度更大，这是保存免疫过氧化物酶反应产物所必需的。

对于双重或三重免疫过氧化物酶/免疫金标记，在PBS中与2%明胶孵育后，根据先前描述的方案对冰冻切片进行免疫金标记(孔法洛涅里等人。，2000).

Epon预埋HeLa细胞用4%多聚甲醛在PBS中固定30分钟，用0.02%甘氨酸在PBS溶液中淬火，用兔抗PLAP标记，然后用10nm的蛋白a金标记，每个步骤持续30分钟。然后将细胞固定在2.5%戊二醛中的二羧酸缓冲液中，缓冲液为0.1 M，pH值为7.2，并进行处理以嵌入Polybed 812（Polysciences）中。

形态测量学免疫金和免疫过氧化物酶标记的形态计量学分析在显微镜上以12000×的速度在至少20个随机选择的细胞剖面上进行，或根据目标在系统取样的显微照片上进行。每个实验至少重复三次。对于免疫金标记，通过定义背景信号比来测试抗体的最佳浓度(拉布耶，1999年). 此外，特异性（标记已知与给定抗原相关的隔室）和非特异性金染色（标记已知与给定抗原不相关的隔室）之间的比率，如果>5，则被认为是可接受的。

本文所示显微照片中显示的金粒子的黑暗度（但不是大小或对比度）已通过数字处理增加，以便于在使用的较低放大倍数下进行观察。

免疫荧光

HeLa细胞在无血清培养基中培养3 h，置于冰上，并用预冷无血清培养液（SFM、含有20 mM HEPES和1%牛血清白蛋白的DMEM）短暂清洗。然后用抗EGFR（13A9抗体）在SFM中培养细胞，在有或无EGF（100 ng/ml）的情况下，在0°C的摇杆上培养60分钟。然后对细胞进行清洗、固定，并用第二步荧光标记的抗鼠抗体进行染色。随后，用0.1%Triton X-100在PBS中渗透细胞，并用荧光标记抗体显示的抗AP2β亚基（Santa Cruz Biotechnology）染色。使用Leica DM IRE2 HC Fluo TCS倒置显微镜（伊利诺伊州迪尔菲尔德）进行共聚焦显微镜检查。对于EGFR/AP2共定位的量化（如所示图1C)，我们使用了ImageJ免费图像分析软件的“共定位查找器”插件（W.Rasband，贝塞斯达国立卫生研究院；http://rsb.info.nih.gov/ij/). 采集图像以显示粘附在培养皿上的整个质膜表面。为了最大限度地提高仅评估质膜（不包括所有细胞内染色）的机会，我们对从细胞边缘向细胞质延伸15像素的图像的限制区域进行了分析。减去背景噪声后，获得了同一图像的通道红和通道绿的逐像素相关图。对于AP2点计数，如上所述拍摄图像，减去背景噪声后，在细胞的整个区域上计数AP2点。使用“Wand（tracing）tool”高亮显示细胞边缘后，使用ImageJ“Analyze”命令以像素为单位测量表面。随后将面积转换为μm2基于像素大小。点的数量表示为细胞表面点的密度（点/μm2表面）。

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EGF刺激在0°C时诱导CCPs组装，但不诱导CCV萌芽。（A） EM图像HeLa细胞在钌红（RR）存在下固定。深色染色表明与外表面的连接。所示为RR-阳性氯氰菊酯包被凹坑（CP）和RR-阴性氯氰菊酯包被囊泡（CV）的示例。棒，0.06μm。（B） 对对数生长的A.HeLa细胞进行形态分析（B中为“稳态”），在37°C无血清培养基中饥饿18小时（B中“饥饿”），然后在0°C下转移30分钟，以使平板和细胞冷却。然后取下培养基，用新鲜培养基培养细胞1小时，在没有EGF（B中为“1小时0°C”）或存在EGF（C中为“1h EGF 0°C）的情况下，在冰上预冷。然后在没有EGF的情况下，在37°C下转移平行培养皿中的细胞（如上文所述，在0°C下用EGF处理）2分钟，以使预先形成的氯氰菊酯涂层凹坑内化（B中的“1 h EGF 0°C+2′37°C”）。对6组10个细胞轮廓进行形态测量。数据表示每个序列中CP或CV的平均数量，±SD。CP类别包括：（i）质膜的所有RR阳性内陷区域，显示与内表面相关的清晰形态学可识别的网格蛋白涂层；（ii）氯氰菊酯包被的囊泡状结构显示出清晰的RR染色。（C） 双重免疫荧光显示EGFR（EGFR）和AP2复合物β亚单位（AP2）在饥饿HeLa中的定位，在0°C下用EGF（+EGF）刺激1h，或在相同温度下模拟处理（–EGF）。右侧面板（合并）显示合并的图像。方框区域在合并面板底部的插图中以较高的放大率显示。棒材：（右下面板）7.6μm；（插图）3.9微米；（所有其他面板）12.5μm。（D） 双免疫荧光显示EGFR（EGFR）和网格蛋白（dsRed网格蛋白）在用RFP网格蛋白转染并用EGF（+EGF）刺激1小时的饥饿HeLa细胞中的定位，在0°C下，或在相同温度下模拟处理（-EGF）。右侧面板（合并）显示合并的图像。方框区域在合并面板底部的插图中以较高的放大率显示。棒：12.5μm（–EGF，所有面板）；12.5μm（+EGF）；3.9微米（插入）。

