生物化学杂志。2004年8月15日；382（第1部分）：27–32。
谷氨酰胺利用率上调HepG2细胞中氨基酸转运蛋白ASCT2的表达并刺激ASCT2启动子
收到日期：2004年3月25日；2004年5月25日修订；2004年6月3日接受。
摘要
谷氨酰胺转运进入人肝癌细胞系HepG2主要由ASCT2型转运蛋白催化，该转运蛋白与先前从JAR细胞克隆的转运蛋白序列相同。抗ASCT2蛋白C末端的抗体在蛋白质印迹上显示可以识别ASCT2。使用该抗体，发现细胞生长速度的变化不会影响ASCT2的表达，但谷氨酰胺剥夺会显著降低生长速度和ASCT2表达。许多其他蛋白质的表达在这些条件下不受影响。ASCT2基因5′侧翼区的序列来自人类基因组数据库。该序列的907 bp片段被定向连接到荧光素酶报告载体中，并在转染HepG2细胞时显示出启动子活性。在无谷氨酰胺培养基中进行转染时，启动子活性大大降低，转染后添加谷氨酰胺后，启动子活力恢复。其他必需氨基酸的缺乏不会影响启动子活性，谷氨酰胺缺乏不会影响MCT1（单羧酸转运体1）启动子。这些结果表明，ASCT2启动子活性和ASCT2蛋白在这些细胞中的表达都依赖于谷氨酰胺的可用性。
关键词：ASCT2、谷氨酰胺、肝癌、启动子、调节、转运体
缩写：活化蛋白1；DMEM，Dulbecco改良的Eagle介质；MCT1，单羧酸转运体1
引言
肝癌细胞运输和利用谷氨酰胺的速率远高于正常肝细胞[1]. 谷氨酰胺也是肿瘤细胞生长的必要条件。细胞膜谷氨酰胺转运体的表达被认为是肝细胞转化过程中的一个整体事件，该转运体被认为是抑制肿瘤细胞生长方法的潜在靶点。在一些分化程度更高的人肝癌细胞系中，谷氨酰胺转运的竞争性抑制已被证明在某些条件下会降低细胞增殖（参见[2]).
谷氨酰胺在哺乳动物细胞膜上的转运由许多转运系统介导（参见[三]). 在人体内[4]和老鼠[5]肝癌细胞系，主要的Na+-依赖性谷氨酰胺转运体的性质与经典氨基酸转运系统ASC（丙氨酸/丝氨酸/半胱氨酸优先）的蛋白质类似，但不完全相同。编码ASC样转运体的cDNA已经从许多不同来源中克隆并测序，这些被称为ASCT2[5–7]或ATB0[8–10]. 尽管这些转运体的氨基酸特异性存在微小的物种差异，但从序列相似性可以清楚地看出，它们都是同一蛋白质家族的密切相关成员，现在被称为SLC1A5（参见[11]有关运输工具命名法的最新审查）。
最近Fuchs等人证明了谷氨酰胺转运在肝癌细胞增殖中的重要性[12]，who表明，在许多人肝癌细胞系中，诱导型反义RNA对ASCT2表达的减弱通过细胞凋亡导致细胞死亡。本文表明，谷氨酰胺转运体ASCT2的表达和人类肝癌细胞HepG2中ASCT2启动子的活性都依赖于谷氨酰胺的可用性。
实验
细胞培养
将人肝癌细胞系HepG2和猴肾细胞系COS保存在补充了10%FBS（胎牛血清；Gibco BRL）、100单位/ml青霉素G和0.1 mg/ml链霉素（西格玛）的DMEM（Dulbecco改良Eagle's培养基；Gibco-BRL）中。在一些实验中，无谷氨酰胺DMEM（Gibco BRL）、无亮氨酸DMEM或无蛋氨酸DMEM（ICN）取代了标准培养基。在生长速率分析中，细胞在适当的培养基中培养72小时。每24小时使用血细胞仪对每种情况进行多个细胞计数。
抗体
为了制备ASCT2特异性抗体，合成了C末端肽CPTGDSSATFEKESVM，并通过末端半胱氨酸残基与锁孔帽贝血蓝蛋白偶联。按照标准方案将结合物注射到兔子体内，未分离的血清用于Western印迹实验。一些实验中使用的抗钙网蛋白抗体产生于GST（谷胱甘肽S-转移酶）融合蛋白，如[13]. 将市售纯化酶注入家兔体内，制备谷氨酸脱氢酶抗体。
蛋白质印迹分析
细胞进行胰蛋白酶化、沉淀，然后在洗涤剂中溶解N个-癸酰甲基葡糖胺（2%最终浓度）。用Bradford法测量细胞蛋白浓度[14]. 用SDS/PAGE分离每个样品（30μg），并将蛋白质转移到硝化纤维素上，然后用5%（w/v）脱脂奶粉孵育阻止硝化纤维素。用适当的一级抗体检测印迹，然后用适当的抗兔二级抗体检测，并用ECL®（增强化学发光；Amersham Biosciences）开发。使用ImageQuant（分子动力学）量化条带的强度。
