流感病毒血凝素的构象中间体及其融合活性

摘要

流感病毒与靶膜的融合是由流感病毒的主要刺突膜糖蛋白血凝素（HA）介导的。HA在病毒膜中组织为同源三聚体；每个单体由两个二硫键亚基HA1和HA2组成。HA介导的融合由酸性pH值触发，将HA转化为融合构象。在过去几年中，我们探讨了病毒包膜糖蛋白在被触发促进融合时的构象变化(27). 流感病毒中性HA的X射线晶体学研究(37)和HA2碎片(9)，Moloney小鼠白血病病毒的跨膜（TM）亚单位(16)和来自人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的gp41核心(11,35)在这个地形上提供明确的地标。这些研究提出病毒膜融合蛋白存在天然（非融合）和融合活性（融合）状态。我们的构象探索揭示了天然状态和融合状态之间的一些状态，其中一些状态转变为失活状态。有趣的是，这种构象转变在流感病毒HA中是不可逆的，在水泡性口炎病毒G中是可逆的(26). 我们的目的是详细检查这些构象，并将其与流感病毒HA的融合活性状态联系起来。

在本研究中，我们研究了不同HA亚型流感病毒株（H1[A/PR8/34]、H2[A/Japan/305/57]和H3[X31]）的低H预培养对病毒融合活性的影响。之前，我们已经证明，在37°C和pH 5.0条件下，由X31和A/Japan HA介导的融合以相似的速度进行。然而，在这些条件下，在没有靶膜的情况下，病毒的预培养导致X31 HA失活，而A/日本HA未受影响(27). 我们证实，融合活性的特征和抗失活过程的稳定性对于每个菌株来说都是典型的。然而，A/Japan和X31在次优pH值和37°C下的预培养并没有导致失活，而是导致融合级联中形成构象中间体。

材料和方法

融合分析。

通过监测脂样荧光团R的荧光去猝灭（FDQ）来测量融合₁₈R融合后₁₈-用鬼膜标记病毒(18). 在预先调节的温度和相应的pH值（pH 4.5至7.4）下，将30μl冰镇病毒宿主悬浮液转移到含有1.8 ml醋酸钠或PBS缓冲液的石英试管中，从而触发融合。使用涂有2×8 mm特氟隆的磁力搅拌棒连续搅拌悬浮液。通过测量FDQ（λ_前任=560纳米；λ_{相对长度单位}=590纳米；截止滤波器，570 nm），时间分辨率为0.5 s，配备AMINCO Bowman II或岛津RF5001 PC荧光光谱仪。在每个实验结束时，添加Triton X-100（最终浓度，0.5%）以获得最大R₁₈荧光，F类（最大值）。FDQ的百分比如前所述计算(5):

哪里F类（0）和F类(t吨)是开始融合前的荧光强度和给定时间的荧光强度，t吨分别是。

融合数据分析。

为了比较与范围无关的FDQ曲线动力学，表观速率常数，k个_FDQ公司，通过关联初始速率（IR_FDQ公司)FDQ（FDQ）的最大范围_最大值):

红外_FDQ公司指FDQ曲线一阶导数的最大值，由Jandel Scientific的TableCurve软件通过Savitzky-Glay-算法获得：

bis-ANS数据分析。

根据测得的双-ANS荧光强度图(我)反时限(t吨)，相对荧光，我_相对，已计算

1

哪里我（0）是双ANS在水溶液中的荧光强度，以及我（pH 7.4，max）是在pH 7.4的条件下，病毒存在时双-ANS荧光的最终程度。

结果

在不同pH值下通过预培养进行灭活。

以人红细胞鬼膜为靶点，研究了低氢预培养（pH值为5.4至5.0）对不同流感病毒株融合能力的灭活作用。选择了三种不同的亚型：A/PR 8/34（H1亚型）、A/Japan/305/57（H2）和X31（H3）。用脂质样荧光团R的FDQ分析评估HA介导的融合₁₈最初并入病毒膜。如前所示，在没有低氢预培养的情况下，所有三种病毒在37°C的选定pH值为5.0至5.4的条件下，与红细胞膜表现出显著的融合活性(21). 融合速度和融合程度在pH值5.0左右时达到最大。然而，对于所有病毒，即使在pH值为5.4时，在降低pH值后的前10分钟内观察到显著融合(21).

