二酰甘油激酶Ⅰ调节Ras鸟苷释放蛋白3并抑制Rap1信号

摘要

二酰甘油（DAG）是几种信号蛋白的有效激活剂，其中许多异常激活时，可能有助于癌症的发生或促进(1,2). 几种酶可以代谢信号DAG，但主要途径被认为是磷酸化，这是一种产生磷脂酸的反应，由DAG激酶（DGK）催化（参考文献综述）。2).

DAG通过激活经典和新型蛋白激酶C亚型以及包括Ras鸟苷核苷酸释放蛋白（RasGRPs）在内的其他蛋白质发挥其作用（参考文献综述）。三–5). 虽然DAG的转化作用被归因于PKC的激活，但RasGRP家族的鉴定表明，DAG也可以通过直接激活RasGRPs来转化细胞，这反过来可能导致Ras信号过量。已知的四种RasGRP蛋白是RasGRP1[钙DAG鸟嘌呤交换因子II（CalDAG-GEFII）]、RasGRP2（CalDAG GEFI）、RasGRP3（CalDAG-GEFIII）和RasGRP4（参考文献。5). 每个RasGRP都激活Ras或Rap1，但RasGRP3是唯一的，因为它有助于Ras和Rap1的交换(6–10).

在许多肿瘤中发现Ras的激活突变（参考文献。11). 使用小鼠模型，Chin等。(12)表明Ras表达是维持黑色素瘤的绝对必要条件，其他研究已经证明Ras在转移中的作用（参考文献。13). 总之，这些数据清楚地表明，异常活跃的Ras有助于许多类型癌症的维持和进展。

依赖Rap1的信令还没有被很好地理解。Rap1与Ras具有高度同源性(14)，也能够结合Raf-1(15)这样做可能会对抗Ras的功能。事实上，Rap1的过度表达可以逆转Ras引起的细胞转化(16). 此外，冈田等. (17)证明抑制Rap1使Ras结合Raf-1并启动下游信号(17). 相反，其他研究组已经证明Rap1不能干扰Ras信号(18–20). 对这些相互矛盾的观察结果的一种解释是，Ras和Rap1之间的竞争取决于许多因素，包括Ras和Rap1的相对丰度、不同Raf亚型的表达，以及可能的其他调节蛋白。

Ras和Rap1之间的拮抗关系将能够激活这两种蛋白的RasGRP3置于一个有趣的十字路口，RasGRP2引发的生理反应没有很好的特征。与仅激活Ras相比，同时激活Ras和Rap1可能会减少依赖Ras的下游事件。例如，山下等。(6)比较表达RasGRP1、RasGRP2或RasGRP3的细胞中的Ras依赖性反应、神经突起生长和锚定依赖性细胞生长。与Ras和Rap1同时激活一致，RasGRP3引起的反应介于RasGRP1（Ras激活）和RasGRP2（Rap1激活）之间。然而，这些实验是通过过度表达活性RasGRP突变体进行的，因此它们可能无法反映RasGRP3引发的真正生理反应。事实上，有人会预测，与其总是激活Ras及其拮抗剂Rap1，还不如存在更高程度的调控体内这导致一个或另一个的主要激活。

我们已经证明，DGKζ通过代谢DAG结合并调节RasGRP1的活性(21). 此外，琼斯等。(22)发现DGKα可能通过降低RasGRP1活性来降低T淋巴细胞中Ras的活化。总之，这些数据表明特定的DGK异构体可以调节RasGRP1，并且它们表明DGK也可以调节其他RasGRP。在对编码DGK l基因的靶向缺失小鼠进行鉴定时，我们发现缺乏DAG激酶的细胞降低了Ras活性。进一步的实验表明，DGK l可以结合和调节RasGRP3的活性，并显著降低Rap1的活化。我们将表达v-Ha-Ras原癌基因的转基因小鼠与野生型或DGK？基因敲除小鼠杂交，发现缺乏DGK？的小鼠在对佛波酯反应或受伤后发生的肿瘤较少。总之，我们的数据表明，DGK？调节RasGRP3，但对Rap1的激活有显著影响。

