流感A病毒是一种负链RNA病毒，属于正粘病毒科家庭。病毒基因组由八个RNA片段组成，编码10种蛋白质。在这些蛋白质中，NS1是唯一的非结构蛋白。它在病毒感染的细胞中高水平表达，并被证明能够与dsRNA结合(26). 先前的研究表明，NS1蛋白与dsRNA的结合阻止了干扰素（IFN）诱导的dsRNA依赖性蛋白激酶（PKR）的激活(38,56). 此外，还提出了NS1蛋白在病毒复制过程中的其他调节功能，如抑制宿主mRNA多聚腺苷化(42)，抑制多聚腺苷化宿主mRNA的核输出(8)，抑制mRNA剪接(18,37)，刺激病毒mRNA的翻译(2,10,13,14)以及病毒RNA转录和复制的调节(40,53).
已产生一种缺乏NS1基因的重组流感A/PR8/34病毒（delNS1病毒）(20). 这种病毒似乎只在α/β干扰素（IFN-α/β）系统缺陷的底物或宿主中有效复制，例如6日龄的卵(55)，状态1−/−小鼠(20)，或PKR−/−小鼠(4). 这些观察结果表明，NS1蛋白可能在抑制病毒复制期间的干扰素反应中发挥关键作用。
干扰素是宿主抵抗病毒感染的第一道防线（有关综述，请参阅参考文献51). 有两种类型的干扰素，（IFN-α/β），包括IFN-α和IFN-β，以及IFN-γ。干扰素-α/β通常在病毒感染后数小时内诱导产生。一旦合成，它以自分泌和旁分泌的方式发挥作用，以防止病毒的复制和传播。病毒感染后诱导IFN-α/β的产生需要多种调节因子。这些因子主要作用于转录水平，诱导IFN-α/β基因合成mRNA。干扰素-β启动子的转录调控已经得到了很好的研究(1,48,58,59,63). 已证明参与调节IFN-β转录的关键转录因子包括IRF-3、AP1和NF-κB。NF-κB包括一个转录因子家族，在许多生理反应的调节中发挥重要作用，从免疫和炎症反应到细胞分化和凋亡(23). 在正常情况下，NF-κB与其抑制剂IκB结合，导致NF-κ的细胞质滞留。大多数已知的NF-κB诱导物通过最近鉴定的IκB激酶（IKK）复合物发挥作用(12). 活化的IKKs磷酸化IκB，随后被泛素化并经历26S蛋白体介导的降解。因此，NF-κB被释放并进入细胞核，在那里，它刺激启动子中包含NFκB结合序列元件的基因的转录（有关最新综述，请参阅参考文献31).
研究表明，核NF-κB活性是由暴露于多种细菌和病毒感染中诱导的。随后，活化的NF-κB有助于刺激IFN-α/β的合成。由于干扰素-α/β在宿主抗病毒反应中的重要性，许多病毒进化出不同的策略来破坏干扰素系统。例如，一些负链RNA病毒被证明编码干扰素信号通路的抑制剂，如仙台病毒的C蛋白(21,22,24,33)SV5和PIV2的V蛋白(11,64)牛呼吸道合胞病毒的NS1和NS2蛋白(50)，埃博拉病毒VP35蛋白(三)以及裂谷热和本亚米韦拉病毒的NSs蛋白(25,60). 在本报告中，我们证明了A型流感病毒的NS1蛋白具有阻止NF-κB活化的能力，从而抑制病毒感染细胞中IFN-α/β的生成。
材料和方法
病毒和细胞。
流感A/PR/8/34（PR8）病毒（H1N1）、新城疫病毒（NDV）和仙台病毒在37°C的10日龄鸡胚中繁殖。流感X-31病毒是a/HK/8/68和a/PR/8/34流感病毒的重组体，由英格兰利物浦Evans Biological有限公司提供。德尔NS1病毒是一种PR8衍生的病毒，其中NS1基因缺失(20). 如前所述，这种病毒生长在7天龄的鸡胚中(55). NS1（1–126）病毒与delNS1病毒是同基因的。其NS基因在核苷酸位置378后缺失19个核苷酸，导致NS1基因编码PR8病毒NS1蛋白的前126个氨基酸，其次是T、S和V氨基酸。病毒滴度是在每毫升2μg胰蛋白酶存在下，通过MDCK细胞上的斑块试验获得的。MDCK细胞保存在含有10%胎牛血清（FCS）和抗生素的基本培养基中。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、293和Vero细胞保存在含有10%FCS和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中。
病毒感染。