为了定量EGFR/氯氰菊酯共定位和CCPs的数量，HeLa细胞被dsRed-clathrin转染(拉波波特等人。，2003)使用脂质体胺试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA），在SFM中培养16小时，放在冰上，并用预冷的SFM清洗。然后用抗EGFR（13A9抗体）在SFM中孵育细胞，在有或无EGF（100 ng/ml）的情况下，在0°C的摇杆上孵育60分钟，清洗、固定并用抗小鼠荧光标记抗体染色。EGFR/网格蛋白共定位及网格蛋白点密度的定量分析2对AP2进行表面处理。对每个细胞从腹面到细胞顶部的26–30个共聚焦平面（根据奈奎斯特采样，以244-nm的步长进行轴向扫描）进行分析。

DRM的准备

对HeLa细胞进行血清饥饿处理（16–18小时），并在0°C下处理±EGF 30分钟。细胞在TNE缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM EDTA，pH 8.5，1%）中的冰上溶解，该缓冲液中含有1%Triton X-100（皮尔斯，罗克福德，IL）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（罗氏，曼海姆，德国），并使用紧密贴合的Dounce均质器（40冲程）和25号针进行均质。将裂解液培养至40%蔗糖，并在蔗糖梯度上分层（TNE中为5–35%），然后在190000×克在SW41转子中，4°C，18小时（加州富勒顿贝克曼）。从梯度顶部采集1毫升级。如有指示，用点样法分析两微升馏分2-11。在TNE缓冲液中稀释900微升每种浮动部分（2-6），并通过100000×离心浓缩克，4°C，MLA130转子中30分钟（贝克曼）。将颗粒完全重新悬浮在样品缓冲液中，并通过Western blot进行分析。将40微升每种非悬浮部分（7-11）重新悬浮在样品缓冲液中，并通过Western blot进行分析。

结果

低温刺激EGF促进CCP组装，但不促进氯氰菊酯包被囊泡的萌发

为了探索参与EGFR活性的信号传导能区和内化能区之间的关系，并且为了更好地定义EGFR激活后的早期事件，我们寻求实验条件，使CCPs的形成与其作为氯氰菊酯包被囊泡（CCV）的内化分离。

以前的几份报告表明，CCP可以在存在EGF的情况下在0°C下正常形成，但不会内部化(摩尔等人。，1987;贝克等人。，1992;Brown和Petersen，1998年;江等人。，2003;黄等人。，2004). 观察结果支持这一观点，即在这些条件下，受体的横向活动性会降低，但不会消除(希尔曼和施莱辛格，1982年)研究表明，无论在37℃还是4℃下，被占据受体的横向扩散的减少都不是受体聚集或内化的速率限制步骤(施莱辛格等人。，1983). 我们直接测试了使用这些条件进行研究的可能性。通过电子显微镜（EM），我们分析了在钌红（RR）存在下固定的细胞。RR染色细胞表面和与细胞表面相连的质膜内陷，但不染色细胞膜，区分CCPs和CCVs(图1A). HeLa细胞饥饿18小时，在冰上预冷，然后在0°C下用EGF处理或模拟处理。我们发现，0°C下的EGF刺激诱导CCPs数量增加约三倍（比较图1B)而CCV的数量保持不变(图1B). 因此，在我们的条件下，负责CCP形成的分子机制是功能性的，可以由EGF刺激触发。此外，当EGF刺激的细胞在37°C下转移2分钟时，CCVs的数量显著增加(图1B)，表明在0°C下形成的包被凹坑具有功能性，可以发芽成包被囊泡。

双免疫荧光实验进一步支持在0°C下EGF刺激后CCPs的组装。在第一系列实验中，饥饿的HeLa细胞在0°C下用EGF刺激60分钟，并用AP2和EGFR抗体染色(图1C). 图像分析（请参见材料和方法)用于估计AP2点/μm的数量2和EGFR像素与AP2像素共定位的百分比。为了减少EGF处理导致3D细胞形状变化的可能影响，对细胞面对塑料盘的质膜区域进行了分析。AP2点数/μm2与未刺激对照细胞相比，EGF刺激后细胞表面的增加了2.1倍（0.59±0.03 vs.0.28±0.03点/μm2）。同样，我们发现在EGF刺激下，与未刺激细胞相比，EGFR像素与AP2像素共定位的百分比增加了1.9倍（分别为21.4±4.0和11.2±3.2%）。这些结果与EM获得的结果一致，并表明在0°C时，新形成的CCPs在EGFR聚集区聚集(拉波波特等人。，2003)，并在4°C下用EGFR胞外部分抗体对未固定、未渗透的细胞进行免疫荧光染色(图1D). 在这些条件下，只标记了表面相关的EGFR，我们发现EGFR与氯氰菊酯共定位的百分比增加了1.7倍（从15.6±2.1增加到26.3±5.9%）。最后，我们还进行了三维分析，计算了EGF处理前后整个细胞表面上氯氰菊酯点的数量。对重建每个细胞的26-30个共焦平面进行分析。网格蛋白点数/μm2细胞表面积从0.14±0.09增加到0.63±0.32点/μm2EGF刺激后。