实验程序

材料。Ras转基因（TG.AC）纯合动物由Judson Spalding（国家环境健康科学研究所，通过Taconic农场）提供。Gary Koretzky（宾夕法尼亚大学，费城）提供dgkz（千兆赫兹）^–/+动物。使用Philip Leder（波士顿哈佛大学）的Southern blotting探针（pASV）对TG.AC小鼠进行筛选(23). 使用了以下用品：抗myc和抗血凝素（HA）抗体（钙生物化学）；正常IgG，蛋白质A/G葡聚糖抗磷酸-ERK、抗ERK1/2和抗Rap1（Santa Cruz Biotechnology）；抗pan-Ras（癌基因科学）；谷胱甘肽琼脂糖4B（Amersham Pharmacia）；细胞培养试剂，包括脂质体（Invitrogen）；佛波酯肉豆蔻酸酯醋酸酯、血小板衍生生长因子、磷酸酶抑制剂和未列出的化学物质（西格玛）。

表达质粒。劳伦斯·奎利亚姆（印第安纳波利斯印第安纳大学）提供了RalGDS-GST。先前描述了HA DGK、RasGRP1、Flag DGKζ和激酶死亡的DGKζ(21). 通过定点突变（Stratagene，5′-GTGGGGGACACGGCTGGGCTGGGTGG-3′）制备激酶缺失型DGKⅠ。RasGRP3是从KIAA0351（日本千叶省Kisarazu市Kazusa DNA研究所）获得的，并克隆到pCDNA3.1myc/his中。Rap1质粒来自Johannes L.Bos（荷兰乌得勒支乌得勒支特大学）。通过定点突变（Stratagene，V12:5′-GTCCTGGTTCAGTAGGCGTGGGGGAAG-3′和N17:5′-AGGCGTTGGGAGAATGCTCTGACAGTTCAG-3′）获得Rap1突变体。

DGK中断ι小鼠基因。一个DGKⅠ基因(图1)在噬菌体靶向载体MDASHII-2TK（犹他大学柯克·托马斯）中，将其电穿孔到R1 ES细胞中，然后通过正负选择将其分离(24). 为了筛选ES细胞系进行同源重组，使用EcoRI消化DNA，并使用靶向载体序列外部的DGK l特异性探针进行探测。在31个选择的克隆中，8个克隆含有同源重组等位基因（26%）。将同源重组克隆注射到c57/BL6囊胚中，然后将其植入假孕c57/BL5雌性的子宫中。雄性嵌合体小鼠与c57/BL6雌性小鼠杂交。

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图1。

通过同源重组产生DGKⅠ缺陷动物。(A类)带有胸苷激酶（TK）和新粘菌素耐药盒的DGKⅠ敲除靶向载体。EcoRI用于Southern印迹，阴影框代表探针。图中还显示了用于基因分型的PCR引物（箭头）和PCR产物的大小。(B类)利用尾部裂解物的基因组DNA进行PCR检测动物的基因型。(C类)RT-PCR分析野生型（+/+）或敲除型（-/-）小鼠肝脏的mRNA，以检测DGK l mRNA的表达。

PCR和Southern印迹法进行基因分型。尾部DNA(24)通过Southern blotting进行分析，或使用引物5′-AGGATGGTCCAGGAATGGCTTC-3′和新霉素抗性盒（敲除）内的5′-AggTGGAGTGAGGCAACTAGGC-3′（野生型）或5′-GAGGAGAGCTCACCTAGG-3′进行PCR检测。PCR使用了35个循环，在65°C下退火1.5分钟，在72°C下延伸1.5分钟。

小鼠肿瘤诱导。TG.AC小鼠（FVB/N）与dgk公司ι^–/–或野生型小鼠。通过Southern blotting或PCR在SV40启动子（5′-CCTCATCACTAGAGT-3′）和H-Ras（5′-GCATGAGCTGCAAGTGTGGT-3′）中使用引物检测Ras转基因。在每个实验中，使用年龄和颜色相似的动物作为对照。在佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）诱导实验中，每周用1.25μg PMA（丙酮）对剃毛的动物进行三次治疗，持续8周，并在8周时评估肿瘤负担。两个TG.AC⁺/dgki公司^+/+小鼠的肿瘤数超过40个，这是PMA研究中每只动物的最大肿瘤数(25). 伤口诱导实验按所述进行(26)在背部做一个1厘米的全厚切口。在20周时记录肿瘤数量。使用单尾配对进行统计分析t吨测验。

小鼠胚胎成纤维细胞/转染。HEK293细胞按所述进行维护(21). 通过在胚胎第14.5天收获胚胎来制备来自DGKι或DGKζ小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞。头部和肝脏用于基因分型，剩余组织通过18号针三次。细胞在含有10%FBS和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM中培养。用SV40 T抗原使其永生化。如前所述，所有转染均使用脂质体胺进行(27).