将10 cm直径培养皿中的MEF与病毒在磷酸盐缓冲盐水（0.2%牛血清白蛋白（BSA）中孵育，并在室温下以1倍感染率（MOI）感染。孵育一小时后，取出含病毒的溶液，并在CO中的生长培养基中孵育细胞237°C培养箱。293个细胞的感染也采用了相同的程序，只是没有去除病毒接种物以防止细胞从培养皿上脱落。
质粒和cDNA。
pIFN-CAT是通过将小鼠IFN-β启动子（−184至+19）插入Nhe公司我和Bgl公司氯霉素乙酰转移酶（CAT）开放阅读框（ORF）前面的pCAT3-增强子（Promega）的II位点。用引物5′-GGCCGCTTAGCTTGAGTTCTTATCTTCAGGCTGTCC-3′和5′-CGCGAGATCTGCAAGCAAGCAGCAAGAGGTCAAAGGCTCTGTGTGC-3′以及从MEF中分离的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增小鼠IFN-β启动子。质粒pκB-Luc在NF-κB应答启动子控制下编码萤火虫荧光素酶报告基因(19). pRL-TK-Luc（Promega），包含雷尼利亚荧光素酶报告基因在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子的控制下，被用作转染效率的内部控制。pCAGGS-NS1（SAM）是通过将野生型PR8病毒NS1的ORF插入生态RI和Xho公司pCAGGS的I位点(44)，如前所述(54). 该质粒含有NS1 cDNA，其中剪接受体序列在鸡β-肌动蛋白启动子的转录控制下通过沉默点突变（cDNA意义上的核苷酸541处的a至C）进行突变。pCAGGS-NS1-R38A/K41A（SAM）编码NS1蛋白，其中氨基酸R38和K41突变为A(54). pCAGGS-NS1（1-73）是通过插入一个PCR产物生成的，该PCR产物对应于编码NS1的前73个氨基酸的序列，然后是血凝素（HA）/TAG表位生态RI和Xho公司pCAGGS的I站点。该PCR产物由引物NS1EcoRI5′（5′-GCGCGAAATTCAATAATGGATCAACACTG-3′）和5′-GGCCCTCGAATCAGCCATAATCTGGGACATCCATAAGGGATCCCGGGGGATTTTCAGAATCCG-3′以pCAGGS-NS1（SAM）为模板生成。以pCAGGS-NS1-R38A/K41A（SAM）为模板，用同一组引物产生pCAGGS-NS1（1-73，R38A/K41 a）。pLPC-IκB（SA）和pLPC-IKK（KA(6,47,62). pT3-NS-IAmut1包含PR8病毒的一个突变NS基因，其两侧由T3 RNA聚合酶启动子和英国标准协会我限制网站。IAmut1突变由从LIGGL到KQRRS的NS1蛋白的181到185氨基酸替换组成，是通过pT3/PR8-NS质粒的定点突变产生的(15). 按照制造商的建议，通过随机引物标记（Roche）制备用于Northern印迹分析的特定小鼠IFN-α（mIFN-α）、mIFN-β、小鼠β-肌动蛋白（mβ-actin）、人IFN-β（hIFN-β）和人β-肌动蛋白（hβ-action）探针。以脂多糖处理的小鼠或人类巨噬细胞获得的mRNA为模板，通过逆转录（RT）-PCR制备用作探针模板的DNA片段。首先，用寡核苷酸（dT）作为引物对mRNA进行逆转录。在随后的PCR中使用了以下引物：mIFN-β，5′-AATGTCAGGAGCTTGGAGC-3′和5′-CTCTGGCTTAAAGTGCC；mIFN-α，5′-AACGCTACACACTGCATCT-3′和5′-TGCTCTATAATGCTTGG-3′；mβ-肌动蛋白，5′-ATGGACGATCGCT-3′和5′-AtgAGTAGTCTGTCAGGT-3′；hIFN-β，5′-GGCGATGACCAAGTCTC-3′和5′-GCGCTCTCAGTTCTCGGAGTAACCTGT-3′；和hβ-actin，5′-TCCTGGGCATCCACGAAAACT-3′和5′-GAGCATTGGGACGAGAGAGAT-3′。
质粒转染。
