EB2蛋白通过Crm-1非依赖性途径输出未剪接RNA

摘要

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）是一种在成年人群中广泛传播的人类γ-疱疹病毒。该病毒与多种恶性肿瘤有关，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、霍奇金病、胃癌、乳腺癌以及B和T细胞淋巴瘤，并在体外诱导静止B淋巴细胞的永久增殖（永生化）。在体内EBV相关肿瘤以及体外增殖的EBV感染的B细胞中，进入生产周期是一个罕见的事件，EBV基因组的转录通常仅限于定义病毒周期潜伏状态的几个基因（有关综述，请参阅参考文献25和36). 尽管在从潜伏期转换到生产周期期间发生的分子事件现在已经部分了解了体外永生化B细胞(42)，在裂解周期中表达的许多EBV基因产物的功能仅得到部分表征，而对某些其他基因产物的了解甚少。其中，早期核蛋白EB2(7)，也称为M或SM(8)最初被描述为一种混杂转录因子，因为它激活了氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因在许多不同启动子控制下的瞬时表达(26). 我们最近报道，EB2可以激活未分裂RNA的细胞质积累，特别是当它们是拼接体组装的不良底物时，这表明EB2对剪接或RNA输出或两者都有影响(4). 最近一份使用异核体分析的报告显示，EB2和它的单纯疱疹病毒1型（HSV-1）同源物ICP27一样，具有RNA输出蛋白的特性，即核-细胞质穿梭和RNA结合活性，尽管到目前为止还没有在EB2靶RNA上鉴定出特定的反应性RNA序列(38,39). 这让人联想到慢病毒Rev蛋白，该蛋白在与内含子mRNA结合后，介导内含子病毒mRNA的活性核输出顺式-RNA上的作用序列称为Rev反应元件（RRE）（有关综述，请参阅参考文献34). RNA的反向依赖性核输出至少需要人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）蛋白的两个结构域：一个高度碱性的N末端结构域，也指定核仁定位和一个短的C末端富含亮氨酸的核输出信号（NES）。在许多其他病毒和细胞蛋白质中也发现了类似的富含亮氨酸的NES（有关综述，请参阅参考文献17). 这些NES可转移到异源蛋白质，Rev NES中的突变会损害RNA的Rev穿梭和Rev依赖性输出(12,27,46). 此外，现在有充分的证据表明，Rev的核输出是由一种复杂的三分子相互作用介导的，涉及NES、重要蛋白β样蛋白Crm-1（也称为exportin 1）和ranGTP，一种处于GTP结合状态的小GTP酶(13). 对Crm-1在这一过程中作用的解释来自沃尔夫及其同事的实验(47)表明抗生素钩端霉素B（LMB），据报道与Crm-1特异性相互作用，是Rev核输出的有效抑制剂。然而，Crm-1依赖途径并不是唯一的，也存在其他对LMB不敏感的出口途径。事实上，不属于富含亮氨酸的NES家族的NES现在被描述为不同的蛋白质，如TAP(1)，hnRNPK(30)，hnRNPA1(29)和HuR(10).

最近发表的一项研究表明，EBV蛋白EB2包含一个富含亮氨酸的区域（LRR），该区域可能符合富含亮氨酸NES的共识(39). 随后有报道称，EB2介导的无内含子RNA的输出和EB2的细胞内定位可能通过与Crm-1的直接关联介导(三). 我们目前的观察得出了不同的结论。在本报告中，我们使用了一种最初设计用于评估Rev在输出内含子RNA中的作用的功能分析。在这个Rev对照分析中，EB2有效地刺激了内含子RNA的核输出。我们的结果清楚地表明，在使用LMB使Crm-1依赖途径失活从而抑制Rev介导的内含子RNA输出的条件下，EB2介导的含内含子RNA的输出不受影响。此外，虽然在EB2中已鉴定出富含亮氨酸的NES样序列，但我们通过定点突变和结构域交换表明，该结构域不需要用于无内含子和含内含子RNA的核输出，因此不是富含亮氨酸NES的结构域。最后，在细胞融合实验中，我们报告了EB2核质穿梭对LMB具有抗性。因此，我们的结果表明，疱疹病毒蛋白EB2通过与慢病毒Rev蛋白不同的机制参与RNA的核输出。