检测H-Ras和Rap1活性的方法。如前所述，使用Stratagene Elk-1荧光素酶系统监测Elk-1的活性(21). 在六孔板中，RasGRP3（每孔500纳克）转染有控制载体或HA-标记的DGK（500纳克/孔）。Elk-1荧光素酶活性归一化为总蛋白。如前所述，对GTP-结合的H-Ras进行下拉分析(21,28). 除了使用Ral-GDS的Rap1-binding结构域外，使用相同的协议沉淀GTP-binding Rap1。

免疫沉淀和Western印迹。转染的HEK293细胞在镁裂解缓冲液或免疫沉淀缓冲液中进行裂解(21). 用IgG/Protein A/G珠预先分离细胞裂解物，然后与抗myc结合珠（Santa Cruz Biotechnology）或蛋白A/G与Rap1抗体（Santa Cruz Bietechnologies）混合2 h（4℃）。按说明进行蛋白质印迹(21). 对于磷酸化ERK实验，将细胞收集到CS裂解缓冲液中（20 mM Tris·HCl，pH 7.5/150 mM NaCl/1 mM EDTA/1 mM EGTA/1%Triton/2.5 mM焦磷酸钠/1 mMβ-甘油磷酸钠/1 m M原钒酸钠/1μg/ml亮氨酸肽/1 mM苯甲基磺酰氟）。用SDS/PAGE分离细胞裂解物，然后用抗磷酸ERK抗体检测磷酸化ERK1/2，然后剥离和重制以检测总ERK1/2。在所有情况下，使用adobe photoshop测定实验组和裂解物/总蛋白对照组的相对蛋白表达。

结果

删除DGKι衰减Ras信号。通过同源重组，我们删除了小鼠DGKⅠ基因第14外显子编码的部分催化结构域(图1). 基因敲除等位基因遵循孟德尔遗传分布，而缺乏DGKⅠ的小鼠(dgki公司^–/–)性别比例正常，大体正常，不表达截短或全长DGK l mRNA(图1和数据未显示）。因为DGKζ在结构上与DGK½相似，调节Ras信号(21)，我们比较了来源于野生型或dgki公司^–/–老鼠。初步实验表明，野生型胚胎成纤维细胞表达DGKⅠmRNA，而dgki公司^–/–单元格没有显示（数据未显示）。通过测量Ras依赖性转录因子Elk-1活性的分析，我们发现删除DGK？降低了血清缺乏细胞以及暴露于血小板衍生生长因子（PDGF，PDGF）的细胞中Elk-1的活性，图2A类)或10%血清（数据未显示）。因此，缺乏DGK l的细胞具有较低的Ras活性，表明DGK l激活了Ras信号。这个结果令人惊讶，因为我们之前证明DGKζ抑制Ras活化(21)，而其删除激活了Ras(29). 为了直接比较这两种密切相关的DGK亚型的作用，我们评估了缺乏DGKζ的胚胎成纤维细胞中Ras的活性(dgkz（千兆赫兹）^–/–). 与我们之前观察到的DGKζ抑制Ras活化的结果一致，与野生型细胞相比，缺乏DGKξ的细胞具有更高的Elk-1活性(图2B类). 因此，DGKζ/ι对Ras信号传导具有相反的作用：DGKζ抑制Ras信号传导，而DGKι激活Ras信号传导。

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图2。

IV型DGK对Ras信号有不同的影响。来自野生型、，dgki公司^–/–(A类)，或dgkz（千兆赫兹）^–/–(B类)用PathDetect质粒构建物转染小鼠胚胎并饥饿过夜。然后用血小板衍生生长因子（PDGF，5.5 h，40 ng/ml）处理它们，并检测荧光素酶活性。所示数据为平均值+SE(n个= 4–6).*,P（P）与野生型相比，<0.05。