用磷酸钙转染pIFN-CAT。在每次转染中使用pIFN-CAT（0.1μg）和1μg的pLPC、pLPC-IκB（SA）、pLPC-IKKβ（KA）、pCAGGS-NS1（SAM）、pCAGGS-NS2（1-73）或pCAGG S（1-73，R38A/K41A）。按照制造商的说明，用Fugene6脂质体感染试剂（Roche）转染pκB-Luc。在每次转染中使用pκB-Luc（0.1μg）和1μg的pLPC、pLPC-IκB（SA）、pLPC-IKKβ（KA）、pCAGGS-NS1（SAM）、pCAGGS-NS2（1-73）或pCAGG S（1-73，R38A/K41A）。pRL-TK（0.1μg）被纳入这些转染中，作为内部对照，以使转染效率正常化。在进行Northern分析的实验中，用Lipofectamine 2000（Gibco-BRL）转染pLPC-IκB（SA）、pLPC、pCAGGS、pCAGCS-NS1和pCAGG-NS1（1-73）。在这些情况下，每个质粒使用5μg。
产生转染病毒。
通过反向遗传学技术产生转基因病毒(15,17,20). 在转染实验中，使用编码NS-IAmut1 RNA片段的质粒拯救了NS1（1–126）病毒。转染后，将重组病毒在37°C下用琼脂覆盖培养基覆盖的MDCK细胞中进行三次菌斑纯化，并使用几个菌斑在10天龄的胚胎卵中制备病毒库存。利用引物5′-GGCCTCTATAGATAGAGACTCACTATAAAGCAAGCAGGGTGAAAAG-3′（与NS基因3′非编码端的位置1至21互补）对分离的转染病毒的基因组RNA进行RT-PCR分析和5′-GATCGCTTCTATTAGATAAACAAGGTTTTTTATAAATAAGCTG-3′（包含NS基因5′非编码端的最后38个核苷酸）。PCR产物被克隆并测序。序列分析显示存在两种不同的克隆病毒种群。一些病毒株与NS-IAmut1病毒对应，其NS基因与转染的NS基因相同。其他一些病毒库在转染的NS基因中包含19个核苷酸的自发缺失，导致病毒NS1（1-126）编码截短的NS1蛋白。NS1（1–126）病毒通过本文中描述的分析进一步表征。
CAT和荧光素酶分析。
如前所述进行CAT分析(46). 根据制造商的建议，在荧光素酶分析中使用了双荧光素酶报告分析系统（Promega）。
EMSA。
如前所述，进行电泳迁移率变化分析（EMSA）以确定NF-κB的激活(49). 简单地说，核提取物的制备如下。用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞，然后将其重新悬浮在裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl[pH8.0]，60 mM KCl，1 mM二硫苏糖醇，1 mM-EDTA，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，0.3%NP-40，1×完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche Molecular Biochemicals]）。在冰上孵育5分钟后，在4°C下通过离心法造粒细胞核。将颗粒重新悬浮在等体积的核提取缓冲液中（20 mM Tris-HCl[pH8.0]，400 mM NaCl，2 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mM PMSF、25%甘油）。在冰上培养10分钟后，将悬浮液旋涡化，并在4°C下离心清除。在EMSA中使用含有2μg蛋白质的核提取物等分样品。在这些分析中使用了含有小鼠H2κB结合位点的DNA探针(49). 用于超位移测定的抗-p50和抗p65兔多克隆抗体分别购自Santa Cruz Technologies和Rockland。
免疫染色。
在12 mm直径的盖玻片（Fisher Scientific）上生长的MEF经过模拟治疗，肿瘤坏死因子α（TNF-α）（10 ng/ml；R&D Systems，Inc.）刺激，或感染PR8或delNS1病毒6小时，MOI为1。用PBS清洗细胞，并用100%冰镇甲醇固定10分钟。用3%牛血清白蛋白（BSA）（Sigma）封闭30分钟后，用稀释1:200的兔抗p65抗体（Rockland）和小鼠抗NP抗体HT103孵育细胞(45)在3%BSA–PBS中以1:500稀释40分钟。MEF用PBS洗涤三次，然后用异硫氰酸荧光素结合抗兔抗体和德克萨斯红结合抗鼠抗体（Boehringer Mannheim）在3%BSA-PBS中稀释1:500。然后用含有防褪色试剂（分子探针）的安装介质将盖玻片固定在载玻片上。对染色细胞进行盲法计数，以确定p65的定位。
