负链RNA病毒的反向遗传学,最初针对流感病毒开发(8,22),极大地改变了我们对这些病毒复制周期的理解。此外,这种方法允许对病毒基因组进行基因操作,以产生新的病毒,这些病毒可以用作活疫苗、减毒疫苗或载体来表达异源蛋白(12). 在过去的5年里,大多数重要的非片段、负链RNA病毒都是从重组DNA中被拯救出来的。首先,Schnell等人(30)成功地从克隆DNA中回收狂犬病病毒。不久之后,针对水疱性口炎病毒开发了救援系统(21,32),呼吸道合胞病毒(5,第18页)、麻疹病毒(29),仙台病毒(14,20)以及最近的人类副流感3型(7,17),牛瘟病毒(1),猴病毒5(16)牛呼吸道合胞病毒(4)和新城疫病毒(27). Bridgen和Elliott(三)成功地从cDNA中拯救了一种分段的负链RNA病毒,即布尼亚病毒。一般来说,所有这些方法都依赖于RNA和病毒蛋白(即核蛋白和RNA-依赖性RNA聚合酶)的核糖核蛋白(RNP)复合物的细胞内重建,这些复合物通过各种技术引入细胞。通常,表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒用于驱动抗原阳性RNA的转录作为模板,以启动复制周期。或者,转录由T7 RNA聚合酶驱动,该聚合酶在特定细胞系中组成性表达。通过直接将裸RNA(正义或负义)转染到表达包衣、转录和复制所需蛋白的细胞中,也已报道成功的恢复(20). 虽然在其他负链RNA病毒之前,针对甲型流感病毒建立了允许负链RNA基因操作的反向遗传学技术(8,22,31)事实证明,从cDNA中完全回收感染性流感病毒而不使用辅助病毒在技术上更为困难。
甲型流感病毒的基因组由八段单链负义RNA组成(25). 病毒基因组包被、转录和复制所需的最小病毒蛋白集是病毒RNA依赖RNA聚合酶复合物(PB1、PB2和PA)和核蛋白(NP)的三个亚单位(18). 最初,为了操纵流感病毒的基因组,在存在聚合酶蛋白的情况下,从质粒DNA转录的RNA和从纯化流感病毒中分离的NP在体外重组RNP(8,9). 将体外重组RNP转染到感染辅助性流感病毒的细胞中,该病毒提供剩余的病毒蛋白和RNA片段,从而产生转染病毒。这项技术在提高我们对流感病毒分子生物学和致病性的理解方面极为有用。然而,它依赖高度专业化的选择方法从辅助病毒中分离转染病毒,这限制了它对有限数量病毒株的某些RNA片段的使用。
最近,基于体内转录RNA和细胞内表达的病毒蛋白中RNP的细胞内重建,开发了将流感病毒RNP引入细胞的替代方法(23,24,28,33). 我们发现,从重组质粒表达的三种聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA)和核蛋白(NP)可以在转染的人293细胞中封装、转录和复制含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的流感病毒RNA(vRNA)样RNA(28). 通过将质粒DNA(pPOLI-CAT-RT)与位于vRNA-编码区上游的截短人类RNA聚合酶I(Pol I)启动子(核苷酸[nt]−250 to−1)转染,将这种vRNA-like报告基因导入细胞。三角肝炎病毒基因组核酶的序列位于vRNA编码区的下游,以确保RNA处理提供正确的vRNA 3′端。还证明,通过将CAT报告基因的质粒编码替换为真正的流感vRNA片段的质粒,当转染细胞感染流感辅助病毒时,细胞内重组的RNP复合物可以被拯救成转染病毒。因此,已经为编码神经氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、NS1和NEP蛋白以及聚合酶2碱性蛋白(PB2)的片段建立了基于RNA Pol I启动子驱动的反向遗传学技术的辅助病毒救援系统(11,13,26,28). 这些结果表明,流感病毒的八个vRNA片段与三种聚合酶蛋白和NP的共表达可能允许从质粒DNA中拯救感染性流感病毒。