为了比较在不同pH值下预培养的失活程度，将低H预处理的病毒重新中和到pH 7.4，并在4°C下与红细胞鬼影结合30分钟。随后，在pH 5.0和37°C下测量融合。我们之前已经证明，在这些条件下，完整病毒完全融合，即脂质、HA和RNA的重新分布(24). 在图中。​图1，1显示了病毒在pH 5.0、5.2和5.4下预培养不同时间后的融合速率常数（pH 5.0和37°C）。速率常数是从FDQ动力学的最陡部分推导出来的。为了比较不同菌株之间的结果，我们将数据归一化为相应的对照组（设置为100%），对应于pH 5.0和37°C下的融合，而无需在低pH下预培养病毒。

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图1

在pH 5.0和37°C的醋酸钠缓冲液中，低氢预培养对流感病毒宿主融合速率常数的影响。（A） 流感病毒X31；（B） A/Japan/305/57；（C） A/PR 8/34。R的预孵育₁₈-标记的流感病毒是在低pH（●，pH 5.0；■, pH值5.2；▾, pH值5.4）和37°C，在没有目标膜的情况下达到指定时间。随后，将病毒样本重新中和（pH 7.4），并在冰上结合鬼膜30分钟，如文中所述。结合后，在pH 5.0和37°C下通过R的荧光去淬测定融合₁₈为了比较不同菌株之间的结果，我们将速率常数归一化为对照组的速率常数（设置为100%），对应于pH 5.0和37°C下的融合，而无需在低pH下预培养病毒。在560和590 nm的激发和发射波长下测量荧光，分别（时间分辨率，0.5 s）。注意预孵育时间的不同比例。

如图所示。​图1，1流感病毒低H预培养的影响在很大程度上取决于病毒株以及所选的pH值。在pH值5.0时，可以观察到最快速和最广泛的融合(21)X31的融合活性迅速消失。在pH 5.0的预培养10分钟内，融合的速率常数降低了70%以上（图。​（图1A）。1A） ●●●●。与X31相比，在pH 5.0下A/Japan的失活进行得相当缓慢（图。​（图1B），1B） 与Puri等人之前的结果一致(27).

对于X31和A/日本，当预培养在稍高的pH值下进行时，低H灭活显著减少，甚至取消（图。​（图1A1A和B）。速率常数，k个_FDQ公司在pH 5.2下预孵育后，X31的下降速度慢得多（图。​（图1A）。1A） ●●●●。值得注意的是，分别在pH 5.4下预培养A/Japan和X31后，我们观察到速率常数增加。即使在pH 5.2下进行短暂的预培养后，也发现A/日本存在这种情况（图。​（图11B） ●●●●。

预培养的pH值对融合程度也有类似影响(21). 对于X31，在pH 5.0和37°C下预培养10分钟内，观察到融合程度迅速下降约70%。在这些条件下，A/日本只会缓慢失活；预孵45min后，程度下降约50%。当预孵育的pH值升高时，灭活作用被取消的现象再次明显。在pH 5.4和37°C下预培养90分钟不会影响X31的融合程度。与对照组相比，A/Japan在pH 5.4和37°C下的长时间预培养导致融合程度增加了20%-40%（无预培养）。

对于A/PR 8/34，即使在pH 5.4下预培养后，失活也非常迅速。根据常数推断，在5分钟内，融合活性几乎完全丧失k个_FDQ公司（图。​（图1C）1C） 以及融合的程度(21).

