仙台病毒C蛋白对抗干扰素介导的抗病毒状态诱导

摘要

干扰素（IFN）是一个细胞因子家族，最初通过其赋予细胞抵抗病毒感染的能力来鉴定(14)也参与细胞生长调节和免疫激活(30,33). 细胞感染多种病毒直接诱导一些干扰素（如干扰素-α4和干扰素β）的转录和合成(24,34). 这些干扰素被分泌并以自分泌或旁分泌的方式与组成性表达的细胞表面受体相互作用，通过JAK-STAT途径传递信号以激活50个以上的干扰素刺激基因，包括I型干扰素(6). 其中一些IFN刺激的基因负责IFN的多种生物效应，包括其抗病毒活性。除了在未感染的细胞中建立抗病毒状态外，干扰素系统还有助于消除病毒感染的细胞(38). 因此，干扰素系统被认为对高等脊椎动物的生存至关重要，因为它在特异性免疫反应开始前几天提供了早期防御线(33).

仙台病毒（SeV）是一种副粘病毒模型，通常用于在细胞培养中诱导I型干扰素，是实验室小鼠的自然呼吸道病原体(15). SeV毒株对小鼠的致病性存在显著差异，但其毒力的决定因素基本未知。我们的参考SeV株Z最初于20世纪50年代初在日本分离出来，适合在鸡胚中生长。卵细胞的这种适应性和持续传代无疑会降低其对小鼠的毒力，因为50%的致死剂量（LD₅₀)SeV的^Z约为6×10^三而最近分离出的Ohita野毒株（来自一种致命的动物疫病，仅在小鼠中传播[SeV^M（M）])约为4×10¹(16). SeV公司^M（M）然而，在细胞培养中生长不良，并且它适应LLC-MK2（猴肾）细胞的生长，导致病毒克隆对小鼠表现出不同程度的致病性降低。其中一个克隆，MVC11（SeV^MVC公司)似乎完全无毒（LD₅₀大于8×10⁵[即，在可能的最高剂量下没有一只小鼠死亡]）。

值得注意的是，SeV^MVC公司仅包含与亲本SeV相关的两个氨基酸替换^M（M）即C蛋白中的F170S和L蛋白中的E2050A（图。​（图1）1) (16). 这两种突变可能是SeV相对无能的原因^MVC公司在小鼠呼吸道复制并引起严重疾病。在之前的研究中，我们通过交换SeV的C基因，部分检查了两个替换中的哪一个与上述表型有关^Z和它本身，SeV^M（M），或SeV^MVC公司反过来（产生重组rSeV^Z-C类^Z、rSeV^Z-C类^M（M）和rSeV^Z-C类^MVC公司，分别[图。1]) (12). 野生型rSeV^Z-C类^Z（从DNA中回收）对小鼠的毒力与天然Z病毒（LD）相同₅₀约6×10^三)和替换居民C^Z带有菌株M的基因不影响这种毒力。更换居民C^Z带有C的基因^MVC公司然而，在两种独立分离的病毒中，LD增加₅₀rSeV的^Z-C类^MVC公司通过>2个日志，因此病毒现在与SeV一样无毒^MVC公司.因为rSeV之间唯一已知的差异^Z-C类^M（M）和rSeV^Z-C类^MVC公司是C^F170S型突变，C蛋白的正常功能似乎是小鼠毒力所必需的。野生型SeV C蛋白也被认为是病毒RNA合成的启动子特异性抑制剂(1,28,32). C类^F170S型突变同样与这种功能的丧失有关，并且至少在一定程度上是这些病毒在MK2细胞中复制增强的原因。

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图1

检测的SeV菌株的基因型和表型。本研究中检测到的各种SeV菌株的基因型用左边的矩形表示，其中基因的线性阵列（未按比例绘制）显示为方框。也显示了与P ORF重叠的C和V ORF的相对位置。M应变序列为白色，Z应变序列为灰色，H应变序列为阴影线。这些rSeV^Z所有毒株都携带一个标记的N基因，该蛋白在SDS-PAGE上的迁移与Z毒株不同，以将这些病毒与天然SeV区分开来^ZC基因170位和L基因2050位的氨基酸显示在基因组下方。小鼠这些病毒感染的表型（LD₅₀)取自参考文献12和16本研究测定了BF细胞的这些功能，包括在SeV感染一段时间后VSV复制（repl.）的能力（a）和阻止IFN建立抗病毒状态的能力（b），以及由此产生的细胞内Stat1蛋白水平（c）。

