流感病毒NS1蛋白对抗PKR介导的复制抑制

摘要

α/β干扰素（IFN-α/β）诱导的细胞抗病毒反应是抵抗宿主病毒感染的第一道防线(31). 干扰素诱导的主要抗病毒效应物包括Mx(29,30,32)，2′-5′寡腺苷酸合成酶(2,8)和双链RNA（dsRNA）活化蛋白激酶（PKR）(25). PKR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活后可二聚并自动磷酸化（有关综述，请参阅参考文献三,14,19、和35). 活化形式的PKR能够通过磷酸化真核翻译起始因子2（eIF-2α）的α亚基来阻止蛋白质合成。这种机制抑制病毒复制。为了抵消IFN诱导和PKR激活的抗病毒作用，许多真核病毒已经开发出阻断PKR活性的策略（综述见参考文献11). 就甲型流感病毒而言，假设该病毒可以通过两种机制抑制PKR活性。其中一条途径的特征是病毒招募P58IPK。这种细胞蛋白被认为通过与激酶直接结合来抑制PKR(10,23,24). 流感病毒感染期间PKR阻断的第二种机制涉及病毒非结构蛋白NS1（以下简称NS1）。该蛋白在体外有效地阻断了dsRNA介导的纯化PKR和eIF-2α的激活。相应地，NS1阻断PKR诱导的网织红细胞裂解物翻译抑制。因此，推测NS1通过与dsRNA结合来阻止dsRNA激活PKR(21). 其他研究表明，通过NS1蛋白和PKR之间形成复合物，PKR抑制也由RNA-依赖机制介导(34). 然而，NS1与PKR的直接相互作用仍存在争议(7). 有趣的是，一种NS1基因突变的对温度敏感的甲型流感病毒突变体在非允许温度下表现出蛋白质合成缺陷，这与磷酸化PKR和eIF-2α水平增加有关(13).

我们最近产生了一种可行的流感a/PR/8/34转染病毒，该病毒缺乏整个NS1基因（称为delNS1病毒）。我们发现，delNS1病毒只能在干扰素产生或信号传导缺陷的宿主系统中有效复制，而在干扰物活性宿主中无效(6,12). 这一结果表明，A型流感病毒的NS1蛋白对于干扰素缺乏系统中的病毒生长是不必要的。这也表明NS1蛋白是一种抵抗干扰素介导的抗病毒反应的毒性因子。在本研究中，我们研究了PKR在干扰素介导的delNS1病毒感染细胞和小鼠抗病毒反应中的作用。对感染细胞裂解物的分析表明，delNS1病毒感染细胞的PKR磷酸化水平高于野生型（wt）流感病毒A/PR/8/34（PR8）感染细胞，这表明NS1蛋白阻止PKR的激活。当感染细胞与2-氨基嘌呤（2-AP）孵育时，不允许delNS1病毒复制的细胞产生感染性颗粒(15)PKR的化学抑制剂。为了从组织水平分析这些观察结果的相关性，我们测定了delNS1病毒在缺乏PKR的小鼠中的复制特性。虽然delNS1病毒未能在wt小鼠的肺中复制，但它在PKR敲除小鼠中的生长效率与PR8 wt病毒一样高。

以前，有人认为wt流感病毒能够抑制感染细胞中PKR磷酸化(17). 如果NS1抑制PKR激活，则与感染wt PR8病毒的细胞相比，感染delNS1病毒的细胞应含有更高水平的活化自磷酸化形式的PKR。用PKR特异性抗体对细胞提取物进行Western blot分析，使我们能够区分活化和非活化形式的PKR。wt和模拟感染的W138细胞提取物之间的两种激活状态的比率为1:1。相反，感染delNS1病毒后，这种平衡明显转移到PKR的激活形式。这种由delNS1病毒感染引起的转变几乎与用dsRNA转染W138细胞一样明显，dsRNA是PKR的既定激活物（图。​（图1A）。1A） ●●●●。我们通过免疫沉淀病毒感染的和³²P标记的细胞提取物。该试验选择性检测PKR的激活形式。再次，与模拟或wt病毒感染相比，感染delNS1病毒与激活的PKR数量更高相关。delNS1病毒引起的PKR自磷酸化形式的增加大约是基线水平的两到三倍（图。​（图1B）。1B） ●●●●。值得注意的是，我们不能在高感染多重性（MOI）下进行这些检测，因为delNS1病毒的表型稍有减弱。因此，delNS1病毒和PKR之间观察到的PKR激活差异可能是一个低估计。然而，数据支持这样的假设，即缺乏NS1蛋白会阻止delNS1病毒抑制PKR激活。反过来，这表明PKR的激活至少在一定程度上是导致delNS1病毒无法在干扰素活性系统中形成感染性粒子的原因。