低氢灭活的温度依赖性。

当在较低温度下在pH值5.0下进行预培养时，X31和A/Japan的低H灭活率都显著降低。融合速率常数和融合程度的下降（图。​（图2）2)在20°C和pH 5.0下预培养后显著减速。A/日本的速率常数甚至没有受到影响。相反，对于A/PR 8/34，我们仍然观察到通过在20°C下预培养快速消除融合活性（图。​（图3）。三). 只有在将预培养温度降至约3°C后，我们才发现灭活过程显著减少。

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图2

流感病毒X31（■）和A/Japan/305/57（▾）在pH 5.0和20°C下预培养对醋酸钠缓冲液中pH 5.0和37°C下病毒-宿主融合的速率常数（A）和范围（B）的影响。在pH 5.0和20°C下，在没有靶膜的情况下，对流感病毒进行指定时间的预培养。随后，将病毒样本重新中和（pH 7.4），并在冰上结合鬼膜，如文中所述。结合后，在pH 5.0和37°C下测量融合。为了比较不同菌株之间的结果，我们将数据归一化为对照组（设置为100%），对应于pH 5.0和37°C下的融合，而没有在低pH下预先培养病毒。

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图3

温度对流感病毒A/PR 8/34低H灭活的影响，以及对醋酸钠缓冲液中pH 5.0和37°C下病毒-宿主融合的速率常数（A）和范围（B）的影响。在pH 5.0和3°C（▾）、20°C（■）和37°C（●）下，在没有靶膜的情况下，对流感病毒进行指定时间的预培养。随后，将病毒样本重新中和（pH 7.4），并在冰上结合鬼膜，如文中所述。结合后，在pH 5.0和37°C下测量融合。为了比较不同菌株之间的结果，我们将数据归一化为对照组（设置为100%），对应于pH 5.0和37°C下的融合，而没有在低pH下预先培养病毒。

双ANS与流感病毒的结合。

病毒融合蛋白和靶膜之间的疏水相互作用似乎对融合事件的启动至关重要。我们已经证明，HA外结构域的结构改变导致疏水序列的暴露，可以通过疏水性敏感染料bis-ANS连续监测(20). 水溶性荧光团双-ANS与疏水性位点（例如蛋白质的疏水性位点）结合后，量子效率显著提高。我们发现，在低pH条件下，流感病毒a/PR 8/34存在时，bis-ANS的荧光强烈增强，其pH依赖性与病毒融合活性非常相似。酶法去除HA的外结构域后，在低pH条件下，bis-ANS的荧光没有增加(20)或具有未分离HA（HA0）的病毒(第21页). 我们的数据表明，除了HA2的疏水性N末端外，外结构域的其他疏水性序列也可被双-ANS所访问。另一方面，低氢诱导的流感病毒灭活与几个HA三聚体的聚集有关，这可能是由疏水性相互作用决定的。为了阐明HA的疏水性是否也与病毒株特异性的融合性失活有关，我们研究了三种毒株在分离HA玫瑰花结存在的情况下，双-ANS荧光的pH依赖性。

在图中。​图4A，4A、 显示了在不同pH值下，A/PR 8/34中HA存在下双-ANS荧光的动力学（未显示X31和A/日本的数据）。在时间零点，将HA添加到所需pH的预热缓冲液（37°C）中。荧光强度与pH 7.4时的最大控制范围有关(我_相对). 在酸性pH下，双-ANS荧光迅速增强。双-ANS与HA的结合导致荧光光谱发生强烈的蓝移。在HA存在下，荧光最大波长从510 nm（水）转移到约485 nm（数据未显示）。在图中。​图4B，4B、 给出了三种病毒株在HA存在下双ANS荧光的最终范围。实验在相同的HA浓度下进行。双-ANS荧光范围的pH依赖性与融合活性的pH依赖关系一致（图。​（图4C）。4C） ●●●●。

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图4

存在分离HA时双ANS荧光的pH依赖性以及不同亚型流感病毒（37°C）的病毒-宿主融合程度。（A） A/PR 8/34 HA存在下双-ANS荧光动力学（X31和A/Japan/305/57的数据未显示）。在时间零点，将HA（4μg/ml）添加到含有3.25 nmol bis-ANS/ml的缓冲液（37°C）中。分别在400 nm和490 nm的激发和发射波长下测量荧光（时间分辨率，0.5 s）。相对荧光，我_相对，如图所示（参见材料和方法）。（B） 相对荧光的最大值，我_相对，在所需pH下孵育10分钟后的双ANS。（C）病毒重影融合。在指示的pH值和37°C下，通过FDQ分析和脂样荧光团R测定融合20分钟₁₈（参见图的图例。​图1）。1). ▾, A/Japan/305/57；■, X31；●, A/PR 8/34。（插入面板B）在存在A/PR 8/34（●）或完整A/PR 9/34（○）的分离HA的情况下，双-ANS荧光的比较。在存在完整病毒（20μg病毒蛋白/ml）的情况下测量双-ANS的荧光，如分离HA所述。

