针对人类免疫缺陷病毒（HIV）1型（HIV-1）的新的抗逆转录病毒战略使发达国家感染者的死亡率大幅降低，但研制成功的预防感染疫苗仍是阻止HIV-1大流行的主要目标。一个人平均每10秒感染一次HIV-1，在非洲受感染严重的国家，如赞比亚和乌干达，近40%的年轻成年人的HIV-1血清呈阳性。
目前，正在研究各种艾滋病毒疫苗策略，包括重组蛋白(16,33,37)，肽(6,8,30)，裸DNA(三,5,10,25,32,34,38)、复制能力和非复制能力（复制子）活病毒载体(7,13,19,27–29,36)、和主从组合（有关审查，请参阅参考4). 大量这些疫苗策略已在猴免疫缺陷病毒（SIV）猕猴模型系统中进行了测试，但迄今为止尚未获得有效的保护性免疫，尽管疾病进程有所改善(5,13,29). 迄今为止，保护猕猴免受SIV感染的唯一有效方法是使用SIV减毒活疫苗。研究表明，转基因，尼日利亚石油公司在恒河猴中不致病的SIV缺失株诱导了高抗SIV抗体滴度和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性(12,22). 随后用感染剂量的致病性SIV毒株对免疫动物进行攻击，获得了防止感染的保护(12). 使用减毒慢病毒疫苗方法的一个主要缺点是，即使是带有尼日利亚石油公司缺失可在新生猕猴和成年猕猴中引起AIDS样疾病(1,2,14). 最近的研究发现，在某些情况下，将减毒活SIV与挑战病毒重组可产生更具毒性的毒株，由此引发了对减毒慢病毒使用的其他担忧(18). 然而，研究结果表明，活病毒载体可能是HIV-1疫苗的理想候选疫苗。
我们最近开发了一种新的潜在HIV-1疫苗，该疫苗基于一种从实验室适应株（NL4-3）和一个HIV-1原分离物（89.6）中表达HIV-1 gp160的弱复制能力狂犬病病毒（RV）(36). HIV-1包膜蛋白在小鼠中稳定且功能性地表达，在用重组gp120单次增强后，诱导了针对HIV-1包膜蛋白的强烈体液反应。此外，在小鼠血清中可以检测到对HIV-1的高中和滴度。
预防HIV-1感染所需的免疫反应目前尚不清楚，但针对HIV-1的保护性免疫反应可能需要免疫系统的两个主要分支。最近关于使用重组HIV-1包膜蛋白的疫苗方法的报道表明，仅体液应答不足以保护免受HIV-1感染，但是，被动转移针对HIV-1包膜蛋白的三种单克隆抗体，可以保护猕猴免受致病性HIV-1/SIV嵌合病毒的后续攻击(26). 其他研究表明，细胞介导的反应在控制HIV-1感染中起着重要作用(9,17). 暴露但未感染的个体通常具有HIV-1特异性CTL，但没有检测到针对HIV-1的抗体(31,35).