低温刺激EGF揭示信号蛋白和内吞蛋白同时向DRM募集

接下来，我们评估了在CCP形成可以与其内在化分离的条件下（0°C），EGF刺激是否可以诱导EGFR和两种信号衔接蛋白（即Shc和Grb2）向DRM的募集。已知Shc和Grb2在几个受体的配体结合后积极募集到筏，包括EGFR(比迪等人。，2003;Ridyard和Robbins，2003年;杨等人。，2004). 饥饿的HeLa细胞在有或无EGF的情况下在0°C下培养30分钟。用1%Triton X-100在4°C下对受刺激细胞和对照细胞进行裂解，并在5–40%的蔗糖梯度上进行分馏（11个组分；图2A). 含有DRM的浮动组分通过点对两个raft标记的点对点分析进行鉴定，这是霍乱毒素B亚单位（CT-B/HRP）的HRP结合物，特异性结合于膜筏中丰富的脂质成分GM1(帕顿，1994年;莫比乌斯等人。，1999)或小窝蛋白1抗体。分数4-6的一个或两个标记均为阳性(图2A，顶部面板）。在这些相同的组分中，通过Western blot，我们可以很容易地检测到EGF处理后EGFR、Grb2和Shc水平的显著增加(图2A，底部面板），表明raft信号平台中受体和适配器蛋白的招募在0°C时没有受到影响。通过分析两种质膜蛋白胎盘碱性磷酸酶（PLAP）的分布，进一步验证了分形方法的特异性，PLAP是一种已知与DRM特异相关的GPI锚定蛋白(更努力等人。，1998;利帕迪等人。，2000)、和β1整合素，一种跨膜蛋白，据报道可在质膜的非筏形区进行分配(坎宁安等人。，2003). 作为额外的对照，我们还测试了calnexin的分布，这是一种跨膜蛋白，据报道在内质网的非筏区进行分配(舒克等人。，2003). 正如预期的那样，我们发现PLAP几乎只与组分4-6和β相关1与非raft组分7–11相关的整合素亚基和calnexin(图2A). 更重要的是，在EGF刺激后，这些蛋白质的分布都没有发生任何变化(图2A).

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效应蛋白和内吞蛋白与DRM的EGF依赖性关联。（A）用EGF（+EGF）或模拟处理（–EGF）在0℃刺激饥饿的HeLa细胞，并进行处理以分离DRM，如材料和方法然后用斑点法（顶部面板）或免疫印迹法（底部面板）对所示抗体进行分析。免疫印迹，每一部分的1/500进行斑点检测。将每个浮式组分（2–6）的9/10和每个可溶组分（7–11）的1/25的点杂交分别加载到SDS-PAGE凝胶上，以进行EGFR、内吞（Eps15、AP2、Clathrin）、信号效应器（Shc、Grb2）和对照蛋白（PLAP、β1整合素、Calnexin）。漂浮部分和可溶性部分在平行SDS-PAGE凝胶上运行，然后在相同条件下染色。（B） 饥饿的HeLa细胞要么用MβCD（+MβCD）处理，要么模拟处理，在0°C下转移并用EGF（+EGF）刺激，要么模拟治疗（–EGF）。然后处理细胞以分离DRM，然后用所示抗体进行免疫印迹（底部面板）或斑点（顶部面板）。车道荷载如B所示。

然后我们评估了一些内吞蛋白，包括网格蛋白、适配器复合物AP2(Smythe，2002年)和Eps15在EGF刺激后被招募到DRM。特别是，已知Eps15在EGF刺激后会重新分布到质膜(特瓦尔等人。，1996;范·代尔夫特等人。，1997;托里西等人。，1999;孔法洛涅里等人。，2000). 此外，有证据支持这样一种假设，即eps15招募可能是凹坑组装中的首批事件之一(范·代尔夫特等人。，1997)可能是由于其在AP2与质膜对接中的预期作用(本梅拉等人。，1996;特瓦尔等人。，1996;本默拉等人。，1999;托里西等人。，1999). 因此，eps15代表了涂层坑形成动力学中早期事件的良好标记。如所示图2A在EGF刺激后，我们检测到组分4-6中三种蛋白质的水平显著增加，最显著的是组分5中的蛋白质水平（另请参阅图2B定量分析的补充图1）。值得注意的是，在EGF刺激下，DRM和可溶性分馏分配之间的比率对于内吞蛋白和效应蛋白来说都是相同数量级的(图2A).

作为进一步的控制，我们使用胆固醇提取药物MβCD破坏筏。在我们研究中使用的条件下，使用MβCD治疗导致胆固醇提取率为～60%，这是通过比色法测定残余胆固醇得出的（未公布的数据；参见材料和方法详细信息）。我们评估了MβCD处理对EGFR、Eps15、AP2和网格蛋白补充到漂浮部分的影响。用MβCD处理饥饿的HeLa细胞，在有或无EGF的情况下，在0°C下培养60分钟，并通过浮选试验与未处理的细胞进行比较。在存在MβCD的情况下，EGFR、AP2、氯氰菊酯和Eps15没有被招募到漂浮部分(图2B). 作为MβCD治疗有效性的对照，我们分析了一种已知的筏板相关蛋白PLAP的分布。与对照组相比，MβCD处理的细胞中与筏相关的PLAP数量减少(图2B)，与以前的报告一致(利帕尔迪等人。，2000).