Northern印迹分析。
从模拟感染或感染PR8、delNS1、NS1（1-126）或仙台病毒的细胞中分离出RNA，MOI为1。按照制造商的建议，使用TRIzol试剂（分子研究中心）提取总RNA。使用Quickhyb杂交溶液（Stratagene）对10微克总RNA进行Northern分析。通过特异性杂交检测不同的mRNA[32P] ATP标记探针。RNA负载通过归一化为β-肌动蛋白探针来控制。
蛋白质斑点。
融合MDCK细胞的培养皿（直径35 mm）模拟感染PR8或NS1（1–126）病毒，或在MOI为2时感染。感染后6小时（p.i.），细胞在100μl放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中溶解。将10微升细胞裂解物装入十二烷基硫酸钠（SDS）–15%聚丙烯酰胺凝胶中。将分离的蛋白质转移到膜上，并用兔多克隆抗NS1抗体进行Western分析。山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）过氧化物酶抗体作为二级抗体（Boehringer Mannheim）。使用化学发光试剂（NEN；目录号NEL101）进行蛋白质印迹。
结果
干扰素-α/β基因在感染delNS1的细胞中诱导，但在感染PR8病毒的细胞中不诱导。
干扰素合成是宿主对病毒感染的早期反应之一。我们以前的研究表明，NS1基因缺失的流感病毒delNS1病毒只能在干扰素缺乏系统中有效复制，这表明流感病毒的NS1蛋白抑制宿主的干扰素系统(20,55). 我们首先研究了这种抑制是否是通过阻断IFN-α/β的合成来实现的。为此，我们用delNS1或亲代野生型PR8病毒以1的MOI感染MEFs，然后在6、12和18小时收获RNA。Northern印迹分析表明，IFN-α和IFN-β基因在感染delNS1病毒的细胞中都被诱导（图。). 相反，我们无法检测到野生型PR8病毒感染后这些基因的诱导。对人类上皮细胞系Hec-1b的RT-PCR分析也表明，感染delNS1病毒的细胞可以诱导IFN-β，但PR8病毒不能诱导(54). 这些结果表明，NS1蛋白直接阻止感染甲型流感病毒的人和小鼠细胞中IFN-α/β特异性mRNA的从头合成。
MEF中delNS1病毒感染诱导IFN-α/β特异性mRNA。使用从模拟感染的MEF或感染PR8或delNS1病毒的MEF中分离的RNA，在指定的时间内，以MOI为1，对与IFN-α和IFN-β相对应的mRNA进行Northern blot分析。共使用10μg RNA。Northern blot检测来自管家基因（β-actin）的mRNA作为对照。
NF-κB在感染delNS1病毒的细胞中被激活。
尽管在感染delNS1病毒的MEF中，IFN-α和IFN-β基因都被诱导，但我们将重点放在研究在delNS1病毒感染期间导致IFN-β诱导的信号通路中相关分子的激活。许多转录因子在IFN-β表达调控中被定义，其中NF-κB和IRF-3起着关键作用。以前，我们已经证明，delNS1病毒感染，而不是PR8病毒感染，会导致IRF-3的激活(54). 我们现在测试感染delNS1病毒的细胞中NF-κB是否也被激活。MEF感染野生型PR8病毒或突变型delNS1病毒，感染指数为1。在p.i.的2和6 h，制备核提取物，并使用NF-κB特异性探针进行EMSA。delNS1病毒感染在6小时p.i.时明显激活NF-κB（图。A） ●●●●。然而，模拟感染细胞和PR8感染细胞的活化NF-κB水平没有显著差异。delNS1病毒感染对NF-κB的激活维持在16h p.i.（数据未显示）。在本试验中，delNS1介导的NF-κB活化与TNF-α、dsRNA-或NDV介导的核因子κB激活具有可比性（图。A） ●●●●。这些结果表明，NS1蛋白可以阻止A型流感病毒感染细胞中NF-κB的激活。
MEF中delNS1病毒感染激活NF-κB。（A） EMSA检测活化NF-κB。MEF在指定时间内未经治疗（UT）、模拟感染或感染PR8、delNS1或NDV病毒，MOI为1。用NF-κB特异性DNA探针对核提取物进行EMSA。TNF-α和dsRNA-处理的细胞作为阳性对照。（B） NF-κB复合物的超移位。用抗p65和抗p50抗体（Ab）在感染delNS1或NDV的MEF中转移NF-κB复合物，每次6小时。