关于诱导CTL对由杆状病毒载体表达的外源蛋白产生反应的信息很少。在本研究中，我们分析了表达HIV-1包膜蛋白的重组RV诱导HIV-1特异性CTL的效力。
诱导长效HIV-1 gp160特异性CTL。我们之前对表达实验室适应型HIV-1毒株（NL4-3）和HIV-1原分离物（89.6）HIV-1包膜蛋白的重组RV进行的实验表明，基于RV的载体非常适合于B细胞启动(36). 在本研究中，我们分析了记忆CTL对由减毒RV载体表达的HIV-1包膜蛋白的反应。如前所述，越来越多的证据表明，诱导强有力、持久的CTL应答将是成功的HIV-1疫苗的一个重要特征。
为了分析RV载体诱导抗HIV-1细胞毒性反应的效力，我们用2×107前述的聚焦形成单元（FFU）(36)表达HIV-1的重组RVNL4–3型包膜蛋白（SBN-NL4-3）。感染后105或135天处死三只小鼠，并切除脾脏。三分之一的脾细胞培养物在多重感染（MOI）为1时感染了表达HIV-1的重组痘苗病毒NL4–3型gp160持续16小时，使用补骨脂素（Sigma）和紫外线处理使其失活，并作为呈现细胞添加回培养物。激活7天后，分析受刺激效应细胞对感染野生型痘苗病毒（一种表达HIV-1的重组痘苗病毒）的P815靶细胞的杀伤能力NL4–3型gp160或表达HIV-1 Gag的重组痘苗病毒。
如图所示。，仅对感染表达HIV-1包膜蛋白的重组痘苗病毒的P815靶细胞检测到强烈的细胞毒性反应。感染其他两种痘苗病毒的P815细胞只有很低的裂解率。值得注意的是，这些反应是在用表达HIV-1包膜蛋白的重组RV单次接种后实现的，这表明基于RV的载体能够在单次接种之后诱导长期CTL。
来自HIV-1 gp160免疫小鼠的CTL可诱导长效HIV-1 gp160特异性CTL。每组3只6-8周龄雌性BALB/c小鼠（Harlan Sprague-Dawley）经腹腔接种2×107表达HIV-1的重组RV的FFUNL4–3型包膜蛋白。在单次接种后105（A）至135（B）天，无菌取出并合并三只小鼠的脾脏，制备单细胞悬液。用ACK裂解缓冲液（BioWhittaker）裂解红细胞，并在含有10%胎牛血清的RPMI-10培养基中洗涤两次。脾细胞分为效应细胞和刺激细胞。通过感染表达HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒制备刺激细胞NL4–3型（vCB41）(▪) 在1的MOI下持续2小时。将细胞洗涤一次以去除多余的病毒并孵育16小时。孵育后，使用最终浓度为5μg/ml的补骨脂素灭活牛痘病毒10分钟，用长波紫外线处理4分钟，并洗涤两次。刺激细胞以3:1的比例添加回效应细胞群，并添加10%T-STIM（协作生物医学产品）作为白细胞介素-2的来源。培养CTL的细胞溶解活性通过4-h试验测定51体外刺激7天后，Cr标记的P815靶细胞。通过感染表达HIV-1的痘苗病毒制备靶细胞NL4–3型gp160在MOI为10时持续1小时。清洗细胞以去除多余的病毒并孵育16 h。为了测量背景，用表达HIV-1 Gag（vP1287）（○）或野生型痘苗病毒（vP1170）的痘苗病毒感染目标细胞。清洗一次目标细胞，用100μCi51Cr处理1h，洗涤两次，并以不同E/T比加入效应细胞4h51Cr释放量计算为100×[（实验释放−自发释放）/（最大释放−自然释放）]。通过添加5%Triton X-100溶解的细胞上清液测定最大释放量。在不添加效应细胞的情况下，从培养的靶细胞中测定自发释放。
HIV-1包膜氨基酸序列存在显著差异，但不同病毒之间的交叉保护可能是保护性HIV-1疫苗的要求。为了分析我们的候选疫苗诱导不同HIV-1毒株gp160产生交叉反应CTL的效力，我们筛选了用表达HIV-1 gp160的重组RV免疫小鼠的脾细胞，以对抗表达同源和异源HIV-1包膜蛋白的P815靶细胞。这种方法似乎最有希望，因为使用的HIV-1包膜蛋白的序列完全不同（表)该方法不需要了解不同HIV-1包膜蛋白之间保守的某个表位。对于HIV-1 gp160，否H-2型d日-已知主要分离物的限制性CTL表位（HIV分子免疫学数据库，洛斯阿拉莫斯国家实验室，理论生物学和生物物理，新墨西哥州洛斯阿拉莫斯）。