尽管rSeV^Z-C类^MVC公司无毒，在感染的第一天，它在小鼠呼吸道中生长正常。然而，rSeV中的病毒滴度^Z-C类^M（M）或rSeV^Z-C类^Z-感染小鼠的肺部每天增加约5天，rSeV中的病毒滴度^Z-C类^MVC公司-感染小鼠仅在第一天增加，rSeV^Z-C类^MVC公司然后迅速从肺部清除(12). 对于特异性不能表达AUG的rSeV菌株，发现了类似的小鼠感染早期限制¹¹⁴-起始C蛋白(22)或者不能编辑P基因mRNA，因此不表达V蛋白(7,8,19). 免疫幼稚小鼠的宿主抗病毒反应在限制随后的突变SeV感染方面的快速性表明，可能与宿主先天免疫的某些方面有关，可能是由于V和C蛋白功能的丧失。从这个角度来看，SeV C和V蛋白的一个功能是调节先天免疫反应，以维持病毒在小鼠呼吸道的多个复制周期(19). 在本文中，我们报道了SeV C蛋白在对抗干扰素介导的细胞抗病毒反应中发挥的作用。

材料和方法

结果

如上所述，SeV^MVC公司因其复制效率高于SeV而被选中^M（M）在LLC-MK2细胞中，发现其积累的病毒蛋白和mRNA约为SeV的20倍^M（M）-感染细胞（参考16和数据未显示）。在BF细胞中，完全具有干扰素活性的细胞系（即分泌干扰素以应对病毒感染并通过建立抗病毒状态对干扰素作出反应的细胞系[36]); 然而，SeV^M（M）实际上比SeV生长得稍好（三到五倍）^MVC公司根据病毒蛋白质或基因组的细胞内水平估计（图。​（图2A2A至D，车道1、3和4）。检查干扰素是否参与这种逆转的SeV^M（M）-SeV公司^MVC公司复制效率，在SeV感染前用100U的IFN-β预处理平行BF培养物24小时，并测定病毒蛋白和基因组的积累。SeV公司^MVC公司被发现对干扰素高度敏感，因为干扰素预处理将病毒产物的积累减少了20倍以上（图。​（图2B2B和D，车道2、5和6）。SeV公司^M（M）相比之下，干扰素的敏感性明显降低，因为干扰素预处理将病毒产物的积累减少了五倍以下（图。​（图2A2A和C车道2、5和6）。

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图2

SeV公司^MVC公司与SeV相比，BF细胞感染^M（M）感染，诱导抗VSV状态。用100 U重组干扰素-β处理（或不处理）BF细胞的平行培养物，24小时后用10到20个SeV PFU感染^M（M）或SeV^MVC公司如图所示，在SeV感染后48小时，每个细胞再感染50个PFU的VSV。第3、4、5、6车道代表独立的重复感染。在53 hpi下采集所有培养物，制备细胞质提取物，并（i）用SDS-PAGE分离相等的样品（直径为10-cm的培养皿的2%），并用抗SeV P和抗SeV N抗体（a和B）的混合物或抗VSV P和抗凝素抗体（E和F）的混合物进行免疫印迹，以及（ii）使用10%直径为10cm的培养皿分离总RNA，并通过引物延伸测定存在的基因组RNA的相对量。SeV N”表示N蛋白的自然分解产物。实验时间表如上所示。