在本报告中,我们描述了从重组DNA中拯救甲型流感病毒。该系统完全由质粒驱动,不涉及任何辅助病毒或异源病毒的使用(图。). 为了从克隆的cDNA中恢复感染性流感病毒,我们使用了八种质粒的混合物,从截短的人类Pol I启动子中表达流感a/WSN/33病毒的单个vRNA片段。我们还替换了之前使用的四种蛋白表达质粒,它们在小鼠羟甲基戊二酰辅酶a还原酶(HMG)启动子的控制下表达PB1、PB2、PA和NP(28)在腺病毒2型主要晚期启动子(pGT-h-PB1、pGT-h_PB2、pGT-h-PA和pGT-h-NP)的控制下,质粒表达相同的蛋白质(2). 将这四种质粒与pPOLI-CAT-RT共转染到293或Vero细胞中导致CAT表达(结果未显示)。我们决定使用Vero细胞进行病毒拯救,因为它们比293细胞更好地支持A/WSN/33流感病毒的生长(最大病毒滴度相差约1 log)(结果未显示)。
用于甲型流感病毒的基于质粒的救援系统的示意图。通过将PB1、PB2、PA和NP蛋白的开放阅读框插入到Bcl公司pGT-h质粒的克隆位点(2). PB1和PA基因来源于A/WSN/33型流感病毒。PB2和NP基因来源于A/PR/8/34流感病毒。流感A/WSN/33病毒的病毒基因组序列被克隆到基于pUC18或pUC19的质粒中,位于截短的人类RNA Pol I启动子(nt−250至−1)之间(19)和丙型肝炎病毒核酶的序列,以与pPOLI-CAT-RT类似的方式描述(28). 利用常规诱变技术将遗传标记插入HA和NA编码质粒。对于病毒拯救,每种聚合酶蛋白表达质粒(pGT-h-PB1、pGT-h_PB2和pGT-h-PA)各5μg,NP表达的pGT-h-NP各10μg,八种vRNA-编码转录质粒(pPOLI-PB2-RT、pPOLI-PB1-RT、p POLI-PA-RT、pPO利-HA-RT、p PO利-NP-RT、pPOLI-NA-RT、p-POLI-M-RT和pPOLI-NS-RT)各3μg在20 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中稀释至0.1μg/μl的浓度。将DNA溶液添加到含有240μl DOTAP和720μl 20 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)的稀释DOTAP脂质体转染试剂(Boehringer)中。将转染混合物在室温下培养15分钟,与6.5 ml含有0.5%胎牛血清、0.3%牛血清白蛋白、青霉素和链霉素的MEM混合,并添加到用磷酸盐缓冲液在8.5厘米的培养皿(约10个)中洗涤的近汇合Vero细胞中7单元格)。转染后24小时,去除转染混合物,用8 ml新鲜培养基培养细胞,每天更换培养基4天。通过在MDBK细胞上进行定位和扩增,从转染培养皿中获得的培养基筛选拯救的流感病毒。POL I,截断的人类RNA聚合酶I启动子;R、 基因组肝炎病毒核酶;MLP,腺病毒2型主要晚期启动子;pA,来自SV40的聚腺苷化序列。
为了拯救病毒,将直径为8.5 cm的培养皿中的近汇合Vero细胞与四种蛋白表达质粒和八种vRNA转录质粒(pPOL-PB2-RT、pPOLI-PB1-RT、pPOL-PA-RT、p POLI-HA-RT、pPOLI-NP-RT、pPOLI-NA-RT、p POL-NA-RT、p-POLI-M-RT和pPOLI-NS-RT)共转染。24小时后,从细胞中取出转染培养基,用8毫升新鲜培养基(MEM)替换,其中含有0.5%胎牛血清、0.3%牛血清白蛋白、青霉素和链霉素。转染细胞在转染后至少保存4天。每天,从转染细胞中收集培养基,并通过标准方法在MDBK细胞上放置0.5毫升等分样品来检测是否存在流感病毒。剩下的培养基转移到75厘米2用于扩增任何挽救病毒的亚融合MDBK细胞烧瓶。该程序在转染后第4天使感染性流感病毒恢复。我们从一个8.5厘米的培养皿中获得了约10到20个PFU的病毒7细胞。被拯救的病毒表现出一种特殊的特性,这是a/WSN/33型流感病毒的特征,即在没有胰蛋白酶的情况下在MDBK细胞上形成斑块。被拯救的病毒形成的斑块大小与生长在同一MDBK细胞上的真正野生型流感A/WSN/33病毒形成的斑大小相当(结果未显示)。