NF-κB通常由两个亚单位组成，p50和p65。为了测试通过delNS1病毒感染激活的NF-κB中是否存在这种多肽，我们进行了超转移分析（图。B） ●●●●。抗p50和抗p65抗体都能够超转移活化的NF-κB，以应对delNS1病毒感染，表明这两个亚单位都存在于NF-κ的B复合体中。
我们还通过使用NF-κB的p65亚单位特异性抗体对病毒感染的MEF进行免疫染色来确定NF-κ的激活。非活性NF-κB通过与其抑制剂IκB结合而保留在细胞质中。NF-κB的核转位表明其活化。感染delNS1但未感染PR8病毒的MEF显示p65的显著核易位（数据未显示）。事实上，我们发现，超过85%的delNS1病毒感染细胞在6小时p.i.时表现出NF-κB的核移位，而只有约10%的PR8病毒感染细胞表现出NFκB移位。这些结果表明，在感染甲型流感病毒的细胞中，需要表达NS1来阻止NF-κB的激活。
NF-κB对于delNS1病毒感染诱导IFN-β基因至关重要。
NF-κB已被证明与IFN-β启动子的阳性调节域II结合，并在调节IFN-β转录中发挥重要作用(32). 然后我们研究了NF-κB活化在delNS1病毒感染后IFN-β诱导中的作用。用报告基因pIFN-CAT对293个细胞进行转染，该报告基因在小鼠IFN-β启动子的控制下编码CAT。与我们在MEF中的Northern分析一致，感染delNS1而非PR8病毒会激活该报告基因（图。A、 B和C）。为了测试NF-κB在delNS1病毒感染期间激活IFN-β启动子中的重要性，我们使用了一个编码IκB、IκB（SA）超阻遏物形式的质粒，该质粒编码一个磷酸化位点S32和S36处含有点突变的人IκB-α蛋白(6). 因此，这种IκBα的突变形式与NF-κB结合，但不能被磷酸化和降解，从而抑制NF-κB的激活。pLPC-IκB（SA）与pIFN-CAT共转染显著减弱了delNS1病毒感染引起的CAT报告基因的激活（图。A和B），证明NF-κB对激活IFN-β启动子至关重要。pLPC-IκB（SA）转染也抑制dsRNA-或NDV诱导的CAT活性（图。A和B），这与之前的数据一致，表明NF-κB在不同诱导物对IFN-β启动子的调节中起着关键作用(32,41).
NF-κB对delNS1病毒诱导的IFN-β基因表达至关重要。（A） 用pIFN-CAT（在小鼠IFN-β启动子下编码CAT报告基因）和表达超阻遏物形式IκB、IκB（SA）或空载体的质粒共同转染293个细胞的单层。转染后一天，用50μg dsRNA模拟处理或转染细胞，或以1的MOI感染PR8、delNS1或NDV病毒。一天后，用5μl细胞提取物进行CAT分析。（B） 图所示结果的定量分析。A.（C）用pIFN-CAT和表达IκB激酶主要阴性形式、IKKβ（KA）或空载体的质粒共同转染293细胞单层。转染后一天，细胞按A组处理。显示定量结果。（D） 用表达IκB（SA）的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间内以1的MOI感染PR8、delNS1或仙台病毒。提取RNA，并用IFN-β和β-肌动蛋白mRNA特异性探针进行Northern印迹分析。
IκB磷酸化似乎由最近发现的IKK介导。IKK复合物由IKKα和IKKβ两种激酶以及其他调节亚单位组成。敲除研究表明，IKKβ在通过多种不同的诱导物（包括dsRNA）介导NF-κB活化中尤其重要(9). 为了检测IKKβ在delNS1病毒激活NF-κB和诱导IFN-β中的可能参与，我们使用了一个编码IKK？？，IKK（KA）显性阴性形式的质粒。点突变K44-A使该激酶失活，现在它作为野生型IKKβ的显性负突变发挥作用。pLPC-IKKβ（KA）与pIFN-CAT共转染显著抑制了delNS1病毒介导的CAT报告基因的激活（图。C） 表明IKKβ与IFN-β启动子的激活密切相关。pLPC-IKKβ（KA）转染也阻断了dsRNA或仙台病毒对IFN-β启动子的诱导（图。C） ，表明IKKβ在介导不同病毒的IFN诱导中是重要的。这些数据与最近关于IKKβ水疱性口炎病毒感染的报告一致−/−MEF公司(9).