如果内源性生成的干扰素参与逆转的SeV^M（M）-SeV公司^MVC公司感染SeV后BF细胞的复制效率^MVC公司在这种感染期间应该比感染SeV更强烈地诱导一般的抗病毒状态^M（M）弹状病毒VSV对干扰素高度敏感，其在细胞培养中不能生长被认为是这种状态的可靠指标。因此，一些BF培养物在SeV之前用IFN-β预处理24小时^M（M）或SeV^MVC公司感染，然后在感染后48小时再次感染VSV（hpi）。我们发现48小时的SeV^MVC公司感染足以防止VSV蛋白在VSV重叠感染期间积累，即使这些培养物未经IFN预处理（图。​（图2F，2F、 车道3至6）。相反，在感染SeV的细胞的重叠感染期间，VSV蛋白正常积累^M（M）48小时（图。​（图2E，2E、 车道3和4）。因此，BF细胞感染SeV^MVC公司诱导抗VSV状态（24至48小时后[数据未显示]），而SeV感染^M（M）即使在72 hpi（未显示数据）下也不会诱发这种状态。在本文报道的所有实验中，重叠感染时VSV P蛋白正常水平的出现与强烈的细胞病变效应和细胞死亡相关，而VSV P蛋白的缺失与细胞病变效应和细胞存活的缺失相关。

SeV公司^M（M）感染，但不是SeV感染^MVC公司，干扰IFN介导的抗病毒状态诱导。

SeV后无抗VSV状态^M（M）感染可能是因为SeV^M（M）避免触发IFN系统。或者，SeV^M（M）感染可能会干扰抗病毒状态的建立，即使它不会抑制干扰素预处理24小时诱导的抗VSV状态（图。​（图2E，2E、 车道5和6）。因此，在BF培养物被感染的同时用干扰素进行处理，这样干扰素介导的抗病毒状态诱导将与SeV感染同时发生，而不是像图中那样提前24小时开始。​图2。2这些培养物在SeV感染后50 h再次感染VSV，并在55 hpi通过免疫印迹法测定VSV（和SeV）蛋白的积累。还通过免疫印迹法测定了这些提取物中91-kDa Stat1α和84-kDa-Stat1β蛋白的细胞内水平。Stat1是伴随干扰素受体激活的信号级联的关键组成部分(6,9,26)，其高表达导致程序性细胞死亡（PCD），这是病毒感染的另一种细胞反应(三,20,29).

如图所示。​图3，三，感染SeV 50小时^M（M）（第7和第8道）并没有阻止VSV P蛋白在VSV重叠感染时正常积累（第3道），也没有使Stat1水平高于背景水平。此外，根据VSV P蛋白的正常细胞内积累判断，这种感染完全阻止了IFN诱导抗VSV状态。相反，SeV感染50小时^MVC公司即使在没有干扰素治疗的情况下，（9号和10号通道）也会强烈诱导抗VSV状态，Stat1水平显著增加（高达100倍）。SeV公司^M（M）因此，感染似乎干扰了IFN介导的抗病毒状态的建立，以及Stat1的高表达。

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图3

SeV公司^M（M）、rSeV^Z-C类^M（M）和rSeV^Z-C类^Z与SeV相比，BF细胞感染^MVC公司和rSeV^Z-C类^MVC公司感染，干扰IFN介导的抗VSV状态诱导。用100 U IFN-β处理（或不处理）并行培养的BF细胞，同时用10到20个rSeV PFU感染^Z-C类^Z（Z） 、SeV^M（M）（M） 、SeV^MVC公司（MVC）、rSeV^Z-C类^M（M）（rM）或rSeV^Z-C类^MVC公司（rMVC）每细胞，然后在SeV感染后50小时每细胞再感染50个PFU的VSV，如上所示。在55 hpi时采集所有培养物，制备细胞质提取物，用SDS-PAGE分离等量样品（一个培养皿的2%），并用抗VSV P、抗Stat1和抗ctin抗体的混合物（顶面）或抗SeV P和抗SeV N抗体的混合物进行免疫印迹（底面）。实验的时间线如上图所示。