材料和方法

质粒。

质粒pCAT。在巨细胞病毒启动子的控制下，RRE表达一个双外显子、单内含子前体RNA，其中CAT基因和RRE位于内含子内（见图。​图1A）。1A） ●●●●。pCAT公司。通过亚克隆pDM128进行RRE(20)Bgl公司2-Xba公司I片段进入pAAC质粒，通过线性化巴姆HI和Xba公司我(4). pCAT公司。XRE类似于pCAT。除了它包含人类T细胞白血病病毒1型XRE序列而不是RRE.pAAC。CAT表达带有Flag表位标记的CAT蛋白（IBI Flag系统；伊士曼柯达）。pSG5标志。EB2和pSG5标志。通过连接巴姆HI（高）-克拉I片段（对应EB2氨基酸17至481）和Xba公司我-克拉pAACFlag的I片段（对应于EB2氨基酸185至481）。EB2型(4)分别放入pSG5Flag(11). pAAC标签。EB2L/A和pSG5标志。EB2L/A编码一个EB2突变体，其中234和236位的亮氨酸被改变为丙氨酸。pAAC标签。EB2L/A是通过参考文献中发表的PCR突变构建的19，使用引物CTGGCCTCT通用条款行政协调会通用条款GAGCCCATCCAGACCCG和CGGGTCTGGATGCTCGGC公司GGT公司GGC公司阿加加格。PCR-扩增片段通过阿帕我和速度I并连接到质粒pAAC中阿帕我和速度I.pAAC标签。M1是来源于pAACFlag的对照质粒。EB2通过在BMLF1 AUG下游插入两个终止密码子(4). 用双杂交酵母相互作用陷阱分离的DNA片段编码Nup214（氨基酸1754至2090）的N末端截短版本，克隆到pSG5Flag中以生成pSG5Flag。Δcan(11). 质粒pSG5标记。版本和pSG5标志。前面已经描述了分别表达Rev和Rev突变体M10标记版本的M10(11). 在pSG5Flag中。RevEB2，Rev NES区域的DNA序列编码（氨基酸73至83）已被Semmes及其同事识别的编码EB2 LRR（氨基酸226至236）的合成DNA片段所取代(39). 该片段是通过将脱氧寡核苷酸TGAGGTCACCTCTGCCCAGCCCCCCTGGCCTCTCTCGACT和TCTAGAGTCAGAGGCAGCGCGCTGGCAGCAGGGGGAGGGCAGGG杂交产生的，并将该双链DNA片段克隆到质粒pSG5Flag中。Rev消化Esp公司我和Xba公司一、。

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图1

由Rev和EB2蛋白介导的内含子RNA的细胞质积累。（A） 报告质粒pCAT的示意图。RRE和本试验中使用的蛋白质。显示了EB2的Arg/X/Pro重复基序（RXP）和LRR。旗帜。EB2Center是一种EB2突变体，其N末端区域被删除。给出了野生型Rev NES的序列以及M10突变版本的序列。所有蛋白质都标记有Flag肽。（B） 用报告质粒pCAT转染HeLa细胞。RRE或pCAT。XRE和表达Rev和EB2蛋白的质粒。转染48小时后，用CAT-ELISA测定细胞裂解物中CAT蛋白的积累。CAT蛋白的相对表达量以EB2获得量的百分比表示。（C） 使用化学发光ECL检测系统通过Western blotting评估这些实验中EB2和Rev蛋白的表达。使用分子动力学的ImageQuant软件在放射自显影胶片上评估蛋白质的相对含量。这些值以任意单位给出，如下所示：43（车道2）、38（车道3）、106（车道4）、73（车道5）、35（车道7）、28（车道8）、82（车道9）和62（车道10）。（D） 通过RT-PCR分析来自同一转染实验的细胞质RNA，监测Rev和EB2介导的CAT RNA细胞质积累。细胞β-肌动蛋白mRNA用作内部对照。为了获得更多定量结果，使用不同的扩增条件（20和25个周期）进行每个PCR。