接下来，我们测试了NF-κB的抑制是否导致delNS1病毒感染抑制内源性IFN-β基因的激活。与我们之前的实验一致，感染delNS1而非PR8病毒会诱导293细胞产生IFN-βmRNA（图。D） ●●●●。IκB（SA）的表达显著抑制了delNS1病毒诱导的IFN-βmRNA表达，表明NF-κB的激活是delNS1病毒感染诱导IFN-β基因转录所必需的。正如预期的那样，IκB（SA）的表达也抑制仙台病毒诱导的IFN-βmRNA合成（图。D） ●●●●。
NS1的dsRNA结合域足以抑制NF-κB活化和IFN-β诱导。
为了确定NS1是如何阻止NF-κB的激活的，我们使用了一个NFκB报告基因，即pκB-Luc，该报告基因在两个NF·κB结合位点的控制下编码荧光素酶报告基因。正如预期的那样，感染delNS1病毒后，报告基因活性在293细胞中的表达增加了约7倍，而PR8病毒感染仅对报告基因活性产生中度影响（图。A） ●●●●。这些结果与MEF中的EMSA和NF-κB易位分析一致（图。). pκB-Luc与NS1蛋白表达质粒pCAGGS-NS1（SAM）共转染几乎完全抑制了delNS1病毒诱导的NF-κB活化（图。A） 证明NS1在抑制A型流感病毒感染细胞中NF-κB活化中起关键作用。NS1表达也可以抑制dsRNA或仙台病毒诱导的NF-κB活化（图。A） 证明NS1蛋白能够在没有任何其他流感病毒蛋白表达的情况下阻止NF-κB活化。
NS1蛋白的dsRNA结合域足以阻止NF-κB活化和IFN-β诱导。（A） 在NF-κB应答启动子pκB-Luc的控制下，用含有报告基因的质粒转染293细胞。此外，用表达NS1、NS1（1-73）、NS1的质粒（1-73、R38A/K41A）或空载体共同转染细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或用MOI为1的PR8、delNS1或仙台病毒感染细胞。转染后两天，测定荧光素酶活性。在所有转染中，pRL-TK-Luc编码雷尼利亚荧光素酶在组成启动子的控制下被联合转染，并且雷尼利亚荧光素酶活性被用作内部控制，以使结果正常化。（B） 用pIFN-CAT和表达NS1、NS1（1-73）或NS1（1–73，R38A/K41A）蛋白或空载体的质粒共转染293个细胞。转染后一天，用10μg dsRNA转染细胞，或在MOI为1时感染PR8或delNS1病毒，或在DOI为10时感染仙台病毒。转染后两天，进行CAT检测，并对结果进行量化。（C） 用表达NS1或NS1（1–73）蛋白的质粒或空载体转染293细胞。转染后一天，细胞在指定的时间点以1的MOI感染delNS1或仙台病毒。提取RNA并使用干扰素-β和β-肌动蛋白mRNA特异探针进行Northern blot分析。
NS1蛋白已被证明包含两个重要的结构域，一个是位于N末端的dsRNA结合结构域，另一个是位于C末端的效应结构域。效应域是指NS1介导的mRNA剪接、多聚腺苷酸化和转运抑制所需的序列(34). 病毒感染期间产生的dsRNA被认为可以触发病毒感染细胞中的抗病毒信号通路。因此，我们测试了NS1蛋白的dsRNA结合结构域是否足以抑制NF-κB的激活。我们生成了表达两个NS1突变体pCAGGS-NS1（1–73）的质粒，编码NS1的最小dsRNA结合域(36)和pCAGGS-NS1（1–73，R38A/K41A），编码相同的NS1结构域，该结构域包含一个双突变，导致其dsRNA结合活性减弱(57). NS1（1–73）蛋白的表达导致在delNS1或仙台病毒感染期间或在dsRNA治疗期间NF-κB活化受到抑制，而当使用dsRNA突变NS1蛋白NS1（1-73，R38A/K41A）时，这种抑制显著降低（图。A） 。