抗ASCT2抗体的特异性验证
pGem载体中全长H4-ASCT2 cDNA[5]被删除生态RI消化并亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-neo（Promega）中。使用序列特异性正向引物和T3作为反向引物，通过PCR检查克隆的正确定位。根据制造商的方案，使用FuGENE 6（Roche）将2μg构建物转染COS细胞。在24小时和48小时时采集细胞进行Western blot分析。
HepG2 ASCT2启动子区的克隆
根据制造商的说明，使用Nucleospin Tissue Kit（Clontech）从HepG2细胞中分离基因组DNA。以下引物对是使用人类基因组数据库中的序列信息设计的（正向引物对应于碱基−713到−689，反向引物对应图中所示序列的+194到+167). 前底漆包含千磅I限制位点和反向引物包含Bgl公司II站点：正向（ASCT2 F1），5′-GCTACGGAATCATAATTCATTACCTCC-3′；背面（ASCT2 R1），5′-AGATCTGGAGTAGCGTTACCAGCAGAAAG-3′。
人类启动子区ASCT2型基因人类ASCT2型如文中所述，基因来自人类基因组数据库。↓ 显示了已发布cDNA序列的5′端[9]和↓显示了预测的转录起始位点，指定为核苷酸0。TATA框（下划线）和通常参与肝脏基因表达的转录因子的推定共有结合位点以粗体显示。AARE，氨基酸反应元件；肝细胞核因子；NF，核因子。
以基因组DNA为模板进行PCR，如下所示：94°C 35个循环40s，65°C 40 s，72°C 1.5 min。
将单个907 bp的带用凝胶提取并克隆到pGEM T-Easy载体（Promega）中。MWG Biotech使用M13正向和反向引物进行测序。将载体和插入物用千磅我和Bgl公司II允许正确的方向。
启动子活性的测定
根据制造商的方案，使用Tfx™-50试剂（Promega），用1.5μg含有ASCT2启动子插入物的pGL3碱性载体和20 ng作为转染对照的pRL-CMV载体共转染HepG2细胞。在24和48小时的时间点采集细胞样本。启动子活性的最佳时间点为48小时。使用标准荧光素酶分析（Promega）测量启动子的活性，并表示为萤火虫发光与雷尼利亚发光。用光度计测量光发射。
在一些实验中使用的pGL3-MCT1（包含单羧酸转运体1）启动子结构是a.P.Halestrap教授（布里斯托尔大学生物化学系）的礼物。
结果
谷氨酰胺向HepG2细胞的转运
谷氨酰胺进入HepG2细胞的转运被发现是钠+-依赖，不容忍李的替代+对于Na+和被过量的丝氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺抑制，但不被N个-氨基异丁酸甲酯（结果未显示）。这些特性与先前在大鼠肝癌细胞系H4-IIE中表征并在卵母细胞中表达的ASCT2转运体的特性相同[5]; 它们也与Bode等人之前报道的HepG2细胞的动力学数据相同[4].
为了确定编码HepG2转运蛋白的cDNA序列，使用对应于ASCT2转运蛋白家族保守区域的引物进行逆转录-PCR。
对单个PCR产物进行测序，并使用重叠序列组装ASCT2 cDNA序列。这与ASCT2/B完全相同0人绒毛膜癌细胞株JAR的转运体克隆[9]（GenBank®登录号U53347）。
抗人ASCT2抗体的特性
先前对ASCT2转运蛋白表达的研究由于缺乏合适的特异性抗体而受到限制。小鼠、大鼠和人类ASCT2/B最后15个氨基酸的比对0氨基酸序列显示，它们都包含C末端序列EKESVM，尽管该序列之前的氨基酸之间存在差异：人类（JAR细胞）、GPAGDATVASEKESVM[9]; 小鼠睾丸[6]; 和大鼠肝癌H4-IIE，GPAGDA-AACEKESVM[5].