对于这三个菌株，对于完整的病毒和分离HA的玫瑰花结，双ANS荧光范围的pH依赖性非常相似，如A/PR 8/34所示（插图见图。​图4B）。4B） ●●●●。以下方面的数量差异我_相对在分离的HA和完整的病毒之间，主要是因为bis-ANS与病毒膜脂相的结合大大提高了pH 7.4时的荧光强度(20). 因此，对于完整的病毒，双ANS在低pH下的HA相关荧光被低估了我_相对关于孤立HA。我们不能排除这些差异我_相对至少部分原因是HA在病毒中的紧密堆积。由于这种包装，在降低pH值时，相邻HA的快速疏水相互作用限制了双-ANS的结合数量。因此，为了确保不同流感毒株之间进行比较时HA浓度相同，测量了分离HA的双-ANS荧光。

在pH值5.0时，双-ANS荧光的范围为X31>A/PR 8/34>A/Japan。在pH>5.0时，X31的荧光强度急剧下降，而a/PR 8/34的荧光强度下降更平稳。因此，例如，在pH值5.4时，来自A/PR 8/34的HA的双-ANS荧光是来自其他两个菌株的HA的两倍。

图中显示了各种病毒株在pH 5.0条件下存在分离HA时双ANS荧光的温度依赖性。​图5。5在所有温度下，A/日本的荧光强度最低。在37至20°C之间，观察到X31的荧光强度急剧下降，而A/PR 8/34的下降更为缓慢。事实上，即使在10°C下，在a/PR 8/34中的HA存在下，也检测到了相当高的双-ANS荧光发射（是a/Japan和X31的两倍）。

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图5

双-ANS荧光的温度依赖性，我_规范在pH 5.0条件下，存在不同流感病毒亚型的HA（4μg/ml）。▾, A/Japan/305/57；■, X31；●, A/PR 8/34。相对荧光的最大值，我_相对如图所示，在pH 5.0和所需温度下培养10分钟后，双-ANS（3.25 nmol/ml）。有关详细信息，请参阅图的图例。​图44材料和方法。

我们研究了在HA（A/Japan）存在下，双-ANS的荧光增强在重新中和到pH 7.4后是否可逆。我们发现可逆性的程度取决于pH以及在该pH下预培养的时间（图。​（图6）。6). 即使在长时间的预培养后，在pH 5.4下荧光的增加几乎是完全可逆的。当A/日本HA在pH 5.2下预培养时，监测到双-ANS荧光可逆性的缓慢持续损失。然而，在pH值5.0时，大量双-ANS荧光迅速变得不可逆。

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图6

在A/Japan/305/57（4μg/ml）HA存在下，双-ANS低H荧光的可逆性。HA在pH 5.0（▾）、pH 5.2（▴）或pH 5.4（■）下预培养后，在pH 7.4下测量15分钟的荧光，我_相对（参见材料和方法中的方程式1；我(t吨)对应于中和后的荧光强度）。所有步骤均在37°C下完成。bis-ANS的浓度为3.25 nmol/ml。有关详细信息，请参阅图的图例。​图44材料和方法。

讨论

本研究中考虑的三种流感病毒HA亚型在诱导膜融合的能力方面表现出相似的特征，但在灭活敏感性方面有所不同。A/Japan（H2亚型）的失活程度最低，与之前的结果一致(27)，并取决于预培养的pH值。虽然在37°C、对应于融合最大值（约pH 5.0）的pH值下观察到X31和A/Japan的显著失活，但在预培养pH值高0.2至0.4个单位的情况下未观察到失活。令人惊讶的是，在这些条件下的低氢预培养增强了HA的融合特性，导致A/日本和X31的融合率和融合程度增加。对于A/PR 8/34，pH值的变化（大于5.0）或温度的降低（小于20°C）都不足以防止失活。