8月¹¹⁴-启动的C蛋白是对抗干扰素所必需的。

SeV C蛋白表达为四种蛋白（C′、C、Y1和Y2）的嵌套集合，由多种核糖体体操在不同的起始密码子启动，包括使用非AUG密码子、漏扫描和分流(5,23). 我们之前描述过rSeV菌株，由于其各自起始密码子的突变，它们选择性地不表达其C′、C′或C′和C蛋白（双突变）。C′的表型⁻和C⁻病毒是相似的。它们在鸡蛋中的生长稍逊于野生型病毒，并且它们感染BHK细胞时过度积累了病毒大分子，这与C′或C（但不是Y1和Y2）抑制病毒RNA合成的能力一致(4). 尽管在卵子和细胞培养中有这些相似的表型，C′⁻该病毒和rSeV一样致命^Z对于小鼠，而C⁻病毒是无毒的。与单个突变体相比，双突变体在细胞培养中相对无细胞病变（并表现出小塑性表型），在测试的最高剂量下也无毒(22).

图​图44与rSeV相比，rSeV感染对Stat1水平没有选择性表达其C′或C蛋白的菌株和随后的VSV重叠感染的影响^Z-C类^M（M）和rSeV^Z-C类^MVC公司.仅C′⁻表现得像其野生型对照（rSeV^Z)（车道1和2）。50小时C′⁻感染（通道9和10）没有诱导抗VSV状态（通道9），也阻止了IFN治疗的效果（通道10），Stat1蛋白水平没有高于背景水平（通道9或10）。C类⁻相反，感染（第7和第8道）和双突变感染（第11和第12道）在更大程度上（至少部分）诱导了抗VSV状态，并且Stat1水平显著高于背景水平。因此，AUG¹¹⁴-首先需要启动的C蛋白（但不是C′、Y1或Y2）来防止SeV感染在细胞培养中诱导IFN系统，这与其在小鼠呼吸道持续病毒复制的特定要求一致(22).

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图4

（a） SeV P基因的ORF组织和表达。以蛋白质（P、C和V）表示的三个ORF显示为水平框，大致按比例绘制（如上）。中间显示了mRNA 5′端的展开图，并指出了该区域的五个核糖体起始位点。显示了用于消除C′和C蛋白起始密码子表达的突变。数字是指从mRNA的5′端到起始密码子的第一个碱基的位置。（b） 8月¹¹⁴-首先需要启动的C蛋白来阻止IFN介导的抗病毒状态诱导。用100 U IFN-β处理（或不处理）并行培养的BF细胞，同时用5个rSeV PFU感染^Z-C类^Z（rZ；车道1和2），rSeV^Z-C类^M（M）（rM；车道3和4），rSeV^Z-C类^MVC公司（rMVC；车道5和6），rSeV^Z-[中]⁻]（C⊝；泳道7和8），rSeV^Z-[C′⁻]（C′⊝；车道9和10）或rSeV^Z-【C′/C】⁻]（dm[双突变体]；第11和12道）。如上所述，在SeV感染后50小时，培养物每细胞被50个PFU的VSV重叠感染。所有培养物均在55 hpi时收获。制备细胞质提取物，用SDS-PAGE分离等量样品（一个皿的2%），并用抗VSV P、抗Stat1和抗凝集素抗体（a）的混合物进行免疫印迹；抗SeV P和抗SeV N抗体的混合物（B）；或针对SeV C蛋白（C）的抗体。在面板C中，注意C^M（M）蛋白质（通道3和通道4）的迁移速度略慢于C^Z蛋白质（通道1和通道2以及通道7到通道10），尽管它们的长度相同。C类^MVC公司（车道5和6）和C^糖尿病这些样本中没有检测到蛋白质（11和12道），因为这些病毒在BF细胞中生长相对较差（B）。实验时间表如上所示。