如实验部分所述，对小鼠ASCT2的C末端制备抗体，这是当时唯一可用的序列。因此，有必要确定抗体是否识别人类ASCT2转运体。
用克隆到表达载体pCI-neo中的全长H4-ASCT2转染COS细胞，并用ASCT2抗体在Western印迹上探测细胞蛋白。图（A） 表明该抗体识别了未转染COS细胞中58-60 kDa的蛋白带，以及大约70 kDa和100 kDa处的两条次要带。随着转染后时间的延长，主带强度增加。在四个单独的实验中，转染后24小时和48小时的条带强度分别是未转染细胞的3.9±0.8倍和13.8±4.2倍。根据衍生氨基酸序列计算出的ASCT2蛋白的预期分子量为57 kDa。该抗体识别HepG2细胞提取物中相同分子量的单一条带。由于HepG2细胞中抗体识别的带与转染细胞中增加的带相对应，因此可以得出结论，该抗体对HepG2-转运体的C末端具有特异性。COS细胞似乎内源性表达ASCT2样蛋白。图（B） 结果表明，当印迹与抗体升高的肽孵育时，57kDa带被消除。
抗体特异性(A类)用抗ASCT2抗体检测细胞提取物的代表性Western blot。a巷，HepG2细胞；b道，未转染COS细胞；lane c，转染后24小时COS细胞；车道d，转染后48小时COS细胞。箭头指示感兴趣的波段。分子量大小在印迹左侧以kDa表示。(B类)印迹显示HepG2细胞提取物中ASCT2带的肽被阻断。通道a，对照（25μg细胞提取物）；通道b，对照（35μg细胞提取物）；lane c，blot为lane a，用10μg/ml免疫原性肽封闭；用10μg/ml免疫原性肽封闭lane d，blot为lane b。
ASCT2蛋白表达与HepG2细胞生长速度的关系
该抗体用于探讨转运体表达与细胞生长速度之间的关系。HepG2细胞在不同条件下生长会改变其生长速度。众所周知，PMA和新生霉素会影响肝癌细胞的生长速度，并且PMA已被证明通过蛋白激酶C途径抑制SK-Hep细胞对谷氨酰胺的摄取[15]. 细胞在正常含谷氨酰胺培养基（对照）、培养基+PMA、培养基+新生霉素和缺乏谷氨酰胺的正常培养基中培养。在72小时内对细胞进行计数（图). 新生物素和不含谷氨酰胺的培养基都降低了细胞的生长速率，而添加PMA则提高了细胞的生长速率。
培养基对细胞生长速度的影响细胞在大约10时播种5细胞/孔在正常培养基中培养24小时。然后将培养基更换为对照培养基(♦), 补充0.1μM PMA的培养基(▪), 添加0.1 mM新生霉素（×）的培养基或缺乏谷氨酰胺的培养基，但与对照培养基（▴）相同。在更换培养基后的24、48和72小时，将细胞胰蛋白酶化，悬浮在1 ml培养基中并计数。结果为平均值±S。四次测定的E.M。
然后对在这些不同条件下生长的细胞提取物进行ASCT2转运体的Western blot分析（图). ASCT2蛋白表达水平差异显著。在缺乏谷氨酰胺的情况下，细胞生长速度减慢，ASCT2表达显著降低。然而，新生霉素存在下生长缓慢的细胞中ASCT2的表达与正常培养基中生长的细胞相似。在有PMA存在的情况下，细胞以较高的速度生长，ASCT2的表达始终显著降低。结果表明，ASCT2的表达不仅仅是生长速度的函数。ASCT2的表达似乎更依赖于谷氨酰胺的可用性。图显示了一项实验，在该实验中，细胞被剥夺谷氨酰胺7天，然后在存在或不存在转录抑制放线菌素D或翻译抑制环己酰亚胺的情况下添加谷氨酰胺。ASCT2蛋白的表达随着时间的推移而增加，24小时后达到高于在正常含谷氨酰胺培养基中生长的细胞的水平。蛋白质表达的增加被这两种抑制剂阻断，因此涉及转录和翻译的变化。
Western blot显示在图所示条件下生长的HepG2细胞中ASCT2水平(A类)代表性印迹。车道m，分子质量标记（以kDa为单位的大小显示在印迹左侧）；车道a，控制介质；车道b，中等+PMA；lanes c，无谷氨酰胺培养基；车道d，中等+新生霉素。在每种情况下，使用35μg细胞提取物。(B类)四个独立实验中ASCT2谱带的相对强度与上述使用Imagequant估算的结果类似。对照培养基中细胞的平均值为1，结果为平均值±S。E.M.A，对照介质；B、 介质+PMA；C、 无谷氨酰胺培养基；D、 培养基+新生霉素。