DGK公司ι抑制RasGRP3。DGK终止DAG信号，并可以通过结合和抑制RasGRP来调节Ras活性，而RasGRPs需要DAG进行活性(30). 我们考虑了DGK l通过改变RasGRP活性影响Ras信号传导的可能性。使用RT-PCR，我们发现小鼠胚胎成纤维细胞表达RasGRP1-4（数据未显示），这表明我们观察到的Ras信号传导的影响可能是由这些RasGRP的调节引起的。根据子类型，RasGRP激活Ras或Rap1。我们通过与四种RasGRP酶中的一种共存，测试了DGKⅠ是否可以调节HEK293细胞中的RasGRP活性。因为它对Ras信号有不同的影响(图2)，我们还在这些实验中测试了DGKζ。为了测量活性Ras或Rap1，我们使用下拉分析。如所述（参考文献。30)，RasGRP1/4没有激活Rap1（数据未显示），与我们发布的工作一致(21)，我们发现DGK？没有抑制RasGRP1，而DGKζ抑制了它(图3A类). RasGRP2激活Rap1(8)，我们发现DGK？和DGKζ都不影响RasGRP2激活Rap1(图3A类). DGKζ抑制RasGRP4，而DGKι不抑制RasGRP4(图3A类). 最后，我们发现DGK？抑制RasGRP3，持续降低Rap1激活，并可变地影响Ras激活(图3). DGKζ抑制RasGRP3激活Ras和Rap(图3A类). 当用RasGRP3表达时，催化失活的DGK？突变体（Δ？）没有抑制Rap1活性(图3B类)与我们之前的模型一致，即要求DGK活动来监管RasGRP1(21).

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图3。

DGKⅠ选择性抑制RasGRP3。(A类)用RasGRPs和空载体（-）、Flag-DGKζ或Flag-DGκ转染HEK293细胞。24–48小时后，使用GST-RBD下拉分析检测活性Ras（Ras-GTP）或Rap1（Rap1-GTP）。总细胞裂解物用于评估总Ras、Rap1和DGK(n个=每个实验2-6）。(B类)用所示的构建物转染HEK293细胞。48小时后，Rap1-GTP或Ras-GTP亲和沉淀，然后通过Western blotting检测。使用扫描密度计对数据进行分析，结果表明活性Rap1或活性Ras归一化为总Rap1，或裂解物+SE中的Ras(n个= 3).

DGK公司ιRasGRP3和Rap1与同一信号复合体相关。RasGRP3在肾组织中表达(6). 为了测试内源性DGK l和RasGRP3是否在肾脏的相同区域表达，我们进行了就地使用人肾组织进行杂交。我们发现DGK l和RasGRP3在远曲小管中表达，但在肾小球中不表达(图4A类). 因此，这两种蛋白质在同一细胞中表达。此外，我们发现当这两种蛋白在COS-7细胞/DGK l中过度表达时，RasGRP3在核周区域和整个细胞质中广泛共定位（数据未显示）。我们无法检测内源性蛋白的共定位，因为可用的抗体不能识别内源性DGK l。接下来，我们通过在HEK293细胞中表达这些蛋白，然后用抗HA抗体免疫沉淀DGK？，测试DGK？能否与RasGRP3或Rap1共沉淀。与它对RasGRP3和Rap1的抑制作用一致，我们发现DGK？与这两种蛋白共免疫沉淀(图4B类和C类). 它与Rap1的非活性（N17）和活性（V12）突变体相关。Δl也与RasGRP3和Rap1共沉淀（数据未显示）。此外，当我们免疫沉淀Rap1时，我们检测到内源性DGK活性的共沉淀（数据未显示）。我们无法检测到直接在体外纯化的DGKι和Rap1的结合，表明它们不直接相互结合。综合起来，这些数据表明DGK l、RasGRP3和Rap1在同一信号复合体中相关，使DGK能够调节RasGRP2的活性，从而调节Rap1的活性。

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图4。

DGKⅠ与RasGRP3和Rap1共定位和共免疫沉淀。(A类)人类肾脏切片用DGK l或RasGRP3特异的正或反义RNA探针孵育。蓝色信号表示远端卷曲小管中两种蛋白的mRNA。肾小球中几乎没有表达。感官（阴性）控制中的信号最小（数据未显示）。(B类)用抗HA抗体沉淀转染所示质粒的HEK293细胞的细胞裂解物。用SDS/PAGE分离裂解产物或沉淀蛋白，然后用Western blotting检测DGKⅠ和RasGRP3(n个= 2–4). (C类)用所示质粒转染HEK293细胞。用抗Rap1抗体进行免疫沉淀，然后用Western blotting检测DGK l和Rap1(n个= 3).