最近，我们比较了X31和A/日本HA在pH5和37°C下暴露15分钟后的构象变化(27). 在这些条件下，A/Japan HA的穗部形态并没有变化，而X31 HA则呈现出模糊的外观。然而，pH5-和37°C处理的A/日本HA经历了构象变化，表现为疏水性增加、抗体表位暴露和对蛋白酶消化的敏感性。此外，pH5-和37°C处理的A/Japan HA仍具有融合活性，而同样处理的X31则没有活性。基于这些观察结果，我们提出了一个三态模型，该模型将HA的构象转变与病毒融合机制联系起来(6). 根据该模型，HA经历了质子驱动的转变，从中性pH下的T（紧张）状态转变为保持HA三聚体典型尖峰形态的状态。这种相对于T态放松的亚稳态被称为R。R态之后是向D（脱敏）态的过渡，其模糊形态学是其特征。我们认为，pH5-和37°C处理的A/日本HA的构象对应于R状态，而pH5-和37°C-处理的X31 HA的构像对应于D状态。

我们在本研究中的观察结果表明，pH 5.4和37°C处理的X31 HA未失活，但融合活性更强。这表明它可能处于R状态。图​图77显示了分别在37°C和pH 7.4、pH 5.4和pH 5.0下处理的X31的冷冻电子显微镜图像。值得注意的是，pH值为5.4时，在pH值为7.4时观察到的尖峰形态保持不变。只有尖峰的轮廓看起来不像在pH 7.4时那样清晰。然而，这些图像的分辨率不足以更详细地描述这一点。pH 5.4和37°C处理的X31 HA的微小变化的尖峰形态强烈表明其处于R状态。我们注意到，在整个病毒膜上可以看到棘突形态的微小变化，这表明所有HA都经历了向R状态的过渡。pH 5.0和37°C处理的X31 HA的模糊尖峰形态支持其处于D状态的概念。上官等人(33)最近的研究表明，在pH 4.9和30°C下，A/PR/8/34 HA的失活与通过冷冻电子显微镜测定的刺突形态的丧失相关，证实了我们为其他HA菌株提出的R和D状态分配。

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图7

在37°C和pH 7.4（A）、pH 5.3（B）和pH 4.9（C）下培养后，整个流感病毒X31（2 mg/ml）的冷冻电子显微照片。

此前，我们通过近紫外时间分辨圆二色谱（CD）连续监测了HA三级结构在酸性pH下的瞬态阶段(21). 酸化后，最初形成HA的一种可融合的中间体，其特征是重排，但不会失去三级结构。随后，我们观察到三级结构持续丢失。通过次优pH值（pH值5.4）或更低温度（20°C）动态稳定融合态。这两种状态可以分别指定为R和D状态，与低温电子显微镜图像一致。虽然我们的CD测量表明R态的形成伴随着三级结构的改变，但它们并没有提供明确的证据证明所有HA都经历了转变。然而，HA的差示扫描量热法表明，所有HA在给定的pH值和特征转变温度下都经历了热转变T型_米和焓H（H）_卡尔在pH 7.4、5.4和5.0时，分别为66.5°C和980 kcal/mol、45.1°C和204 kcal/mol以及41.8°C和73 kcal/mol(第22页). 跃迁的锐度表明，在给定的pH值下，所有HA都具有给定的构象，这与我们从低温电子显微镜（见上文）得出的结论一致。

我们发现由双-ANS结合推导出的HA疏水性与流感病毒灭活之间存在关联。与X31和A/PR 8/34 HA相比，A/Japan HA在pH 5.0下预培养灭活的速度较慢。同样，在pH 5.0时，A/Japan HA的疏水性低于X31和A/PR 8/34。在pH 5.4下预培养后，我们观察到X31和A/Japan HA没有失活，但我们观察到A/PR 8/34的融合活性迅速丧失。这与a/PR 8/34的HA的疏水性显著高于其他病毒株相一致。HA疏水性暴露与失活之间的相关性由两个过程的温度依赖性维持。我们发现，对于X31和A/Japan，在20°C下通过pH 5.0预培养进行灭活的速度非常慢，但对于A/PR 8/34，灭活速度很快。双阴离子与HA的结合表明，A/PR8/34的HA的疏水性远高于X31和A/日本的HA。只有在相当低的温度（3°C）下，在pH值5.0下预培养，A/PR 8/34的失活才显著减少。然而，在20°C时，其速度仍高于X31和A/日本的观察结果。这些结果表明HA在低pH下的失活与疏水性之间存在相关性。然而，HA的疏水性并不是失活的唯一决定因素。从pH值5.0和37°C的数据中可以明显看出这一点。虽然双-ANS荧光表明X31的HA疏水性高于a/PR8/34，但后者的灭活速度比X31快。在这种条件下，当HA分子崩解时，X31中可能会暴露出更多的疏水位点。然而，在X31失活的次优条件下（pH 5.4和37°C或pH 5和20°C），A/PR 8/34失活。在这些条件下，我们发现双ANS如下：A/PR 8/34>X31=A/日本（pH 5.4和37°C[图。4B] ）和A/PR 8/34>X31>A/日本（pH值5.0和20°C[图。5]).