质粒pUCβΔ128SV由Adrian Krainer善意提供。简言之，质粒pUCβΔ128SV包含在猴病毒40早期启动子控制下克隆的人类β-珠蛋白基因的地中海贫血等位基因。在这个结构中，第一内含子位置1处的鸟嘌呤突变为腺嘌呤，揭开了三个隐藏的5′剪接位点(4). 利用对BRRF1的Flag编码序列和部分N末端进行编码的引物GCCCCGGATCACAC CATGGACAAGGACGGACAGCTAGTAGTAACAGAGG和补充BRRF1 cDNA 3′端的引物GCCCGAATTCAGGTAAGAG，通过PCR生成Flag-BRRF1表达载体（pRcCMV-Na）。PCR-扩增产物通过巴姆HI和生态RI并克隆到质粒pRc-CMV（Invitrogen）中。

结果

EB2中的LRR不是富含亮氨酸的NES。

已经证明EB2能够诱导pCAT表达的内含子RNA的细胞质积累。RRE，我们决定利用这个Rev-controlled系统来研究EB2介导的RNA核输出机制。在最近的一份出版物中，Semmes及其同事使用异核体分析报告，EB2能够在细胞核和细胞质之间穿梭(39). 此外，他们还指出，与各种富含亮氨酸的NES表现出强烈同源性的LRR可能指定EB2核出口（图。​（图2A）。2A） ●●●●。Rev蛋白的广泛突变表明，将NES的三种亮氨酸（L78、L81和L83）中的任何一种改变为丙氨酸都会导致活性完全丧失(27). 为了测试假定的NES对EB2功能是否重要，我们生成了一个突变体EB2L/a，其中最后两个亮氨酸（L234和L236）被改变为丙氨酸（图。​（图2A）。2A） ●●●●。如果LRR确实是EB2 NES，则该突变应完全消除EB2对CAT mRNA输出的影响。另一方面，如果LRR包括EB2 NES，它应该能够在Rev蛋白的背景下替代Rev NES。因此，我们还构建了一个名为Rev/EB2的Rev突变体，用包含LRR的EB2氨基酸225至237替换Rev-NES（图。​（图2A）。2A） ●●●●。对这些突变体进行了转染报告质粒pCAT的能力测试。RRE公司。如图所示。​图2B，2B、 Rev有效地增加了未分裂RNA的核输出（图。​（图2B，2B、 比较通道1和2），但RevM10 NES突变体（通道3）和Rev/EB2杂交蛋白（通道4）未能做到这一点，表明EB2 LRR无法替代Rev NES。使用相同的分析，我们表明EB2（第6道）和LRR突变体EB2L/A（第7道）都有效地输出了未分裂RNA。另一个Rev/EB2突变体包含EB2 LRR的扩展版本（氨基酸221-240），同样未能激活我们的报告基因（数据未显示）。如Western blotting所示（图。​（图2B，2B、 下图），表达的蛋白质量验证了CAT实验得出的结果。然而，EB2可能通过不同的机制激活基因表达，这取决于底物RNA；因此，EB2L/A突变体在一个系统中完全活跃，在另一个系统则不活跃。为了验证这一假设，我们使用另外两种EB2报告基因结构pUCβΔ128SV和pRcCMV-Na比较了EB2和LRR突变体的作用(4). pUCβΔ128SV包含人类β-珠蛋白基因的地中海贫血等位基因（图。​（图2C）。2C） ●●●●。β-地中海贫血基因在第一内含子（IVS1）的位置1处包含一个G-to-a转换，这导致三个隐蔽的5′剪接位点激活，否则在野生型前体RNA中完全沉默（图。​（图2C）。2C） ●●●●。在HeLa细胞中瞬时转染质粒pUCβΔ128SV后，RT-PCR分析显示使用了三个隐蔽的5′剪接位点（图。​（图2D，2D、 车道1）。EB2和EB2L/A突变体（图。​（图2D，2D、 通道2和3）强烈增加了未分裂β-地中海贫血RNA的细胞质积累，并减少了先前报道的剪接RNA的数量(4). 我们还使用了一种称为pRcCMV-Na的构建物，从中可以表达自然发生的无内含子BRRF1 EBV早期RNA。如图所示。​图2D，2D、 RT-PCR可在转染细胞的细胞质中检测到无内含子BRRF1 RNA。EB2的共表达导致BRRF1 RNA的细胞质积累增加，并且这种作用显然不受EB2-LRR突变的影响（图。​（图2D，2D、 车道6）。总之，我们的结果强烈表明EB2亮氨酸234和236不参与EB2功能，并表明LRR不是富含亮氨酸的NES。