表1
HIV-1株NL4-3、89.6、Ba-L和JR-FL包膜蛋白的氨基酸特性和差异
| HIV-1株 | %氨基酸同一性或差异性一
|
|---|
| NL4–3型 | 89.6 | 钡-L | JR-FL公司 |
|---|
| NL4–3型 | | 83.3 | 86.9 | 86.9 |
| 89.6 | 19 | | 82.7 | 84.2 |
| 钡-L | 14.4 | 19.7 | | 88.8 |
| JR-FL公司 | 14.4 | 17.8 | 12.1 | |
用2×10腹腔注射免疫两组6只小鼠7表达HIV-1 gp160的重组RV的FFU，来自实验室适应的CXCR4热带菌株（NL4-3）或双热带（CXCR4和CCR5）分离物（89.6）。免疫后三周和五周，每组三只小鼠被处死，取出脾脏，用表达同源HIV-1包膜蛋白（NL4-3或89.6）的重组痘苗病毒刺激脾细胞。刺激7天后，分析效应细胞对感染重组痘苗病毒的P815细胞的裂解能力，重组痘苗疫苗表达来自实验室适应的CXCR4热带HIV-1株（NL4-3）、双热带株（89.6）和两个主要的CCR5热带HIV-1株（Ba-L和JR-FL）的HIV-1包膜蛋白。
两个不同的独立实验的结果如图所示。A用于用表达HIV-1的RV免疫的小鼠NL4–3型图中的环境和。B适用于用表达HIV-1的RV免疫的小鼠89.6环境。正如预期的那样，两组均观察到表达同源抗原的P815细胞的强烈、特异性溶解。更引人注目的是，效应细胞能够交叉杀死表达异源HIV-1包膜蛋白的P815靶细胞。来自SBN-NL4-3免疫小鼠的活化脾细胞在效应/靶（E/T）比为50:1的40%范围内特异性裂解表达JR-FL或89.6 gp160的P815细胞，并且还能够交叉杀伤表达HIV-1的靶细胞钡-Lgp160。与SBN-89.6小鼠的效应细胞也观察到交叉杀伤。表达异源HIV-1包膜蛋白的P815靶细胞的裂解范围与SBN-NL4-3免疫小鼠的活化脾细胞的裂解幅度相同，但表达HIV-1的P815%细胞中只有约20%的细胞被裂解NL4–3被溶解。这些数据表明，RV载体诱导的抗HIV-1 gp160的CTL可能针对HIV-1包膜蛋白内的不同表位。
来自HIV-1 gp160免疫小鼠的CTL交叉杀伤表达异源HIV-1包膜蛋白的靶细胞。每组6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠经腹腔接种2×107表达来自菌株NL4-3（A）或89.6（B）HIV-1包膜蛋白的重组RV的FFU。在单次接种后的3周和4周，无菌取出脾脏，用表达同源HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒在体外刺激脾细胞，如图图例所示。通过感染表达来自NL4–3株（vCB41）HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒制备靶细胞(▪), 89.6（vBD3）（●）、JR-FL（vCB28）（▴）或Ba-L（vBB43）(♦). 为了测量背景，目标细胞被表达HIV-1 Gag（vP1287）（○）或野生型痘苗病毒（vP1170）（φ）的痘苗病毒感染。铬释放分析如图图例所示完成。。所示结果来自两个不同的独立实验。误差条显示标准偏差。
HIV-1特异性CTL活性由CD8介导+T细胞。
通过选择性缺失评估介导细胞溶解活性的T细胞亚群的表型。用2×10免疫3只小鼠7表达HIV-1的重组RV的FFUNL4–3型包膜蛋白，18周后切除脾脏。用表达同源HIV-1包膜蛋白的重组痘苗病毒重新刺激脾细胞7天。完成免疫磁珠细胞分离以耗尽和阳性分离CD8+活化脾细胞培养的T细胞。使用缺乏CD8的培养物完成铬释放分析+T细胞（CD8−)，分离CD8培养物+细胞（CD8+)，或未处理的培养物（CD8+CD8（CD8）−). 用表达HIV-1的痘苗病毒感染P815靶细胞NL4–3型gp160或HIV-1间隙。