抑制干扰素介导的抗VSV状态占主导地位。

尽管SeV^MVC公司生长约为SeV的20倍^M（M）在MK2细胞中，这种病毒的生长速度实际上比SeV慢约5倍^M（M）在卵子（以及BF细胞）中，这些相对复制效率也适用于rSeV^Z-C类^MVC公司与rSeV相比^Z-C类^M（M）我们所有的rSeV菌株都是在鸡蛋中分离的，并且通常使用第2或第3代水平（p2或p3）的库存来感染细胞培养物。六个rSeV^Z-C类^MVC公司股票最初是从DNA中独立分离出来的，所有股票的表现都如图所示（图。​（图3）三)在鸡蛋中生长相对较差。然而，随着时间的推移，一些rSeV^Z-C类^MVC公司股票的增长明显好于其他股票（5至10倍）。因为F170S突变明显降低了鸡蛋的生长速度（以及Xmn公司I位点），扩增并检测了两个生长良好（p4MVC-118和p5MVC-1.8）和两个生长不良（p4MFC-119和p3MVC-9.9）的病毒基因组的相关区域（图。​（图5）。5). 同时，将BF细胞感染相同的库存，并在48 hpi时再次感染VSV，以确定这些库存的感染是否继续诱导抗VSV状态。

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图5

rSeV的逆转^Z-C类^MVC公司至rSeV^Z-C类^M（M）通过母鸡蛋中的通道。四个独立生成的rSeV^Z-C类^MVC公司库存，包括两个在鸡蛋中继续生长不良的库存（MVC.119和MVC.9.9；泳道3和4）和两个在鸡蛋中开始正常生长的库存（MVC.118和MVC.1.8；泳道2和7），以及两个rSeV库存^Z-C类^Z（车道1和5）和rSeV之一^Z-C类^M（M）（M1.8；通道6），在所示的卵传代水平上，用于感染MOI为10至20的BF培养物。在SeV感染后50 h，培养物被VSV重叠感染，并通过免疫印迹法（A）测定55 hpi时细胞内VSV P蛋白的相对量。从尿囊液中分离出RNA，以及病毒基因组相关区域（T/C）的1237 bp²³⁵⁴)通过逆转录PCR扩增，如下所示。PCR产物用Xmn公司一、 在琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭（B）染色。

如图所示。​图5，5，这两个继续增长缓慢的种群（第3和第4道）包含基因组，其中Xmn公司I位点仍然缺失（Ser位于位置170），感染这些病毒48小时后，继续强烈阻止随后的VSV增长。相比之下，（i）生长良好的两个种群（第2和第7道）包含的基因组恢复了Xmn公司I站点，因此在位置170处恢复为Phe，以及该站点不存在的站点（170S），并且（ii）这些库存已失去阻止VSV增长的能力，如rSeV^Z-C类^M（M）（第6车道）。不能表达NS1蛋白的流感病毒在鸡蛋中生长不良，因为它们对鸡蛋中正在发育的干扰素系统更敏感(10). 如果SeV也对鸡蛋的IFN系统敏感，那么选择具有恢复的抑制IFN作用能力的突变体将是有压力的。因为S170F逆转只需要一个反向转换，所以在卵细胞中传代数代后就会出现。

图中的感染。​图55在10到20个PFU/细胞下进行，感染p4MVC-118或p5MVC-1.8的培养物将因此与rSeV混合感染^Z-C类^MVC公司和回复子rSeV^Z-C类^M（M）在这两种混合感染（以及其他重组混合感染[数据未显示]）中，回复子rSeV的表型^Z-C类^M（M）比rSeV占优势^Z-C类^MVC公司并且未诱导抗病毒状态（即rSeV未阻止VSV复制^Z-C类^MVC公司共同感染）。在混合感染中抑制干扰素介导的抗VSV状态的主要性质与这种抑制是一个活跃的过程相一致。

讨论

为了维持其对小鼠呼吸道的感染，SeV必须避免或抵消其动物宿主的固有免疫反应，包括自然杀伤细胞、IFN系统和PCD。最致命的病毒株，如SeV^M（M），在这些对策中必须非常有效，因为它们只需要约40个PFU即可杀死半数经鼻接种的小鼠。SeV公司^MVC公司，一辆SeV^M（M）然而，只有两个氨基酸替换（一个在C基因中，另一个在病毒聚合酶催化亚单位[L]中）的突变似乎对小鼠的先天免疫系统几乎没有防御能力，因为肺部滴度只在感染的第一天增加，然后病毒会很快被清除(16). 此外，对感染rSeV的小鼠也发现了类似的结果^Z-C类^MVC公司，一种含有突变SeV的嵌合Z株病毒^MVC公司C基因或rSeV^Z-[中]⁻]，包含野生型C基因，但不表达AUG¹¹⁴-启动的C蛋白。因此，SeV C基因在其动物宿主感染中起着关键作用，可能是通过抵消先天免疫。