为了正式证明在MDBK细胞上观察到的病毒斑块是由源自克隆cDNA的病毒形成的,我们分析了引入遗传标签的八个vRNA片段中的两个。HA片段在vRNA的3′端附近包含6个核苷酸的突变(26). 将3′端(3′-UUUUG-5′)的核苷酸31~35替换为3′-AAAAC-5′,导致信号肽内HA N端附近的氨基酸4(K→F)和氨基酸5(L→V)发生氨基酸取代。此外,在核苷酸40处产生了一个沉默的C→U突变。这些更改引入了几个新的限制站点,包括Spe公司我的网站。NA片段在核苷酸1358和1360处包含两个沉默突变,引入了一个新的萨克I限制站点(28). 用感染挽救转染病毒的MDBK细胞培养基分离vRNA。用逆转录PCR(RT-PCR)扩增含有遗传标记的HA和NA vRNA的短区域,然后用酶消化法分析Spe公司我和萨克我分别限制酶。作为对照,使用相同的RT-PCR引物从真实的a/WSN/33病毒分离的vRNA中扩增出HA和NA片段的相同区域。正如预期的那样,从两种病毒中获得的PCR产物具有相同的大小(图。,比较车道2和5以及车道7和10)。来源于拯救的转染病毒的HA和NA片段的那些可以用Spe公司我和萨克一、 分别为(车道3和8)。然而,正如预期的那样,来自真正的A/WSN/33病毒的PCR产物没有被消化(通道6和11)。对照RT-PCR反应中遗漏逆转录酶导致没有可见的PCR产物(第4和第9道)。
通过RT-PCR和限制性内切酶分析证明获救病毒HA和NA vRNA片段中存在遗传标签。从感染MDBK细胞的培养基中分离出拯救病毒的vRNA。用5 U无RNase DNA酶处理100微升培养基,以去除携带的任何残留质粒DNA。37°C下15分钟后,按照制造商的说明,使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)分离vRNA。如前所述,从纯化病毒中分离出来自真实野生型A/WSN/33病毒的vRNA(10). 用寡核苷酸引物5′-GCGCTTAGAGAAAGCAGGGGAAAAAAA-3′(对应于nt 1至21)和5′-CGCGAGCTTCTCGAATATGTCAAC-3′(对应于nt 129至149),通过RT-PCR扩增HA vRNA 3′末端的第一149 nt,得到165 nt长的PCR产物。为了从NA片段中扩增含有遗传标记的序列,在RT-PCR中使用引物5′-TGGACTAGTGGGAGCAT-3′(对应于nt 1280到1309)和5′-GAACAACTACTTGTCAATGGT-3′(相应于nt 1367到1388)产生108-nt PCR产物。将HA和NA特异性PCR产物在37°C的温度下,在存在(+)或不存在(-)10 USpe公司我和萨克我分别限制酶。样品在16%聚丙烯酰胺凝胶上进行分析,并用溴化乙锭染色。通道:1、DNA大小标记(显示核苷酸大小);2、3、7和8,挽救病毒的PCR产物;4和9,省略逆转录酶的对照反应;5、6、10和11,来自真实野生型A/WSN病毒的PCR产物。
应该指出的是,我们已经成功地从表达负链vRNA的质粒中回收了流感病毒。这似乎与一些早期的研究相矛盾,这些研究强调了使用正链RNA拯救负链RNA病毒的重要性(三,第29页,30). 然而,最近还报道了从负链RNA中成功回收负链RNA病毒(7,20). 由于在转染后的早期阶段,来自四个蛋白质表达质粒的正义mRNA与从转录质粒转录的裸负义基因组vRNA共存,因此不可避免地会形成双链RNA。双链RNA的形成可能导致诱导干扰素介导的抗病毒反应,从而抑制任何挽救病毒的生长。因此,使用诸如Vero这样的细胞系,已知其缺乏干扰素表达(6),可能是成功拯救病毒的重要因素。然而,还需要进一步的工作来证明这一点。
目前,我们能够从大约10个感染性病毒颗粒中拯救1到2个6转染细胞,与其他负链RNA病毒获得的“平均”回收率相对应。通过提高转染效率和优化转染质粒的比例,可能获得更高的病毒回收率。最近,Gómez-Puertas等人(15)证明了通过优化质粒比例,它们可以显著增加由表达的病毒蛋白形成流感病毒样颗粒。此外,表达病毒基因组RNA(PB1、PB2、PA和NP)包被、转录和复制所需基本蛋白的细胞株可以帮助减少所需质粒的数量,从而提高救援效率。
总之,我们通过共转染8个转录质粒的单个vRNA片段和4个蛋白表达质粒,在没有任何辅助病毒的情况下,完全从cDNA中拯救了一种重组甲型流感病毒。通过提供两个不同基因组片段中存在两个基因标签的证据,确认了获救病毒的身份。甲型流感病毒完全基于质粒的救援系统的开发为研究流感病毒复制的不同方面及其与宿主细胞的相互作用开辟了道路。此外,它还可以完全操纵病毒的基因组,通过在流感病毒蛋白中引入特定的外源表位,这可能导致不仅针对流感,而且针对其他传染源开发新的疫苗株。与早期的基于辅助病毒的救援技术相比,基于质粒的系统可以很容易地用于生成同时包含多个不同基因多重突变的感染性流感病毒。