我们还研究了NS1的dsRNA结合域是否足以抑制病毒感染引起的IFN-β诱导。表达全长NS1或NS1（1–73）的质粒与pIFN-CAT共转染显著抑制了在IFN-β启动子控制下delNS1病毒诱导的CAT报告基因激活。当表达dsRNA结合突变体NS1（1–73，R38A/K41A）时，这种抑制作用降低（图。B） ●●●●。NS1（1–73）也抑制dsRNA或仙台病毒诱导的IFN启动子活性（图。B） 证明NS1蛋白的dsRNA结合域在没有任何其他流感病毒蛋白表达的情况下阻止IFN启动子的激活以及NF-κB的激活。与此一致，我们发现NS1（1–73）的表达足以抑制293细胞中病毒诱导的内源性IFN-βmRNA合成（图。C） ●●●●。
感染表达129个氨基酸的截短NS1蛋白的重组a型流感病毒，即NS1（1-126）病毒，可阻止NF-κB的激活和IFN-β的诱导。
为了证实NS1蛋白的dsRNA结合域足以在A型流感病毒感染期间抑制NF-κB活化和IFN-β诱导，我们使用了一种重组流感病毒NS1（1-126），该病毒表达一种截短形式的NS1蛋白（图。A） ●●●●。这个截短的NS1蛋白有一个完整的dsRNA结合域，但缺少羧基末端效应域。我们通过EMSA研究了NS1（1-126）病毒感染是否激活NF-κB。正如预期的那样，NS1（1–126）病毒的行为与野生型PR8病毒相同（图。B） ●●●●。因此，NS1（1-126）病毒感染阻止了NF-κB的激活。与此一致，通过Northern印迹法测量，NS1（1-126）病毒感染也阻止了IFN-βmRNA的表达（图。C） ●●●●。这些结果表明，A型流感病毒NS1蛋白的dsRNA结合域足以抑制NF-κB活化和IFN-β诱导。
NS1（1–126）病毒感染可阻止NF-κB的激活和IFN-β的诱导。（A） MDCK细胞以1的MOI感染PR8或NS1（1-126）病毒。每次6小时，提取细胞提取物。用抗NS1抗体对细胞提取物（10μl）进行Western分析。wt，野生型。（B） 293个细胞被模拟感染或感染了delNS1、PR8或NS1（1-126）病毒，MOI为1。每次6小时，制备核提取物，并用活化NF-κB特异性探针进行EMSA。（C） 293个细胞感染了NS1（1-126）或delNS1病毒。在指定的时间提取RNA，并使用IFN-β和β-actin mRNA特异探针进行Northern blot分析。
讨论
这里展示的结果突出了a型流感病毒NS1蛋白的一个先前未知的作用：抑制NF-κB的激活。一些产品可能有助于NF-κB在野生型甲型流感病毒感染期间的激活，包括dsRNA，这被认为是在病毒感染期间产生的。此外，不同流感病毒蛋白（如NP、M和HA）的过表达被证明会导致NF-κB的激活和NFκB应答报告基因的转录(16). 尽管这一观察涉及单个流感病毒蛋白的表达，但我们发现在野生型流感病毒感染的细胞中只有NF-κB的边际激活。值得注意的是，我们的结果表明，A型流感病毒的NS1蛋白在病毒感染期间阻止NF-κB的激活。事实上，NS1蛋白的表达有效地阻止了dsRNA、仙台病毒和NDV介导的NF-κB的激活。此外，感染A型流感病毒NS1基因敲除病毒（delNS1）导致NF-κB不受控制的活化。NF-κB激活的下游基因包括参与刺激T细胞增殖的基因，如白细胞介素2(29,52)，主要组织相容性复合体I类(30)和B7(66)基因等等。此外，NF-κB参与IFN-β基因的转录激活(28,35)导致抗病毒基因的表达。因此，NF-κB的激活通过刺激宿主的固有免疫和适应性免疫反应，在抑制病毒复制中发挥重要作用。在本研究中，我们证明了病毒抑制宿主抗病毒防御机制的一种可能机制是通过阻止NF-κB活化。