上述所有结果的总和表明，DRM是内吞机制的募集位点，这增加了它们也构成CCP形成位点的可能性。

富含GM1的膜结构域的电镜形态鉴定

观察到活性EGFR与内吞和信号蛋白一起被招募到DRM中，促使我们从形态学上识别和表征这些特异位点。作为EM鉴定膜筏的标记物，我们使用CT-B/HRP。用CT-B/HRP标记膜筏区后，通过一系列试验证明了过氧化物酶染色的特异性。

将饥饿的HeLa细胞在0°C、CT-B/HRP和EGF存在下培养1h。然后对样品进行处理(图3A)或未处理(图3B)进行HRP染色。超薄冰冻切片用抗HRP抗体标记免疫金(图3，A和B). 两种条件下的黄金分布没有发现差异(图3，A和B)证明HRP反应产物不会干扰免疫金标记。此外，通过形态计量学，我们发现96%的HRP/金颗粒与HRP反应产物的电子致密染色有关(图3，A–C)表明HRP染色仅限于CT-B/HRP标记区域。然后，我们确定了过氧化物酶或免疫金检测到的转基因富集区的平均长度。我们发现两种条件下的平均值分别为389 nm和272 nm(图3C)而在同一筏上用两种方法测量的单个共沉水筏尺寸之间的平均比值为1.3±0.2（n=31个评估筏）。因此，与免疫金相比，HRP产物的扩散高估了切片贴片每端筏的尺寸，仅为～15–20%。

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CT-B/HRP对电子显微镜鉴定富含GM1的膜域的特异性。饥饿的HeLa细胞在CT-B/HRP和表皮生长因子（A——D） ●●●●。（A） 处理细胞进行HRP染色（质膜下的电子致密染色），并在超薄切片上用抗HRP抗体标记免疫金。棒材，0.22μm。（B） 细胞未经处理以形成HRP染色和用抗HRP抗体标记的免疫金。棒材，0.15μm。（C） A所示实验的形态计量学（n=40个细胞轮廓）。【筏长】、CT-B/HRP标记鉴定的富含GM1区域的平均大小，并用两种方法测量：[CT-B（金）]、簇标记HRP中第一个和最后一个金粒子之间的距离；[CT-B（HRP）]，HRP反应产物电子致密染色的两个边缘之间的距离，显示HRP。数值以纳米±SD表示。[%]表示HRP反应产物的电子致密染色中识别HRP的总金颗粒相对于质膜上存在的总金的百分比。（D） 用表皮生长因子刺激HeLa细胞，在0°C下用抗PLAP抗体预包埋免疫金标记1小时。与质膜相关的PLAP/金片的形态计量显示其长度为91至431 nm（平均值=212±102；n=25）。棒材：（左）0.16μm。（E） 饥饿的HeLa细胞在0°C、CT-B/HRP和表皮生长因子存在下培养1小时。对细胞进行处理以分离DRM，如材料和方法然后对分数进行点对点分析。HRP反应显示体内结合的CT-B（体内CT-B），剥离后用小窝蛋白1（Cav-1）抗体进行免疫染色。

作为进一步的对照，我们在相同的培养条件下，通过PLAP的免疫金定位来检测膜筏(图3D). 通过形态计量学，我们测量了与质膜相关的PLAP/金贴片，发现数值范围为91至431 nm（平均值=212±102 nm；n=25），与通过测量CT-B在体内识别的富含GM1的质膜区域的大小获得的数值相当（如图3，A–C). 这些值与所描述的成簇筏的值一致(Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年; 另请参见讨论）。最后，我们用生化方法测试了CT-B/HRP染色的特异性。将饥饿的HeLa细胞在0°C、CT-B/HRP和EGF存在下培养1 h，然后进行裂解和处理，以分离DRM，如上所述。收集的馏分通过点划线进行分析。HRP反应旨在揭示体内结合的CT-B（CT-B-体内，图3E). 如图所示，在EM分析所用的相同条件下，提供给体内细胞的CT-B仅与DRM组分结合（组分4-6；图3E). 为了进一步证明组分4-6确实是DRM，我们剥离了硝化纤维素并用小窝蛋白1（Cav-1，图3E)与浮动馏分发生反应。

EGFR刺激后EGFR和内吞蛋白被重新摄取到富含GM1的膜结构域

为了评估通过CT-B/HRP标记鉴定的膜筏平台是否招募了内吞蛋白，我们从eps15开始分析。我们首先使用免疫金在HeLa细胞超薄冷冻切片上共定位eps15或EGFR，并用CT-B/HRP染色富含GM1的区域。在有无EGF刺激的情况下进行的实验比较(图4A)，显示在未刺激的细胞中(图4A（左），eps15和EGFR在富含GM1区域内和不富含GM1的区域内的分布大致相同。相反，EGF治疗后(图4A，右），脂筏中eps15和EGFR的富集度约为两倍(图4B). 值得注意的是，在低倍镜下观察，以获得总细胞轮廓的全面视图（未公布的数据），结果显示，只有一小部分总质膜轮廓被CT-B/HRP标记。因此，我们评估了CT-B/HRP标记的细胞轮廓总周长的百分比，发现该值平均为~19%（n=10个细胞轮廓）。这一结果加强了EGF刺激后在质膜筏区观察到的EGFR和Eps15双重增加的重要性。

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Eps15和EGFR定位于质膜富含GM1的区域。（A） 用CT-B-HRP[CT-B（HRP）]处理HeLa细胞，无论是在没有表皮生长因子（–EGF，左面板）还是在有表皮生长因子的情况下（+EGF，右面板）。CT-B-HRP标记后固定和发展过氧化物酶反应。然后将超薄冰冻切片与所示抗体（金）反应，以鉴定eps15或EGFR。箭头指向木筏区域。棒材，0.56μm。（B） A所示实验的形态分析。数据表示为与CT-B（HRP）电子致密斑块相关的金颗粒百分比，在±表皮生长因子处理条件下，在30个细胞剖面中计数。括号中显示了每个处理在30个细胞轮廓中计数的金粒子数。数据是三个独立实验的代表。（C） 在表皮生长因子存在的情况下，用CT-B-HRP在0°C下处理饥饿的HeLa细胞。超薄冰冻切片与所示抗体（金）反应。厚实的实心条带突出显示的电子密集斑块确定了富含GM1的区域[CT-B（HRP）]。Eps15、EGFR和CT-B在两个移植物中的一个中共定位（箭头）。相邻的膜筏缺乏EGFR（箭头所示），与eps15无关，表明事件的特异性。棒材，0.22μm。（D） 用CT-B-HRP[CT-B（HRP）]在0°C下处理饥饿的HeLa细胞，无论是在表皮生长因子缺乏（–EGF）还是存在（+EGF）的情况下。富含GM1的区域用箭头表示。金颗粒识别AP2。棒材：（–EGF）0.56μm；（+EGF）0.70μm。（E） AP2和网格蛋白被招募到表皮生长因子处理细胞中富含GM1的区域。将饥饿的HeLa细胞在0°C下用CT-B/HRP处理，并加入表皮生长因子。然后将超薄冰冻切片与HRP的指示抗体（金）以及AP2或氯氰菊酯的抗体反应。Bar：（左）0.20μm；（右）0.13μm。