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图1

（A） 感染W138细胞中PKR的Western blot。模拟处理细胞，用dsRNA转染细胞，或用MOI为2的delNS1或PR8病毒感染细胞。对于dsRNA转染，根据制造商的协议，使用30μl DOTAP转染试剂转染50μg poly（I）-poly（C）RNA（德国曼海姆Boehringer）。分别在感染后或转染后的20小时内，对细胞进行裂解，并对等量的细胞提取物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。PKR-特异性抗体K-17检测到PKR-特异性条带（圣克鲁斯生物技术目录编号sc 707；加州圣克鲁斯）。上带对应于磷酸化（活性）PKR。下带对应于未磷酸化（非活性）PKR(18). 右侧显示了两个PKR波段。车道1，模拟；车道2，dsRNA；3巷，delNS1病毒；通道4，PR8病毒。（B） 受感染的HeLa细胞的磷酸化PKR的免疫沉淀。总共10个⁶HeLa细胞以0.5的MOI进行模拟治疗或感染流感病毒delNS1或PR8。感染后5 h，用无磷酸盐缓冲液清洗细胞，并在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养2 h，该培养基中缺乏磷酸盐和丙酮酸（Sigma），含有500μCi[³²P] 正磷酸盐（Amersham）。标记后，用冷磷酸盐缓冲盐水和10 mM EDTA（不含Ca）清洗细胞两次²⁺和镁²⁺)并在裂解缓冲液中冰上裂解10min。四分之一的提取物用于免疫沉淀，每毫升用2μg PKR抗体B-10（圣克鲁斯生物技术目录编号sc 1215）进行免疫沉淀，然后在4℃下添加30μl蛋白g-琼脂糖（50/50比例）。根据制造商的协议，使用含有PBSTDS（Ongenee，Cambridge，Mass.）的洗涤缓冲液清洗珠子，在95°C下加热2分钟，并在十二烷基硫酸钠–10%聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上进行分析。通过尺寸标记（Benchmark，GIBCO-BRL）确定条带的尺寸。用放射自显影术观察7天磷酸化PKR的条带，并用激光密度计定量。车道1，模拟；车道2，delNS1病毒；车道3，PR8病毒。尺寸标记显示在左侧。PKR波段显示在右侧。

为了进一步研究这一假设，我们试图通过在2-AP（PKR抑制剂和其他丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）存在下培养受感染的细胞来挽救delNS1病毒在非许可细胞中的复制(15). 在这个实验中，我们必须使用一种能够耐受所需高剂量2-AP的细胞系。因此，我们使用人类黑色素瘤细胞系518A2(16)其中PR8病毒的滴度高达5.3 log₁₀这对delNS1病毒是不允许的。感染细胞在5 mM 2-AP存在下孵育可使delNS1病毒复制到2.6 log的滴度₁₀PFU/ml（数据未显示）。虽然2-AP是一种非特异性蛋白激酶抑制剂，但该实验支持PKR参与阻断体内delNS1病毒复制的假设。

为了解决PKR抗病毒作用与流感病毒致病性的相关性，我们利用了PKR基因敲除（PKR）的可用性^−/−)老鼠。这些小鼠通过PKR的靶向缺失来源于C57BL/6小鼠(36). C57BL/6重量（PKR^+/+)小鼠取自Bomholtgard（Ry，丹麦）。值得注意的是，在未经治疗的PKR缺陷小鼠中，病毒对IFN-α/β基因的诱导未受影响，抗病毒反应似乎正常(1,36). 具体来说，我们分析了delNS1和PR8病毒在小鼠肺部的复制特性。图​图22比较了delNS1病毒在wt和PKR基因敲除小鼠和PR8病毒的复制特性。PR8感染后wt小鼠的平均肺病毒滴度为2.8 log₁₀第2天的PFU/ml，4.5 log₁₀第4天的PFU/ml和4.1 log₁₀感染后第6天的PFU/ml。delNS1感染后，分析的每个时间点肺组织中的病毒滴度均小于50 PFU/ml。在wt小鼠中缺乏可检测的delNS1复制支持了NS1基因在流感病毒致病性中的作用。PKR患者肺组织中病毒的平均滴度^−/−感染delNS1的小鼠为4.8 log₁₀第2天的PFU/ml，5.1 log₁₀第4天的PFU/ml，4.4 log₁₀感染后第6天的PFU/ml。这些滴度与PKR中获得的滴度相当^−/−PR8病毒感染后的小鼠。后者为5.2 log₁₀第2天，5.0 log₁₀第4天和4.3日志₁₀感染后第6天。感染性delNS1病毒可以从PKR的肺部恢复^−/−小鼠建立了PKR蛋白在介导对delNS1病毒的抗病毒反应中的相关性。自从PKR中的肺病毒滴度^−/−PR8和delNS1病毒的小鼠通常相似，这一结果也表明，NS1蛋白在流感病毒生命周期中的一个主要功能是抵消PKR介导的抗病毒反应。