HA疏水位点的暴露是流感病毒HA融合活性失活和三级结构丢失的结果还是决定因素？我们的数据支持后一种观点，即在低pH下，双-ANS与A/日本HA结合的可逆性。我们发现，在pH 5.2时，最初的结合几乎是可逆的。虽然荧光和双-ANS与HA的结合程度没有进一步增加（图。​（图6），6)，双-ANS荧光只有在长时间孵育后才变得不可逆。通过在pH 5.2下预培养，观察到A/Japan融合能力的失活具有类似的时间依赖性。只有在长时间的预培养后，我们才发现这种病毒的融合活性降低。HA的融合肽序列(15)是与融合活性相关的疏水位点最初出现的良好候选(34,36). 我们之前已经证明，在酸性pH条件下，双-ANS与融合序列的相互作用会增强。随后与失活相关的双-ANS荧光增强是由额外疏水位点的暴露引起的(10,20)推测在D状态下HA1-HA2三聚体解离后的界面中，与低温电子显微镜图像一致(27). 这种连续的构象变化符合怀特和威尔逊的观察(36)，他使用一组抗体测量了X31 HA菌株构象变化的动力学。他们提出了一个模型，假设低氢介导的构象变化发生在两个主要步骤中。在第一步中，融合肽暴露出来，即使在次优条件下也很快。在第二步中，三聚体的球形头部分离并打开。后一步的一半时间对温度和pH非常敏感。

在以往关于流感病毒HA介导的融合动力学的研究中，我们关注的是构象改变后发生的事件(5,7). 这些研究揭示了融合级联中的许多中间体，包括形成瞬时融合孔、允许脂质重新分布的半融合隔膜和允许溶质转移的大孔。在本研究中，我们考察了构象中间体。低氢引发X31 HA玫瑰花结构象变化的动力学研究进展(21,22)在pH值为5和37°C时，变化非常迅速。我们在本研究中观察到一种构象中间体，这一事实表明，在结合到靶膜的完整病毒中，这些变化可能较慢（甚至速度限制）。论点如下。如果处于T状态的HA与膜结合（T_M（M）)反应方案按照T_M（M）→ R（右）_M（M）→ F（方案1），其中R_M（M）是与膜结合的R态HA，F是融合孔。如果HA首先进入R状态，然后与膜（R）结合_M（M）)，反应方案按照R_M（M）→ F（方案2）。如果方案1的融合率等于方案2的融合率，则T_M（M）→ R（右）_M（M）过渡很快。然而，对于X31和A/Japan HA，我们发现方案1的融合率低于方案2的融合率。这表明T_M（M）→ R（右）_M（M）是这些条件下的速率限制。因此，R_M（M）代表一种构象中间体，即使在中性pH下，该中间体也至少具有动力学稳定性_M（M）形成融合孔的构象需要酸性pH值。因此，R_M（M）是HA承诺状态的上游，我们之前已经确定了HA承诺状态(32). 该中间体的特征是HA（最有可能是HA2）与靶膜的稳定非共价疏水相互作用。即使在中性pH值下，承诺态也可以在高温（37°C）下转化为熔合孔。然而，承诺态的形态尚不清楚。