添加谷氨酰胺后ASCT2蛋白表达的时间进程HepG2细胞最初在无谷氨酰胺培养基中培养7天。随后，添加谷氨酰胺（5 mM），并通过Western blotting分析30μg细胞提取物样品，如图所示以上。ASCT2蛋白含量在零时间的值取1，其他时间点的值与此相关。结果为平均值±S。四次测定的E.M。在单独的实验中，在标准含谷氨酰胺培养基中培养至少7天的细胞中，ASCT2表达的相对值为4.5。♦, 无抑制剂；▴, +10μg/ml放线菌素D；▪, +10μg/ml环己酰亚胺。
为了确定谷氨酰胺剥夺对ASCT2的影响是否是由于蛋白质降解的非特异性增加所致，还通过Western blotting测定了抗体容易获得的其他蛋白质的表达。图显示了在有和无谷氨酰胺的情况下生长的细胞的ASCT2、线粒体蛋白谷氨酸脱氢酶和内质网蛋白钙网蛋白的表达水平。谷氨酰胺的可用性不影响其他两种蛋白质的表达。
谷氨酰胺利用率对蛋白质表达的影响HepG2细胞在有无谷氨酰胺的条件下生长。然后用抗ASCT2（A）、钙网蛋白（B）或谷氨酸脱氢酶（C）抗体检测细胞蛋白的三个重复印迹。整个实验在四种不同的细胞培养物上重复进行；使用Imagequant对条带进行量化。对于每种抗体，在存在谷氨酰胺的情况下，细胞带的平均强度分别设置为1。开条，存在谷氨酰胺；阴影条，谷氨酰胺缺乏。
谷氨酰胺对ASCT2启动子活性的影响
先前克隆的人类ASCT2 cDNA序列的5′端[9]用于对人类基因组数据库进行BLAST搜索。ASCT2（SLC1A5）基因包含在19号染色体的31 Mb基因组连接中（GenBank®登录号NT_011109.15）。图显示了紧邻cDNA 5′端的DNA序列长度（基因组连接的bp 19560031–19560932）。该序列预计包含ASCT2启动子。已发表cDNA序列的5′端[9]在图中使用的编号中以+149为基数促销员识别软件（伯克利果蝇属基因组项目启动子预测数据库；网址：http://www.fruitfly.org/)预测转录起始位点位于0碱基，推测TATA框起始于−20。使用MatInspector软件确定了一些通常参与肝脏基因调控的蛋白质（肝细胞核因子1、3和4以及核因子1）的推测转录因子结合位点(http://www.genomatix.de/software_services/software/MatInspector/matinscorp.html)和显示。该序列还包含假定的氨基酸调节元件和转录因子AP1（激活蛋白1）结合的一致位点。
DNA序列如图所示如实验部分所述，以HepG2基因组DNA为模板，通过PCR产生，连接到克隆载体pGem-T-Easy中，进行扩增和测序。获得的907 bp产物的序列与图中所示的序列相同将插入物定向亚克隆到pGL3-基本载体（Promega）中。该载体包含编码修改的萤火虫荧光素酶的cDNA，但缺少启动子。这使得DNA插入物的启动子活性可以通过在将载体插入构建物转染到合适的细胞系统后测定荧光素酶活性来测量。细胞与pRL-CMV载体共转染，作为转染对照。该载体包含cDNA编码雷尼利亚荧光素酶和组成型CMV启动子。
图显示了一个实验，其中细胞被转染，并在不含谷氨酰胺或存在谷氨酰胺的培养基中生长48h，在24h和48h后测量启动子活性。平行地，在没有谷氨酰胺的情况下转染细胞并生长24小时，然后用谷氨酰胺补充24小时。转染该pGL3-前体构建物的HepG2细胞中的荧光素酶活性随时间增加而增加，表明克隆的DNA序列含有活性启动子。此外，这些结果表明，虽然在不存在谷氨酰胺的情况下，启动子在一定程度上是活性的，但在供应谷氨酰胺时，活性显著增加。添加谷氨酸并不能模拟谷氨酰胺的作用。