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图2

PKR中PR8和delNS1流感病毒的滴度^+/+和PKR^−/−老鼠。7至9周龄的雌性小鼠被用于感染10只⁵wt PR8或delNS1病毒的PFU。病毒在乙醚麻醉下以50μl的体积滴鼻。为了确定病毒在呼吸道中的复制，在接种后第2、4或6天处死每组的三只小鼠。取下肺部并在3 ml磷酸盐缓冲盐水中均质。用Vero细胞滴定法测定每只小鼠匀浆中的病毒数量。病毒滴度表示为每毫升组织提取物中PFU的数量。（A） PKR中的标题^+/+老鼠。（B） PKR中的标题^−/−老鼠。指出了平均值的标准误差。

delNS1病毒感染wt小鼠不会引起体重减轻或疾病症状，如皮毛起皱。相反，在感染delNS1病毒的PKR中观察到大约30%的体重减轻^−/−小鼠感染后6天（图。​（图3）。三). 相应地，所有PKR^−/−小鼠死于delNS1病毒感染，而PKR^+/+小鼠在这种病毒的攻击下存活下来。这些结果反映了小鼠肺部的复制数据，并证实了PKR在病毒致病性中的重要性。

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图3

PKR的体重^+/+和PKR^−/−感染了delNS1流感病毒的小鼠。按照图的图例所述进行感染。​图3。三每组由四只小鼠组成。指出了平均值的标准误差。

为了获得关于PKR介导途径在干扰素诱导的流感病毒抗病毒反应中的作用的信息，我们比较了PKR基因敲除小鼠和STAT1基因敲除鼠肺组织中的病毒滴度(5). STAT1对于任何IFN介导的信号都是必需的，包括PKR基因的转录激活。在STAT1敲除模型中，感染后第3天的平均病毒滴度为4.9±0.3 log₁₀delNS1病毒的PFU/ml(n个=3）和6.3±0.3 log₁₀PR8病毒的PFU/ml(n个= 3). 在wt小鼠中，PR8滴度为5.0±0.1 log₁₀感染delNS1病毒后，未发现感染颗粒（数据未显示）。数据表明，delNS1病毒复制达到与PKR中获得的水平相似的水平^−/−击倒老鼠。这表明PKR是我们系统中IFN途径中对抗流感病毒的主要抗病毒效应物。然而，wt PR8病毒水平在STAT1中大约高出1个对数单位^−/−小鼠比PKR中的小鼠^−/−这表明其他IFN激活的基因也可能在抗病毒宿主反应中发挥作用。由于IFN诱导的2′-5′寡腺苷酸合成酶mRNA在流感病毒感染的肺细胞中被诱导(30)，RNase L可能是一个可能的候选者。最近描述的三缺陷RNase L、PKR和Mx基因敲除小鼠和细胞(37)应该有助于解决这个问题。还应注意，C57BL/6小鼠不表达功能性Mx，这是另一种IFN诱导的抗病毒基因(32)，这被证明是一种非常有效的抗病毒防御。因此，尽管我们的数据表明PKR具有抑制病毒复制的效力，但PKR在干扰素介导的途径中的唯一作用肯定无法假设。

另一个重要问题是细胞PKR抑制剂P58IPK在流感病毒致病性中的作用。尽管P58IPK在体外和培养细胞中过度表达抑制PKR的能力已经清楚地显示出来，但其在动物模型中的作用从未被测试过。我们在与P58IPK相关的PKR基因敲除模型中观察到的一种解释是，流感病毒招募P58IPK在流感病毒体内致病性中起次要作用，或者NS1蛋白负责招募P58IP K。delNS1病毒在PKR敲除模型中的复制特性也允许我们推测体外研究建立的其他NS1蛋白相关功能的体内相关性，如抑制宿主mRNA多腺苷酸化、mRNA核输出和mRNA剪接(9,20,27,28,22). 自PKR以来^−/−小鼠缺乏NS1相关功能并不影响小鼠肺部的复制能力，似乎这些功能不太可能在流感病毒体内复制中发挥主要作用。或者，赋予NS1的功能可能是多余的，并且可以被其他病毒或细胞蛋白取代。

在呼肠孤病毒感染期间，PKR在细胞抗病毒防御策略中的中心作用也被证明。2-AP对PKR的抑制导致病毒在细胞系中生长，否则不允许呼肠孤病毒复制。有趣的是，当呼肠孤病毒的蛋白ras（拉斯维加斯）信号通路，如EGFR、v-erbB（欧洲广播公司）,社会服务体系、和ras（拉斯维加斯）在细胞系中过度表达(33). 这一发现可以用激活的ras（拉斯维加斯）诱导PKR抑制剂(26). 呼肠孤病毒作为一种在致癌中特异复制的溶瘤病毒的潜力ras（拉斯维加斯）-在小鼠肿瘤模型中可以确认阳性肿瘤细胞(4). 由于delNS1病毒在PKR依赖性生长方面具有与呼肠孤病毒相似的表型，因此delNS1可能也是一种溶瘤病毒，可以特异性地根除表达致癌基因的肿瘤ras（拉斯维加斯）。测试该假设的实验正在进行中。

鸣谢

参考文献