DGK公司ι主要影响说唱1信号。已知激活的Rap1会干扰Ras信号，从而抑制Ras信号。通过RasGRP3主要影响Rap1活性，DGK l的缺失将导致Rap1的激活，而这反过来又会减少Ras信号。该模型与我们在dgki公司^–/–胚胎成纤维细胞(图2A类). 为了进一步研究这一点，我们评估了Δl表达对Ras依赖信号传导的整体影响。在HEK293细胞中，我们发现RasGRP3的表达增加了通过Elk-1依赖性荧光素酶活性测定的Ras信号。野生型DGK l的共表达并不影响Elk-1活性，但同时表达Δl和RasGRP3可将Elk-1的活性降低到基础水平(图5A类). 这一结果与Δl具有显性负效应一致，导致Rap1激活增加，干扰Ras下游的信号传导。然而，我们发现(图3B类)Δl并没有持续增加Rap1的活化。不一致的显性负效应可能是由于RasGRP3和激酶头DGK l的相对表达水平所致。

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图5。

DGKⅠ通过RasGRP3调节Rap1活性。(A类)用PathDetect质粒RasGRP3和DGK？或激酶缺失DGK？转染HEK293细胞。48小时后，测定荧光素酶活性，然后将其归一化为总蛋白。所示数据为平均值+SE(n个= 5;*,P（P）与对照组相比<0.05）。(B类)将永生胚胎成纤维细胞饥饿过夜，然后用2单位/ml的凝血酶处理。通过亲和沉淀和Western印迹检测活性Rap1和Ras(n个=每种情况2–3）。(C类)如上所述处理永生野生型DGKζ基因敲除或DGK½基因敲除了的胚胎成纤维细胞，然后通过Western blotting测定磷酸化ERK和总ERK水平(n个= 3).

先前的结果是通过过表达DGKι和RasGRP3获得的，这可能是通过改变这些蛋白质的正常化学计量而引起的伪影。例如，Δl和RasGRP3的不同相对表达水平可能导致激酶ead DGK产生不一致的显性负效应，并可能掩盖了野生型DGK-1RasGRP2过度表达时荧光素酶活性的预测增加。为了更准确地研究DGK？对RasGRP3的影响以及由此引起的Ras和Rap信号的变化，我们通过处理野生型或dgki公司^–/–用凝血酶检测胚胎成纤维细胞，然后测量活性Rap1、Ras和ERK。基于其对Rap1的选择性抑制(图3B类)，我们预测DGK l的缺失将增加Rap1的活性。事实上，我们发现从dgki公司^–/–老鼠(图5B类). 使用2分钟时间点的Western blots密度测定法(n个=3），我们发现Rap1在dgki公司^–/–细胞。Rap1可以通过与Raf-1形成非生产性复合物来干扰Ras信号传导（参考文献。31). 这样做时，它不应干扰Ras-GTP的水平，我们在图3B类，但应减少Ras下游的信号传导。因此，我们预测DGK l的删除会增加Rap1-GTP(图5B类)，应该具有相同的效果。与此一致，我们发现野生型和dgki公司^–/–胚胎成纤维细胞(图5B类，两个实验中密度测定无明显变化）。虽然活性Ras没有变化，但我们发现磷酸化ERK在dgki公司^–/–细胞与野生型细胞的比较(图5C类). 使用2分钟时间点的Western blots密度测定法(n个=3），ERK磷酸化在dgki公司^–/–细胞与野生型细胞进行比较。ERK磷酸化在dgki公司^–/–最晚时间点（30分钟）的细胞，可能是由于RasGRP1在高尔基体发出信号(32). 这些数据与Ras依赖性荧光素酶活性降低在dgki公司^–/–成纤维细胞(图2A类). 相反，磷酸化ERK在dgkz（千兆赫兹）^–/–成纤维细胞(图5C类)，与对RasGRP1的影响一致(21). 然而，由于成纤维细胞也表达RasGRP3/4，ERK活性增强dgkz（千兆赫兹）^–/–这些细胞可能也是由于对其中一个RasGRP的影响。总之，我们的数据表明，DGK l抑制RasGRP3，并对Rap1产生显著影响。