通过比较免疫电镜获得的数据(图4，A和B)DRM上获得的数据(图2)很明显，这两种方法在评估raft区域EGFR（和eps15募集）的大小方面显示出相当大的差异。通过DRM分析，在EGF刺激下，所有EGFR的一小部分被招募到浮动部分。扫描中的斑点图2结果显示，在EGF治疗后，约2%的EGFR池位于DRM中。相反，免疫电镜检测发现70%以上的EGFR位于富含GM1的区域(图4，A和B). 然而，值得注意的是，对于DRM，我们分析了EGFR的整个细胞池，而对于免疫-EM，仅评估了血浆膜相关EGFR。为了至少部分解决这种差异，我们测量了与其他细胞区室相比，质膜上EGFR的哪一部分。为此，我们进行了表面生物素化方法（详见补充图2），发现约三分之一的EGFR总库存在于质膜上（补充图2中）。这一结果表明，一旦根据细胞膜上存在的EGFR的比例进行校正，EGFR在DRM组分4–6中的补充比Western blot显示的更为显著（～6%）。此外，在DRM的实验中，在装载前通过超速离心进一步浓缩漂浮部分（2-6），而可溶性部分可以直接装载。从一系列测量结果（未公布的数据）来看，该程序会导致材料的可变损失，通常系数至少为2。尽管这些测量结果使得用两种方法（DRM和免疫-EM）获得的数据在内部更加一致，但两种检测方法之间的大约五倍的差异仍然存在。这与两种方法探索不完全重叠的质膜区域的可能性一致。可能，DRM方法更严格，并且在Triton X-100裂解的条件下，部分质膜富含GM1的区域被溶解。无论是哪种情况，我们的数据强调需要比较使用这两种方法来获得全面的图像。

为了确定EGFR和eps15是否被招募到相同的筏中，我们进行了双重免疫金染色，发现在EGF刺激下，CT-B/HRP阳性膜域与这两种蛋白共定位(图4C). 我们还评估了EGF刺激后其他内吞蛋白向富含GM1的膜的募集。通过免疫金，我们发现在EGF刺激后AP2被招募到CT-B/HRP阳性膜域(图4D). CT-B/HRP和AP2的双重免疫金标记进一步证实了这一结果(图4E，左）或网格蛋白(图4E，右侧）。通过这种方法，我们发现这些结构内吞蛋白可以在新生凹坑中检测到，其中包含了CT-B/HRP-gold检测到的筏膜，进一步支持了它们在膜筏内形成的假说(图4E).

由于EGFR也被认为定位于小窝，小窝构成了膜筏的一个特殊亚群(帕顿和西蒙斯，1995年;Kurzchalia和Parton，1999年b;Nabi和Le，2003年)以小窝蛋白的存在为特点(聪明等人。，1999)，独立于EGF刺激(米诺等人。，1999)，我们检查了在我们的实验条件下，EGFR是否被招募到小窝或质膜的其他筏区（是否在小窝蛋白中富集）。在0°C有无EGF的培养细胞上进行三重免疫金定位，以同时检测EGFR、caveolin和GM1（CT-B）。如所示图5，A和B在两种条件下，EGFR与caveolin和GM1的共定位程度没有显著差异。值得注意的是，在所有检测到三种蛋白共定位的情况下，染色也与形态学上可识别的小凹有关。然而，在没有可检测到的小窝蛋白的情况下，EGFR和GM1在质膜的平坦区域也有大量的共定位(图5A)在EGF刺激下显著增加(图5B).

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EGFR被征募到质膜的非共价、富含GM1的区域。饥饿HeLa细胞超薄冰冻切片的三重免疫金标记，用CT-B/HRP标记，并在有（+EGF）或无表皮生长因子（–EGF）的情况下培养。（A） 用HRP抗体对冷冻切片进行三重标记，以定位GM-1（5 nm）、抗小窝蛋白（10 nm）和EGFR（15 nm）。左边的前两个面板显示了小窝中三种抗原的共定位。最右边的面板显示EGFR和GM1在质膜Bar的平坦区域共定位：（左）0.16μm；（中部）0.15μm；（右）0.1μm。（B） 实验的形态计量学分析如A所示。结果显示质膜上存在15nm金颗粒（鉴定EGFR）的数量，与小窝蛋白和GM1（EGFR+GM1+Cav1）共定位，仅与GM1（EGFR+GM1）共定位，或与其他两种抗原（EGFR）均不共定位。数据参考10个单元格配置文件。值得注意的是，EGFR与GM1和caveolin 1的三重共定位几乎只在形态学上可识别的小窝内发现，而EGFR与GM 1共定位，但与caveolin1不共定位在质膜的平坦区域。