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图2

EB2 LRR不是真正的富含亮氨酸的NES。（A） EB2和Rev突变体的示意图。在旗帜中。EB2L/A、EB2亮氨酸234和236改为丙氨酸。在旗帜中。Rev/EB2，如图所示，Rev NES被EB2 LRR取代。（B） 在pCAT转染的HeLa细胞裂解物中检测CAT蛋白的表达。如图所示，RRE和编码Rev和EB2蛋白的质粒。这些值以Flag检测到的CAT蛋白量的百分比表示。EB2。使用抗标记抗体通过Western blotting评估EB2和Rev蛋白的表达。（C） pRcCMV-Na和pUCβΔ128SV质粒的报告基因和这些载体表达的RNA的示意图。通过RT-PCR分析用于量化这些转录物的寡核苷酸用箭头表示。（D） 旗帜活动。EB2和Flag。通过对质粒pRcCMV-Na和pUCβΔ128SV表达的BRRF-1和β地中海贫血RNA进行半定量RT-PCR分析，评估EB2L/A突变体。当采用不同的循环次数进行PCR时，获得了相同的结果（未显示数据）。

EB2相关的未片断RNA核输出对LMB具有耐药性。

在证明EB2 LRR不是NES后，我们接下来询问EB2蛋白中是否存在另一种不同于共识的富含亮氨酸的NES。富含亮氨酸的NES存在于多种蛋白质中。已知它们通过与名为Crm-1的重要蛋白β样蛋白以ranGTP依赖性方式直接相互作用发挥作用。已知真菌代谢物LMB专门针对Crm-1并阻断其与ranGTP和NES的相互作用。这反过来又会抑制蛋白质核输出(13,16). 为了测试EB2介导的内含子RNA的核输出是否依赖于Crm-1输出因子，使用质粒pCAT瞬时转染HeLa细胞。重复RRE和Rev或EB2表达载体。转染后12小时，洗涤细胞并在没有10nM LMB或有10nM LMB的情况下再孵育6小时。之所以选择6小时的孵育时间，是因为（i）当时LMB对Rev激活的影响很强，（ii）我们注意到16小时的孵化时间导致EB2和Rev蛋白表达量的显著减少（数据未显示）。正如预期的那样，当LMB添加到培养基中时，CAT表达的Rev激活显著降低（图。​（图3B，三B、 比较车道1、2和3）。然而，LMB似乎对EB2活性只有轻微影响（图。​（图3B，三B、 比较车道6和7）。RevM10也有这种轻微影响（图。​（图3B，三B、 车道4和5）和带EB2Center（图。​（图3B，三B、 通道8和9），在RNA输出中不活跃。如蛋白质印迹所示（图。​（图3C），三C） ，本实验中表达的蛋白质量不受LMB的影响。因此，EB2似乎通过Crm-1非依赖机制诱导无内含子RNA的核输出。

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图3

LMB不影响EB2相关的未片断RNA的核输出。（A）LMB实验的示意图。用磷酸钙法转染HeLa细胞。在转染后12小时，用新鲜培养基清洗细胞，在指示时补充20 nM LMB，并再培养6小时。此时，制备细胞提取物，并使用CAT ELISA滴定CAT蛋白。（B） 转染pCAT的HeLa细胞中CAT蛋白的相对表达量。如图所示，RRE和表达Rev和EB2蛋白的质粒。LMB治疗由加号表示。（C）在同一转染实验中，使用抗Flag抗体通过Western blotting检测Rev和EB2蛋白。