删除DGKι减少Ras诱导的肿瘤形成。缺乏DGKⅠ的胚胎成纤维细胞中Ras活性降低表明，删除DGKⅠ可能会影响Ras依赖性肿瘤的形成。为了研究这一点，我们使用了TG.AC小鼠，该小鼠携带多份v-Ha-Ras转基因(23,25)编码Ras的活性形式，使其容易形成肿瘤。例如，皮肤肿瘤可以通过局部应用各种致癌物或简单地损伤皮肤而诱发(26). 在最初的实验中，我们使用RT-PCR证实DGKιmRNA在野生型小鼠的皮肤匀浆中表达（数据未显示）。通过杂交dgki公司^–/–使用TG.AC小鼠的小鼠，我们产生了四组动物：dgk公司ι^+/+/TG公司。自动控制^–（不含Ras转基因的DGK l野生型），dgk公司ι^–/–/TG公司。自动控制^–（不含Ras转基因的DGKⅠ基因敲除），dgk公司ι^+/+/TG公司。自动控制⁺（DGK野生型和Ras转基因），以及dgk公司ι^–/–/TG公司。自动控制⁺（DGK基因敲除与Ras转基因）。我们首先使用PMA诱导皮肤肿瘤。对照组小鼠仅接受载体（丙酮）不会产生皮肤肿瘤，但应用PMA会导致肿瘤形成。同样，全层皮肤损伤也会导致皮肤肿瘤。缺乏Ras转基因小鼠（TG.AC^–)受伤或暴露于PMA时未发生肿瘤（数据未显示），表明TG.AC小鼠中的肿瘤形成是由v-Ha-Ras表达引起的。我们发现，使用创伤或PMA诱发肿瘤dgk公司ι^–/–/TG公司。自动控制⁺动物的肿瘤比dgk公司ι^+/+/TG公司。自动控制⁺动物(图6A类和B类). v-Ha-Ras转基因编码Ras的一种活性形式，表明DGKⅠ基因敲除小鼠的肿瘤负荷减少是由Ras下游的抑制引起的。这与图5其中DGKⅠ的缺失激活了Rap1，从而抑制了ERK磷酸化，但不影响Ras的激活。我们无法测量皮肤肿瘤中的活性Ras或Rap，但在其中一例发生的自发性口腔肿瘤中dgk公司ι^+/+/TG公司。自动控制⁺和一个dgk公司ι^–/–/TG公司。自动控制⁺小鼠，我们在DGKⅠ基因敲除小鼠中检测到较高水平的活性Rap1(图6C类). 因此，在小鼠中删除DGK l可以减少Ras依赖性肿瘤的形成，这与我们在dgki公司^–/–胚胎成纤维细胞。综上所述，我们的数据表明DGK l调节RasGRP3和Rap1，从而调节Ras信号。

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图6。

DGK l的缺失增强了Ras依赖性肿瘤的形成。TG.AC公司⁺/dgki公司^+/+或TG.AC⁺/dgki公司^–/–对动物进行为期8周的PMA治疗，每周三次(A类,n个=每种情况8个）或遭受全层伤害(B类,n个=每种情况22–25，在20周时评估肿瘤）。*,P（P）与溶媒对照动物相比，<0.05。(C类)利用亲和沉淀法，在一个TG.AC的自发性口腔肿瘤中测定活性Rap1的水平⁺/dgki公司^+/+或一台TG.AC⁺/dgki公司^–/–动物。