总之，这些结果表明，在EGF刺激下，EGFR（以及由此推断的内吞机制）被招募到明显不同于小窝的质膜筏区。

含EGFR的CCPs从富含GM1的膜域中萌芽

富含GM1的EGFR膜区和CCP组装所需的内吞机制的募集强烈表明，这些结构可以在EGF刺激下从脂筏开始组装。我们寻求对这一假设的直接实验证实。模拟处理或EGF处理的HeLa细胞用CT-B/HRP标记，用抗EGFR或抗TfR抗体标记(图6A). 引人注目的是，几乎所有含EGFR的小孔都与HRP反应产物识别的CT-B/HRP标记的膜区域有关(图6A). CT-B/HRP和TFR（未公开数据）或EGFR的双重免疫金标记也获得了类似的结果(图6B). 值得注意的是，在37°C下转移细胞2分钟，在0°C刺激后，EGFR和HRP/金在CCV内共定位。最后，形态测量学(图6C)对这些样品进行的测试表明，在EGF存在的情况下，大多数含EGFR的涂层凹坑形成于CT-B标记的区域（在实验中为97和83%图6，A和B）。相反，含有TfR的涂层坑随机分布在筏和非筏区域(图6C)独立于EGF刺激。因此，含有EGFR的CCP几乎无一例外地包括raft区域。

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膜筏内形成含有EGFR的涂层坑。（A） 用表皮生长因子（或不含表皮生长因子，未发表的数据）在0°C下，在CT-B-HRP的存在下处理饥饿的HeLa细胞，然后固定和发展过氧化物酶反应[CT-B-（HRP）]。然后将超薄冰冻切片与所示抗体（金）反应。左边，EGFR（金）通过来源于CT-B（过氧化物酶）染色鉴定的富含GM1区域（箭头）的涂层凹坑内化；右侧，TfR（金），通过来自非GM1富集区的涂层坑内化。棒材，0.1μm。（B） HeLa细胞按A处理，然后固定（左侧和中间），或按A处理并在37°C下转移2分钟，然后再固定（右侧）。超薄冰冻切片用免疫金标记EGFR（15nm）和HRP（10nm）。在0°C刺激的细胞中，这两种抗原共同定位在质膜的离散平坦区域（右）和含甲氰菊酯的芽孔（中）。在37°C下转移2分钟的细胞中，这两种抗原在氯氰菊酯包被的囊泡内共定位（左）。棒材：（左）0.11μm；（中部）0.13μm；（右）0.07μm。（C） A和B所示实验的形态分析。数据表示为免疫过氧化物酶或免疫金显示的与CT-B-HRP斑块相关的含有EGFR或含有TfR的包被凹坑（n=60个包被凹痕/条件）的百分比。在–EGF样本中，星号表示，由于饥饿18小时，未检测到含EGFR的凹坑。表皮生长因子刺激细胞和非刺激细胞中标记有TfR的CCPs总数相似，分别为30和35个（n=40个细胞轮廓）。数据代表了三个实验。

EGF刺激剂量和温度不影响EGFR和内吞蛋白向DRM的募集

我们的所有实验都是在0°C下通过EGF刺激进行的，以便在涂层凹坑的形成与其萌芽分离的条件下工作，以便更容易地可视化事件及其形态定量。此外，我们使用高浓度EGF（100 ng/ml），以引起最大反应。一个可能的警告是，低温会削弱EGFR从膜筏中的排出，迫使它们从这些区域内化。此外，人们可能会问，观察到的效应是否是高EGF浓度的“非生理”伪影。因此，我们在37°C下进行实验，比较高剂量（100 ng/ml）和低剂量（1.5 ng/ml）EGF。

在第一系列实验中，我们用CT-B/HRP标记饥饿的HeLa细胞，并在37°C下用1.5或100 ng/ml EGF刺激它们2分钟。冷冻超薄切片用抗EGFR和抗HRP抗体双重标记(图7A). 结果表明，在这两种条件下，EGFR和CT-B均位于质膜的离散区域或形态学鉴定的CCV中(图7A).

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表皮生长因子受体的募集和膜筏中氯氰菊酯涂层小孔的组装不依赖于表皮生长因子处理的剂量和温度。（A） 用CT-B-HRP处理HeLa细胞在0°C下20′，并用表皮生长因子在37°C下刺激2分钟，对其进行双重免疫金标记（顶部面板，表皮生长因子1.5 ng/ml；底部面板，表皮增长因子100 ng/ml）。CT-B-HRP（10 nm）和抗EGFR（15 nm）在质膜（PM）的离散区域内或在网格蛋白包衣囊泡（CV）内共定位。棒材：（右面板）0.21μm：（左上）0.37μm；（左下）0.43μm。（B） 用表皮生长因子100 ng/ml（+EGF 100）或1.5 ng/ml，或模拟处理（–EGF），在37°C下刺激饥饿的HeLa细胞2分钟，并进行处理以分离DRM，如材料和方法，然后用所示抗体进行免疫印迹分析（下图），或用CT-B/HRP进行点印迹分析（上图）以鉴定GM1。车道荷载与图1.