如图所示。、CD8+T细胞缺失培养物没有活性，而CD8+在E/T比为25:1和12.5:1时，富含T细胞的培养物和未处理的培养物表现出较高的特异性裂解。事实上，CD8+与未选择群体的结果相反，富含T细胞的群体也富含裂解单位，因为CTL活性仍在12.5:1的平台上。这些数据表明，细胞溶解活性由CD8介导+T细胞亚群。此外，这些结果表明，除抗体外，重组RV载体还产生长效抗HIV-1 CD8+T细胞反应。
细胞溶解活性由CD8介导+T细胞.每组3只6-8周龄雌性BALB/c小鼠经腹腔接种2×107表达NL4-3株HIV-1包膜蛋白的重组RV的FFU。在单次接种后18周，无菌地去除脾脏，并用表达HIV-1的痘苗病毒体外刺激脾细胞NL4–3型如图图例所示的包膜蛋白。.体外刺激后7天，CD8+细胞培养物中的T细胞被耗尽（CD8−)或浓缩（CD8+)使用制造商描述的Dynabeads鼠标CD8（Lyt2）。如图图例所示，完成铬释放分析。培养物耗尽（CD8−)或浓缩（CD8+)CD8 T细胞或（CD8+CD8（CD8）−)未经处理的培养物。通过感染表达NL4-3（vCB41）HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒制备靶细胞。为了测量背景，用表达HIV-1 Gag（vP1287）的痘苗病毒感染靶细胞。背景水平等于或低于6%的特异性溶解。E/T比为25:1（灰色条）和12.5:1（黑色条）。
我们之前证明，表达HIV-1包膜蛋白的RV载体在单次免疫后，再注射重组HIV-1 gp120，能够诱导对HIV-1 gp160的体液反应(36). 越来越多的证据表明，CTL应答在HIV-1免疫应答中起着重要作用(9). 因此，开发有效的预防性HIV-1疫苗可能需要选择能够诱导长期和广泛反应性CTL反应的HIV-1抗原。本文的结果表明，基于RV的载体是诱导此类反应的良好载体。与观察到的体液反应相反，用表达HIV-1包膜蛋白的重组RV单次接种小鼠可导致对HIV-1 Env的强烈CTL反应。此外，这种反应在免疫接种后至少135天内是稳定的。对这种强烈反应的一种解释可能是RV在各种细胞系中生长而不杀死细胞，这一特征可能导致HIV-1基因的表达比细胞病变病毒载体的表达持续时间更长。此外，RV核蛋白的表达，之前被证明是一种外源性超抗原(23,24)，可能有助于增强单一免疫后对HIV-1包膜蛋白的一般免疫反应。
我们的重组RV能够诱导针对多种不同HIV-1包膜蛋白的交叉反应性CTL。以前的研究表明，单一氨基酸交换可以消除CTL的交叉反应性，但其他检查表明，单一甚至双氨基酸替换经常不能消除交叉杀伤(11,20,21). 因此，问题在于重组RV诱导的CTL是否针对不同的表位。然而，我们的结果令人鼓舞，因为一些研究表明，来自HIV-1感染者的CTL即使与HIV-1的不同分支也表现出交叉反应；因此，广泛的交叉反应性是HIV-1疫苗的重要要求(11,35). 据我们所知，只有一项研究表明，金丝雀痘病毒HIV-1疫苗在未感染的志愿者中诱导了跨分支CTL反应(15). 我们目前正在分析重组RV诱导的针对HIV-1 gp160的CTL是否也与来自B以外分支的HIV-1包膜蛋白发生交叉反应。
总之，我们已经表明，用表达HIV-1包膜蛋白的重组RV进行单一疫苗接种，可对不同HIV-1毒株的包膜蛋白产生强烈、持久的CTL反应。这些结果进一步强调了RV作为一种潜在的HIV-1疫苗的用途。与大多数其他病毒载体的情况相比，在人类中仅存在可忽略不计的RV血清阳性，用基于RV的载体免疫HIV-1不会干扰对该载体本身的免疫。由于用RV疫苗株对RV进行口服免疫在黑猩猩中是成功的，并且是致敏的（世界卫生组织，未发表的文件W.H.O./Rab.Res./93.42），因此基于RV的载体也可能有希望诱导对HIV-1的粘膜免疫。对猕猴这种疫苗策略的进一步探索将表明这种载体在诱导对HIV-1的保护性免疫中的有用性。