转染pGL3-basic启动子的HepG2细胞提取物中荧光素酶的活性用pGL3构建物和pRL-CMV载体联合转染HepG2细胞，并在不同培养基中生长。A、 零时间转染细胞，无谷氨酰胺培养；B、 细胞在零时间转染并在谷氨酰胺存在下生长；C、 零时间转染细胞，在不含谷氨酰胺的情况下生长24h，然后添加谷氨酰胺，再生长24h；D、 细胞在零时间转染，在无谷氨酰胺的情况下生长24小时，然后用5 mM谷氨酸再生长24小时。结果为平均值±S。六个单独转染实验的E.M.，表示为萤火虫发光与雷尼利亚发光。转染后24小时（开条）和48小时（阴影条）测定启动子活性。
为了确定启动子活性是否对谷氨酰胺有特异性反应，在缺乏必需氨基酸亮氨酸或蛋氨酸的培养基中进行转染。图表明亮氨酸或蛋氨酸的缺乏并没有对启动子活性产生很大影响。对含有MCT1启动子的构建物进行了相同的实验。在这种情况下，启动子活性不受谷氨酰胺、蛋氨酸或亮氨酸去除的影响（结果未显示）。这些结果表明谷氨酰胺本身以某种方式激活ASCT2启动子并增加ASCT2的表达。
pGL3-basic载体转染HepG2细胞在不同培养基中的荧光素酶活性用pGL3构建物和pRL-CMV载体在不同培养基中共同转染细胞，并在相同培养基中培养48 h。在48小时的时间点读取发光读数。A、 谷氨酰胺缺乏培养基；B、 含有所有氨基酸的标准培养基；C、 缺乏亮氨酸的培养基；D、 缺乏蛋氨酸的中等。
讨论
本文的结果描述了影响人类肝癌细胞HepG2中ASCT2转运体表达的一些因素。谷氨酰胺的缺乏会降低细胞的生长速度和ASCT2的表达。PMA增加了生长速度，但降低了ASCT2蛋白的表达。这种蛋白表达减少可能是先前在SK-Hep细胞中观察到的PMA摄取谷氨酰胺速率降低的原因[15,16]. 新生霉素降低生长速度，但对蛋白质表达无影响。谷氨酰胺不是这些细胞的唯一能量来源，因为所有培养基都含有5 mM葡萄糖。同样，谷氨酰胺并不是简单地作为谷氨酸的来源发挥作用，因为培养基中通常存在低水平的谷氨酸，添加5 mM谷氨酸不会增加启动子活性。因此，ASCT2的表达似乎与谷氨酰胺本身的可用性直接相关。谷氨酰胺缺乏的影响不仅仅是由于蛋白质降解的普遍增加，因为许多其他蛋白质不受影响。然而，不能排除ASCT2是一组可能受到谷氨酰胺影响的快速转换蛋白之一。
研究还表明，谷氨酰胺可以增强克隆的ASCT2启动子的活性，同样是在谷氨酰胺不是唯一能源的情况下。谷氨酰胺剥夺对启动子活性的影响并不是通过去除必需氨基酸蛋氨酸或亮氨酸来模拟的，因此可能是相对特异的。去除谷氨酰胺不会影响细胞转染或不同启动子（MCT1）的活性，这表明该反应并不是对启动子功能的一般影响。
已知谷氨酰胺会影响其他系统中的基因表达。谷氨酰胺刺激肠上皮细胞增殖，这与ERK（细胞外信号调节激酶）和JNK（c-Jun N末端激酶）信号通路的激活有关，导致激活蛋白依赖性基因转录增加4倍[17,18]. 许多谷氨酰胺代谢物没有观察到这些影响，这表明谷氨酰胺本身可以作为一种信号间接影响基因表达。ASCT2转运体的激活可能与信号通路的激活有关。需要对ASCT2启动子进行进一步分析，以确定谷氨酰胺的作用位点和特定转录因子的参与。特别是，对假定的氨基酸响应元件和AP1结合位点的可能作用的研究将具有重要意义。
谷氨酰胺激活ASCT2表达是营养基因调控的一个新例子。已证明，去除氨基酸底物可以增加某些其他蛋白质的表达，例如氨基酸转运系统A（例如，参见[19])，肾上皮谷氨酸转运体EAAC1[20]和天冬酰胺合成酶[21]. 据我们所知，这是第一个通过剥夺哺乳动物细胞系统中的氨基酸底物而降低转运蛋白表达的例子。
致谢
这项工作由BBSRC（生物技术和生物科学研究理事会）资助。
工具书类
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