Itoh等人(17)最近发现SeV^M（M）感染不会在MK2细胞或小鼠呼吸道中诱导PCD，而SeV^MVC公司在这两种情况下，感染都是高度凋亡的。目前的工作发现SeV^M（M）感染干扰IFN介导的抗病毒状态诱导，与SeV形成强烈对比^MVC公司.SeV可能^M（M）感染通过不同的途径抵消PCD的诱导和IFN的抗病毒作用，但这些作用更有可能是相互关联的。缺乏PKR的小鼠细胞(35)或2-5A-寡腺苷酸合成酶依赖的RNase L(37)显示PCD缺陷，表明这些酶在病毒诱导的IFN介导的PCD中发挥作用。此外，最近发现几种病毒通过激活干扰素系统诱导PCD(31). Stat1蛋白本身也诱导PCD相关基因(三,20,29)、和SeV^MVC公司感染可能是高度凋亡的，因为它诱导高水平的Stat1。

对干扰素产生抗病毒反应的分子基础尚不完全清楚。IFN-α/β诱导了50多个基因，但这些基因产物中只有少数显示出固有的抗病毒活性，即p68蛋白激酶（PKR）和2-5A寡腺苷酸合成酶（均依赖于双链RNA的活性）(18)，某些Mx家族蛋白（参考文献综述30)以及最近的早幼粒细胞白血病（PML）蛋白(2). 虽然干扰素处理的细胞对许多不同的病毒具有耐药性，但这些固有抗病毒蛋白的个别过度表达只能对某些病毒产生耐药性。因此，PKR或2-5A寡腺苷酸合成酶的过表达赋予了对小核糖核酸病毒脑心肌炎病毒（EMCV）的抗性，但对弹状病毒VSV没有抗性，而人MxA或PML蛋白的过表达赋予了对VSV的抗性，但对EMCV没有抗性(2). 病毒施加的巨大选择压力产生了丰富多样的抗病毒途径，因此通过干扰素系统诱导的抗病毒状态非常复杂。我们使用了两个标准，即在SeV感染一段时间后VSV复制的能力和Stat1蛋白的细胞内水平，作为这种细胞抗病毒状态的指标。我们发现C基因中的两种不同突变，F170S替代和AUG的特异性丢失¹¹⁴-启动的C蛋白（尽管C′正常表达，Y1和Y2蛋白过度表达）在很大程度上消除了突变感染阻止IFN介导的抗病毒状态的能力。因此，SeV C基因在这一过程中起着关键作用。SeV L基因E2050A突变^MVC公司似乎也参与了该病毒的衰减，因为SeV的表型^MVC公司始终强于rSeV^Z-C类^MVC公司尤其是防止Stat1蛋白升高，从而消除PCD诱导的一条途径。

在审查本论文时，Didcock等人(第8页a)报告SeV菌株H（SeV^H（H），与SeV非常相似^Z)通过干扰IFN应答基因的转录激活来规避IFN应答。本研究仅使用野生型SeV^H（H）和另一种副粘病毒SV5。然而，它直接检测BF细胞中的IFN信号传导，使用质粒的瞬时转染，其中荧光素酶报告基因置于IFN-α/β响应启动子（或IFN-β启动子）的控制下，然后感染病毒。经IFN处理的模拟和SV5感染细胞中均发现IFN-α/β应答启动子被强烈激活，而在SeV感染细胞中观察到该启动子几乎没有激活。相反，与SV5相比，SeV是IFN-β启动子更强的诱导剂。这些作者得出结论，SeV的失败^H（H）-感染细胞对其产生的大量IFN-α/β产生反应是由于SeV的有效性^H（H）-诱导阻滞。SeV公司^M（M）和SeV^MVC公司人类外周血单个核细胞感染可产生等量（且大量）的IFN-α（M为3395 IU/ml，MVC为3776 IU/ml）(13亿). 因此，所有这些野生型SeV毒株（毒株M、Z和H）都可能通过干扰IFN刺激基因的激活来对抗IFN诱导的抗病毒状态。