然后，在37°C、1.5或100 ng/ml EGF刺激饥饿的HeLa细胞2分钟后，我们评估了EGFR、AP2、网格蛋白和Eps15对漂浮部分的补充。如上所述，裂解细胞并对其进行处理以分离DRM。使用CT-B/HRP进行点对点分析，确定含有DRM的浮动馏分。如所示图7B，所有分析的蛋白质都被招募到100 ng/ml EGF的漂浮组分中，证明这一事件是由EGF刺激引起的，与温度条件无关。对浮馏分中的EGFR、Eps15、AP2和氯氰菊酯进行定量评估，将PLAP的量标准化，作为膜筏的标记（参见补充图1），证实了这一结果。然而，与0°C条件相比，招募的规模较小（补充图1）。这两种条件之间的差异很可能是因为在37°C时内化迅速从质膜上移除受体和相关的内吞机制。

最后，在37°C下用少量EGF（1.5 ng/ml）刺激的条件下，EGFR、AP2和网格蛋白在DRM组分中富集(图7B). 正如预期的那样，与100 ng/ml EGF刺激条件相比，这种招募的程度更低（补充图1），因为EGFR激活的程度更低。

讨论

脂筏在信号传导中的作用已被广泛记录，因为它们作为物理平台来集中和组装信号转导机制(卡彭特，2000;普拉勒等人。，2000;麦克弗森等人。，2001). 对于RTK，例如EGFR，配体诱导的受体内化本身代表了信号机制的结果，这需要受体的内在激酶活性(卡彭特，2000). 因此，原则上，没有什么可以排除这样的可能性，即脂筏就像组装RTK受体信号下游传播所需的转导机制一样，也可以作为平台，为其内吞招募必要的机制。通过CCPs内化的非信号受体，如TfR和低密度脂蛋白受体（LDLR），在脂筏中不富集(Simons和Ikonen，1997年;Brown和Petersen，1998年). 这一发现导致了一个明显的结论，即CCPs的组装必须发生在质膜的主体内。然而，许多观察结果与此观点相悖，表明情况更为复杂。首先，B细胞抗原受体（BCR）是一种非RTK、多亚单位受体，激活下游靶点的酪氨酸磷酸化和膜筏上的网格蛋白募集(斯托达特等人。，2002). 其次，霍乱和志贺毒素与脂筏中的鞘脂相互作用，但它们通过CCP内化(Sandvig和van Deurs，2002年). 第三，炭疽毒素受体在通过CCP内化之前分成筏(阿布拉米等人。，2003). 第四，胆固醇耗竭破坏脂筏，抑制氯氰菊酯和非氯氰菊酯的内吞作用(Johannes和Lamaze，2002年). 最后，在EGF刺激下，EGFR从筏中退出最近受到质疑(Ringerike公司等人。，2002). 因此，与膜筏相关的信号受体（例如RTK）可能会特异性地向这些膜平台招募信号蛋白和内吞蛋白。

我们目前的结果表明，在EGFR的情况下，脂筏能够招募效应信号分子和内吞机制。我们的发现与斯托达特的发现一致等。(2002)，他证明了CCP介导的BCR内部化的类似情况。虽然，我们在目前的研究中没有提供证据表明CCPs的内吞机制是“活跃的”，Stoddart等。(2002)可以显示酪氨酸磷酸化的氯氰菊酯优先向膜筏募集。此外，这些作者表明，网格蛋白的src依赖性酪氨酸磷酸化是BCR内化的关键事件(斯托达特等人。，2002). 类似地，网格蛋白的磷酸化在EGFR的内化中也很重要(王尔德等人。，1999). 因此，我们研究中显示的内化机制的招募可能涉及“活性”元素，例如磷酸化的网格蛋白。此外，我们在这里显示EGFR-内化CCPs优先从质膜富含GM1的区域形成，而非信号TfR通过在富含GM1的区域内或不富含GM1的区域内形成的CCP随机内化。因此，我们的结果与这样一种情况相一致，即质膜受体只是从质膜位置（无论是否为筏）内化而来，在这种情况下，它表现出与内吞机制相互作用的能力。组成性内化的非信号受体，如TfR或LDLR，不断暴露内吞信号，因此仅作为该特性的功能内化。另一方面，EGFR以配体依赖的方式内化，触发内吞机制的组装，并在其激活的同一位置（即脂筏中）形成包被小孔。

膜筏是动态实体，可以扩散(普拉勒等人。，2000;斯普朗等人。，2001)并结合成更大、更稳定的结构以响应信号(西蒙斯和图姆，2000年;Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年). 目前的想法是，在休眠细胞中，筏很小（直径可能小到40纳米甚至更小，之前等人。，2003)不稳定（或“备用筏”）；西蒙斯和图姆，2000年;Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年). 在刺激下，这些不稳定的小筏聚集在一起，形成更大、更稳定的筏，而这些筏又可以作为有效的信号平台（或“受体簇筏”；西蒙斯和图姆，2000年;Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年). 值得注意的是，文献中关于筏“实际尺寸”的许多争议可能是由于静息细胞中小“储备筏”的“无意”交联引起的，这可能是由各种实验操作引起的(西蒙斯和图姆，2000年;Kusumi公司等人。，2004;市长和拉奥，2004年).