讨论

我们已经证明，DGK？通过与RasGRP3结合并代谢DAG来调节RasGRP2。DGK l对RasGRP3的抑制似乎主要影响Rap1的激活，从而改变Ras依赖性信号事件。的确，在dgki公司^–/–胚胎成纤维细胞，我们发现活性Rap1水平较高，ERK磷酸化降低。此外，我们注意到缺乏DGKⅠ的TG.AC小鼠肿瘤形成减少。值得注意的是，TG.AC小鼠表达了活性v-Ha-Ras转基因(23,25)，表明删除DGK l的效果发生在Ras下游。Rap1可以激活B-Raf或作为Raf-1的拮抗剂（参考文献。31). 与对Raf-1的主要影响一致，我们发现小鼠胚胎成纤维细胞表达高水平的Raf-1和少量（如果有的话）B-Raf（数据未显示）。先前测试Rap1抗肿瘤作用的研究与我们的研究有着有趣的相似之处。瓦尼等. (33)发现表达Rap1可以抑制H-Ras诱导的转化小鼠成纤维细胞基因组不稳定性。达马克等. (34)发现在转基因小鼠模型中表达Rap1可以降低肺部肿瘤的发病率。最后，Rap1的表达降低了人前列腺癌细胞系PC-3和TSU-Pr1的生长速度，并减弱了肿瘤生长(35). 这些研究使用了Rap1的过度表达(16,33–35)支持我们的数据，其中RasGRP3活性的变化同样改变了Ras信号和随后的肿瘤生长。

DGK l对RasGRP3的调节与之前的模型一致，其中修饰脂质的酶与脂质激活的蛋白质的信号复合物相关。这允许酶引起信号脂质的离散而非全局变化，这些变化可能包括特异性。结合之前的工作，证明DGKζ和-α都可以调节RasGRP1(22,36)DGKζ对RasGRP3/4的抑制作用(图3A类)，这些数据表明DGK对RasGRPs的调节是常见的。

由于每个DGK亚型似乎都受到独特的调节，单个DGK可能调节特定组织、细胞甚至细胞内隔间的RasGRP蛋白。我们还发现DGKζ与RasGRP3共免疫沉淀（数据未显示）。与DGKⅠ一样，DGKζ在肾组织中也与RasGRP3共存。DGKζ也降低了Ras和Rap1的活性，这与DGK的结构相似性一致(图3A类). 我们通过测量RasGRP3诱导的Elk-1荧光素酶活性来测试DGKζ对Ras下游信号传导的影响。与DGKⅦ相反，野生型DGKζ在用RasGRP3表达时，降低了Elk-1活性，而激酶型DGKξ增强了其活性（数据未显示），这表明DGK zea抑制Ras信号传导。因此，两种IV型DGK均抑制RasGRP3，但DGKⅠ主要影响Rap1信号，而DGKζ似乎主要影响Ras信号。事实上，DGKζ似乎广泛影响Ras信号传导，因为它还抑制Ras特异性RasGRP1/4(图3和参考。21)凝血酶处理2分钟后，其缺失增强了胚胎成纤维细胞ERK的磷酸化(图5C类). 最后，我们将DGKζ基因敲除小鼠与TG.AC小鼠杂交，发现dgkz（千兆赫兹）^–/–/TG公司。自动控制⁺小鼠的肿瘤比dgkz（千兆赫兹）^+/+/TG公司。自动控制⁺小鼠（2.8+/-1.2 vs.4.5±3.7，n个=8）当用佛波酯处理时。因此，DGKζ似乎抑制激活Ras的RasGRP，而DGKⅦ似乎选择性地影响Rap1的激活。

DGKζ/1对RasGRP3产生的Ras或Rap选择性影响可能是由于DGK能够结合RasGRP2或Rap1。例如，我们发现过度表达的DGKζ可能与H-Ras相关(21)，这与它对Ras信号的抑制一致，而DGK l与Rap1相关(图4B类). DGK与RasGRP3、Ras或Rap1一起访问亚细胞隔室的能力也可能导致选择性。由于没有足够敏感的抗体识别内源性DGKⅠ，我们无法比较其与内源性Ras或Rap1的亲和力或其真正的亚细胞定位。然而，我们的数据清楚地表明，DGK l抑制RasGRP3和Rap1。更广泛地说，我们已经表明，IV型DGK调节RasGRP3，但受这些DGK影响的下游事件有所不同。

致谢

笔记

作者贡献：D.S.R.、F.S.和M.K.T.设计的研究；D.S.R.、J.H.、K.M.L.和M.K.T.进行了研究；D.S.R.、S.M.P.和M.K.T.分析数据；D.S.R.和M.K.T.撰写了这篇论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：RasGRP，Ras鸟苷释放蛋白；二酰甘油；TG.AC、Ras转基因；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯；HA，血凝素。

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