rSeV的主导性质^Z-C类^M（M）与rSeV相比^Z-C类^MVC公司在卵子的共同感染中（图。​（图5）5)而BF细胞[数据未显示]表明，C基因积极干扰抗病毒状态的诱导，而不是简单地避免诱导，尽管它也可能做到这一点。我们还没有研究C基因产物是否可以在不受病毒感染的BF细胞中发挥作用。C蛋白很可能直接（并抑制）导致抗病毒状态的信号通路的某些成分，因为已知许多病毒通过多种机制破坏干扰素系统(30). 聚合酶L的明显增强作用^E2050A型带有C的病毒的突变^F170S型（SeV^MVC公司)然而，这表明C蛋白也通过病毒RNA合成发挥作用。C很适合这样做。线性副粘病毒基因组和抗原组在其3′端含有RNA合成的启动子。C蛋白以启动子特异的方式抑制病毒RNA合成(1,32); 即，它主要抑制来自基因组启动子的抗原组和mRNA合成。这种抑制作用取决于C蛋白与基因组的相对比率，在感染的早期阶段会急剧增加，因为C蛋白本质上是一种非结构蛋白。

已知SeV V蛋白也会影响病毒RNA的合成(3a年). 然而，与rSeV-[C相比⁻]两种不同的rSeV株感染BF细胞，它们不能编辑P基因mRNA，也不表达V（Δ6A）[7]和A5G3[第13页])与野生型病毒相似。这些rSeV-[编辑⁻]感染并没有诱导抗VSV状态，他们继续阻止IFN（与感染同时添加）诱导抗VSV-状态（数据未显示）。因此，SeV V蛋白在对抗干扰素作用方面似乎并不重要，尽管人们认为它也在对抗先天免疫的某些方面发挥作用(19). SeV C和V蛋白被称为“辅助”蛋白，因为它们并非所有副粘病毒都表达。例如，与SeV最接近的人类副流感病毒1型是一种非常成功的儿童寄生虫，它根本不包含V开放阅读框（ORF）(25)和卢布拉病毒（新城疫病毒除外）不含C ORF。重叠的C和V ORF似乎是作为病毒进化的晚期事件添加到P ORF中的，可能是为了使这些病毒适应特定的生态位（例如，小鼠呼吸道）。V基因明显符合这一描述，提供了“奢侈”功能(19)，因为不表达V的rSeV菌株完全能够在细胞培养物或卵子中生长，并且只能在小鼠呼吸道中生长(7,8,19).

C基因比V基因更复杂。有四种独立启动的C蛋白，其中C′和C被特异性消融的病毒的表型表明，各种C蛋白至少部分具有非重叠功能。虽然不能单独表达C′或C的rSeV菌株在（干扰素缺乏型）BHK细胞中生长良好，积累病毒大分子的速度比野生型病毒快，但双突变体（既不能表达C′也不能表达C）在BHK细胞生长不良，积累的病毒大分子相对野生型病毒具有延迟动力学。C′和C（但不是Y1或Y2）可能提供一种共同的功能，加速病毒产物在细胞内的积累，因此只有双突变体显示功能丧失表型(22). C′和C似乎也具有非重叠功能，因为尽管C或Y1和Y2可以代替C′在小鼠中的毒力，但C′或Y1及Y2不能代替C′的这一特性(22). Y1和Y2可能也在细胞内病毒复制中发挥作用，因为尚未分离出不能表达其任何C蛋白的rSeV菌株(22)而那些最多只表达一些Y2蛋白的细胞则处于从DNA中恢复的极限(21,23). 与V基因不同，SeV C基因显然在细胞内病毒复制中起着重要作用，即使在培养的无防御细胞的保护环境中也是如此。最初可能是一种奢侈的功能，现在可能已经演变成在病毒复制中执行基本功能。然后，多种形式的C蛋白表达可能进化为更好地调节其功能。

致谢

参考文献