NF-κB的激活是通过IKK激酶复合物（IKKα、IKKβ和IKKγ）对其抑制剂IκB的磷酸化介导的(12). 反过来，IKKβ可以被PKR激活(9,65). 众所周知，与dsRNA的结合导致PKR的激活(61). 因此，NS1蛋白可能与dsRNA结合(26)阻止dsRNA激活内源性PKR的组成水平，从而阻止NF-κB的激活。我们的观察结果与这个假设一致。因此，仅包含dsRNA结合域的NS1蛋白的突变形式，即NS1（1–73）和NS1（1-126），在从转染细胞中的质粒表达或由重组流感a病毒表达时，能够阻止NF-κB活化。相反，受dsRNA结合能力影响的突变体NS1（1-73，R38A/K41A）不能有效阻止NF-κB活化。另一方面，NS1（1–73）的表达并不影响TNF或NF-κB应答启动子p65的过表达激活（数据未显示），这表明NS1的dsRNA结合域特别参与抑制病毒和/或dsRNA诱导的NFκB激活。这些结果与NS1的合成阻止dsRNA介导的PKR激活，抑制PKR介导的NF-κB通路刺激的模型一致。具体来说，流感病毒感染期间产生的dsRNA可能被NS1蛋白隔离，并且可能无法激活PKR。另一方面，NS1蛋白可能因其dsRNA结合特性而被靶向与PKR相互作用，从而导致PKR抑制。事实上，感染delNS1病毒或NS1温度敏感性流感A病毒，但不感染野生型病毒，导致PKR激活(4,27). 有趣的是，转染表达PKR激酶显性阴性形式的质粒（PKR K296R）并没有阻止delNS1-或仙台病毒感染细胞中IFN-β启动子的激活（数据未显示）。这些结果与最近的观察结果一致，这些观察结果表明，催化活性不活跃的PKR的过度表达导致IKK的刺激，很可能是通过蛋白质相互作用(5,9). 因此，使用PKR的酶不活性显性阴性突变体进行的实验并不排除PKR负责delNS1病毒感染细胞中NF-κB活化的可能性。然而，我们不能排除一种与PKR不同的未知dsRNA-活化激酶是NS1介导的NF-κB通路抑制的主要靶点。
NF-κB是IFN-β基因激活的重要阳性调节因子(35). 据推测，刺激IFN-β的合成可启动IFN-α/β级联反应(39). 先前的研究也表明NF-κB可能对IFN-α基因的激活很重要(9). 与此相一致，我们观察到在delNS1病毒感染的细胞中IFN-α/β合成受到刺激（图。). 相反，通过Northern blot分析，我们无法在野生型PR8病毒感染的细胞中检测到显著水平的IFN-α/βmRNA。这些结果表明，A型流感病毒NS1通过抑制IFN-α/β的合成而起到病毒编码IFN拮抗剂的作用。除NF-κB外，其他转录因子如AP-1、IRF3和IRF7也与病毒感染期间IFN-β基因的激活有关(58). 我们实验室以前的研究表明，NS1蛋白也抑制病毒感染细胞中IRF-3的激活(54)，进一步支持NS1蛋白在流感病毒感染期间抑制IFN-α/β系统中的关键作用（图。).
甲型流感病毒NS1蛋白抑制干扰素-β诱导机制的模型。流感病毒感染导致产生dsRNA，dsRNA反过来激活转录因子AP-1（ATF2/c-JUN）、IRFs（IRF-3/7）和NF-κB。这些转录因子与干扰素-β启动子结合后相互协作，促进RNA聚合酶II机制的募集（增强子形成），并刺激干扰素βmRNA的合成。流感病毒感染期间NS1蛋白的表达可阻止dsRNA介导的IRF-3活化(54)和NF-κB（本研究），因此抑制IFN-β的生成。这种抑制作用取决于NS1结合dsRNA的能力。因此，在A型流感病毒感染期间，NS1蛋白也可能阻止ATF2/c-JUN的激活。此外，值得注意的是，PKR是一种dsRNA激活的激酶，在不同的IFN途径中起着重要作用，既是IFN合成的诱导剂，也是翻译的抑制剂，其水平随着IFN和IRF-1的激活而转录增加(43,61)也被发现在甲型流感病毒感染期间被NS1蛋白抑制(4,27). NS1蛋白对IRF和NF-κB激活的抑制很可能涉及对PKR和/或dsRNA激活的非特征化上游激酶的抑制。
病毒和宿主的共同进化导致了复杂的相互作用，这些相互作用调节病毒的致病性和宿主疾病。干扰素-α/β系统是抵抗病毒感染的强有力的第一道防线。病毒感染期间IFN合成的激活导致参与抗病毒防御机制的许多宿主基因的转录激活。然而，大多数病毒通过编码干扰素拮抗剂对这种抗病毒系统作出反应。甲型流感病毒的NS1似乎通过其dsRNA-结合特性靶向IFN-α/β的合成。在这方面，它似乎具有类似于痘苗病毒（DNA病毒）E3L蛋白的功能作用(7). 痘苗病毒和甲型流感病毒中具有类似功能的类似蛋白质的存在，突显了这些蛋白质在宿主内病毒复制中的重要作用。