我们注意到，我们始终在最适合融合的pH值（pH值5.0）下测量流感病毒的融合。我们之前已经证明，未经治疗的流感病毒在这种条件下完全与红细胞膜融合(24). HA和RNA的重新分布都证明了这一点。还有待证明的是，低pH预处理的HA三聚体在建立最佳条件后也能诱导完全融合，因为R₁₈该试验不允许我们区分半融合和完全融合。然而，我们认为，与未经处理的病毒相比，经预处理的病毒的脂质混合速度不太可能更快，但其毛孔扩张速度较慢或根本不存在。

我们能给R指定一个三维结构和功能吗？当然，这里应用的低温电子显微术无法提供足够详细的空间分辨率来阐明R态的三维结构。然而，我们的结果表明，运动稳定的R态对应于一个结构，该结构保留了尖峰形态，但具有不同于T态尖峰的结构安排，即低温电子显微镜、CD和差示扫描量热测量显示的天然劈裂HA（见上文）可能，R为随后HA2的N末端暴露到靶膜上而启动HA。根据X31低氢型HA外结构域片段的X射线晶体结构，Bullough等人(9)表明“融合序列”通过在低pH值下HA2亚基中形成长的α-螺旋向外结构域顶部移动，从而将三聚体茎笔直向上延伸。我们强调，R和D态是指整个HA1-HA2分子，而不是指三聚线圈碎片（TBHA2），其晶体结构已被确定并建议反映融合活性状态（F）(9). 如果这种结构的形成需要HA1顶部下降，则三聚体线圈结构不太可能是R状态的一部分，但可能嵌入D状态，因为其模糊外观表明HA1顶部分离。然而，如果螺旋线圈结构的形成只需要轻微的位移，而不需要HA1顶部的下降，另一种观点是，通过单体的紧密结合来保持尖峰形态，如R，可以确保朝向靶膜形成这种长的α-螺旋(29).

我们已经证明，即使在37°C下，低氢诱导的HA构象变化也不一定伴随着失活过程。虽然这在很大程度上取决于病毒株，但pH值是分离灭活与融合的主要因素。因此，使用X31和A/Japan HA，可以在不发生失活的次优pH值下观察到显著融合。这与驱动R进入对应于F的构象所需的活化能与将其转化为失活状态所需的激活能相同的模型并不矛盾(三,30). 只有在接近的靶膜存在（而不是不存在）的情况下，在次最佳pH值下，才能提供所需的活化能，将R转化为F。因此，在次最优pH值下不存在靶膜的情况下预培养病毒不会导致失活。最佳pH值（pH值5.0左右）足以触发R_M（M）→ F.然而，在没有靶膜的情况下，R不可逆地转化为失活状态。融合和灭活之间的pH依赖性分离表明，内体中的灭活可能对流感病毒没有重要作用。由于可以合理地假设内体内腔的pH值是逐渐变化的，因此融合而非失活发生的pH条件将暂时存在于内体中。

我们发现的构象中间体对流感病毒HA来说并不是唯一的。以前我们已经证明，水疱性口炎病毒（弹状病毒）糖蛋白预先暴露于低pH值导致其融合活性激活(28). 利用可溶性CD4（sCD4）作为受体模拟物，在HIV-1、HIV-2和猿免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白对受体结合的反应中也发现了类似的结果。我们已经证明，导致融合的细胞表面HIV-1包膜糖蛋白的构象变化是由细胞表面CD4和辅受体之间的合作触发的(19). 然而，sCD4与HIV-1-、HIV-2-和SIV-感染细胞的包膜糖蛋白结合可引起某些构象变化(19,31). 在几个通过细胞系传播的HIV-1分离株中，这种相互作用导致病毒失活(31)而不同HIV-2和SIV包膜糖蛋白的融合活性通过sCD4的亚抑制剂量增强(1,12). sCD4灭活敏感性的差异被归因于HIV-2和SIV包膜糖蛋白亚基之间更稳定的结合(31). 关于HA不同菌株对低pH灭活的敏感性，也可以援引类似的解释。对构象中间体的检测可能对开发防止病毒进入的药物或疫苗具有意义。我们的结果也可能为测定低pH下HA外结构域的三维结构提供一些信息。R中间产物的疏水性低于随后的构象变化状态。因此，R态的外畴可能为结晶和随后的X射线研究提供了一个有希望的对象。

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参考文献