类似的情况也可能适用于我们目前的研究，因为我们在静息细胞（无EGF）和EGF刺激的细胞中检测到大小相似的筏。特别是在未经刺激的细胞中，如我们的实验所检测到的，筏的大小超过了“储备筏”的大小。这可能是因为使用了固定剂（EM程序）或低温（在许多实验中用于将CCP的形成与其内在化解偶联），众所周知，这两种情况都会导致木筏聚合(Kusumi公司等人。，2004). 因此，最有可能的是，我们的形态学分析是在“人造”的情况下进行的，在这种情况下，筏的大小（尤其是在没有生理聚集剂，如EGF）被高估了。然而，我们注意到，这远不是一个缺点，实际上代表了一个“有用的人工制品”。事实上，如果要检测到筏作为直径为40 nm的实体，则很难在形态学水平上准确确定一个蛋白质是否与筏富集（或更稳定地结合）。相反，我们的数据清楚地表明，在EGF刺激下，EGFR和内吞蛋白在筏中富集，而不是在质膜的其他区域，并且筏被并入含有EGFR的新生核。值得注意的是，这些形态学结果通过DRM上的独立生化方法得到了精确的证实。上述考虑以及对“储备筏”和“受体簇筏”之间明确区分概念的接受还应该有助于使筏中是否有足够的膜形成CCP这一悬而未决的问题合理化。在小型“备用筏”中，情况当然不是这样（直径为90 nm的CCP需要～2.5×104纳米2膜厚度vs.～1.2×10三纳米2可在40nm直径的筏中获得）。然而，一个更大的稳定的“受体-簇筏”将包含足够的质膜来形成一个凹坑（～5.7×104纳米2在直径为270-nm的筏中，例如我们测量的那些）。我们顺便注意到，木筏的聚结也被认为是洞穴形成的机制(普拉勒等人。，2000)，一个典型的基于筏的内化细胞器：小窝平均直径为60nm，对应于1.1×10的表面4纳米2大约是一艘“备用筏”所能提供的10倍。

总之，我们的结果表明，RTK可以通过CCPs从膜筏内化，支持质膜上的信号传递域和内化竞争域重叠的观点。这一结论解释了缺乏证据来识别EGFR的“出-后-入-坑”信号，与特征明确的“入-后”信号不同(Yamabhai和Anderson，2002年). 因此，我们提出了这样一种设想，即EGFR内吞纯粹是一种信号事件，由受体的激酶活性触发，因此从质膜上的信号活性域开始发生。我们注意到，如果真的要从筏开始形成含EGFR的CCP，原则上，这可能会模糊目前公认的氯菊酯依赖性和氯菊酯非依赖性/筏依赖性内化途径之间的区别。然而，必须明确区分“拓扑”和“机制”。我们目前的结果仅允许在拓扑结构上得出结论，即只有一个质膜室，其中招募了不同的分子机制来执行不同的EGFR-激活功能。从我们的结果和现有文献的综合分析来看，这些机制是i）向下传播信号所需的“效应器”机制，ii）CCP机制，以及iii）非板球蛋白筏依赖性途径所需的一系列仍不明确的内吞效应器。因此，我们的结果并不意味着筏在机械上“需要”来执行氯氰菊酯途径。事实上，这种可能性是不受欢迎的，因为没有在筏中富集的TfR是通过涂层坑内化的（本研究）。此外，胆固醇阻滞剂，如制霉菌素或菲利平，虽然能破坏非板条菌素筏依赖性内化，但不会干扰氯氰菊酯的内吞作用(罗斯伯格等人。，1992;利桑蒂等人。，1993;施尼策尔等人。，1994)也适用于EGFR(西吉斯蒙德等人。，2005).

尽管不可避免地需要进一步调查，但我们的结果清楚地表明，现在应该将重点从拓扑问题转移到功能问题。换言之，EGFR指向网格蛋白或非网格蛋白筏依赖性途径的定义不应依赖于对受体在筏中保留的内容（非网格蛋白途径）的理解，或是什么导致受体离开筏并进入坑中的理解，而是阐明哪种内吞机制被募集到raft驻留受体，以及在什么条件下，允许通过一种或另一种途径内化。在这一争论中，我们最近证明了受体泛素化优先将EGFR偶联到非网格蛋白筏通路(西吉斯蒙德等人。，2005). 此外，我们发现EGFR经历了不同的翻译后修饰，并致力于不同的内化途径，作为配体剂量和受体激活的函数。在低EGF浓度下，EGFR被酪氨酸磷酸化，完全胜任信号传导，而不是泛素化，并且通过CCPs内化(西吉斯蒙德等人。，2005). 在高EGF浓度下，EGFR变得泛素化，并通过非板球蛋白筏途径表现出实质性内吞作用(西吉斯蒙德等人。，2005). 因此可以想象，不同的翻译后修饰，酪氨酸磷酸化（以及随后的in的暴露-顺式一方面是内吞信号，另一方面是泛素化，可能将raft-reasient受体分别导向氯菊酯或非氯菊酯raft通路。

补充材料

【补充材料】

致谢

我们感谢Tom Kirchhausen博士对手稿进行了批判性审查，感谢Alberto Diaspro博士、Mario Faretta博士、Giuseppe Vicidomini博士和Paolo Bianchini博士对共聚焦分析的帮助。这项工作得到了AIRC（意大利癌症研究协会）、Telethon基金会、欧洲共同体（VI Framework）、MIUR（意大利大学和研究部）和人类科学前沿计划、P.P.D.F.以及AIRC、FIRC（意大利肿瘤研究基金会）、MIUR和Telethon-基金会（GTF03001）的资助至C.T。

笔记

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E04–07–0596)2005年3月16日。

缩写：RTK，受体酪氨酸激酶；表皮生长因子受体；CCP，氯氰菊酯涂层坑；CCV，氯氰菊酯包被囊泡；DRM，耐清洗膜；GPI，糖基磷脂酰肌醇；辣根过氧化物酶；CT-B/HRP、HRP标记霍乱毒素B亚单位；MβCD，甲基-β-环糊精；胎盘碱性磷酸酶；Tf，转铁蛋白；转铁蛋白受体。

D⃞本文的在线版本包含补充材料，网址为MBC在线(http://www.molbiolcell.org).

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会