LMB不抑制EB2核质穿梭。

以前已经发表过，虽然EB2主要定位于核质，但它在细胞核和细胞质之间不断穿梭(39). 为了证实和扩展这些观察结果，我们评估了EB2核质穿梭是否对LMB敏感。用表达EB2和Rev的质粒转染HeLa细胞，然后通过聚乙二醇法融合到小鼠NIH 3T3细胞。如图所示。​图4A，4A、 在HeLa/NIH 3T3异核体中，经过30分钟的潜伏期后，在小鼠细胞核中检测到EB2（图A）。融合后2小时，EB2在小鼠和人类细胞核（c组）之间达到平衡，Rev（e组）也是如此，表明两种蛋白质都在穿梭。如前所述(47)，反向穿梭被LMB强烈抑制（图。​（图4A，4A、 面板f）。然而，我们没有注意到LMB对EB2在小鼠细胞核（面板b和d）中重新定位的能力有任何影响，这表明EB2的核输出是Crm-1独立的。作为对照，我们还观察了融合细胞中内源性人类hnRNPC蛋白的定位。正如预期的那样，携带核滞留信号的hnRNPC在0.5或2小时的孵育时间后被发现局限于HeLa核，如使用人类特异性抗hnRNPC抗体的间接免疫荧光所示（图a’、c’、b’和d’）。在异核体分析中还测试了EB2L/A突变体的穿梭。在表达EB2L/A的NIH 3T3细胞和HeLa细胞之间进行细胞融合。如图所示。​图4B4B（面板h），EB2L/A在小鼠和人类细胞核之间穿梭，类似于野生型EB2。

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图4

LMB和LRR突变对种间异核体EB2穿梭的影响。用编码Rev，Flag的质粒转染HeLa细胞。EB2和Flag。EB2L/A突变体。必要时，在含有环己酰亚胺（100μg/ml）和LMB（25 nM）的培养基中，将HeLa细胞与NIH 3T3细胞融合。0.5至2 h后，固定细胞，并用抗EB2多克隆抗体（a、b、c、d、g和h）和抗hnRNPC（a'、b'、c'、d'、g'和h'）或抗Rev（e和f）单克隆抗体进行免疫荧光。最后用Hoechst 33258（e'、f'、g“和h”）和荧光素异硫氰酸标记的抗兔抗体（a、b、c、d、g和h）、荧光素异硫氰酸标签的抗小鼠抗体（e和f）或德克萨斯州红标记的抗鼠抗体（a'、b'、c'、d'、g'和h'）对细胞进行染色。

此外，我们注意到这两个标志。版本（图。​（图5a）5a） 和标志。EB2核心蛋白（图。​（图5d）5d） 定位于转染细胞的细胞核和细胞质中。尽管我们目前无法解释其亚细胞定位的原因，Flag。EB2Center似乎是评估EB2穿梭对Crm-1依赖性的有用工具。的确，Flag。EB2Center包含Semmes和同事确定的LRR(39)和标志。Rev含有功能丰富的亮氨酸NES。然后我们推断，如果EB2穿梭是由Crm-1和LRR之间的直接相互作用介导的，那么LMB治疗将完全重新定位Flag。EB2靠近细胞核。然而，如图。​图5，5在细胞培养基中添加不同浓度的LMB不会影响EB2Cuter蛋白的细胞内分布（图。​（图5e5e和f），而Flag。经LMB处理后发现Rev仅为核（图。​（图5b5b和c）。这些结果进一步加强了我们的发现，即EB2 LRR不是Crm-1依赖的富含亮氨酸的NES。

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图5

LMB不会将EB2Center重新定位到细胞核。用表达Flag的质粒转染HeLa细胞。版本和标志。EB2过滤器。转染后24小时，用10nM（b和e）或25nM（c和f）LMB处理细胞3小时，或不处理（a和d）。旗帜。版本和标志。用抗Flag单克隆抗体通过免疫荧光进行EB2Cter定位。在LMB处理（b和c）后，Rev完全重新定位到细胞核，而EB2Center定位不受高浓度LMB（e和f）的影响。

Δcan是Nup214的反显性阴性突变体，抑制EB2的输出途径。

蛋白质和RNA的核输出通过核孔复合物发生，这是一种由约100种称为核通道蛋白的蛋白质组成的125MDa的巨大大分子结构。其中一种，Nup214/can，发现于包括Crm-1在内的多蛋白复合物中(14). Nup214最近与Crm-1依赖途径以及其他核质转运途径有关(13,24,45). 因此，我们决定测试Nup214是否与EB2核出口直接相关。Δcan是一个包含苯丙氨酸甘氨酸重复序列（FG repeat）丰富区域的Nup214 C末端片段，以前曾被描述为具有跨显性阴性表型并抑制CAT中的Rev功能。RRE系统(2,23). 然而，当RRE被TAP结合序列（CTE）取代时，TAP也诱导含CAT-CTE内含子RNA的细胞质积累，但Δ的过度表达在该分析中没有影响(2,23). 一个类似的Δcan突变体在我们的CAT中过度表达。RRE报告系统，以确定它是否会影响EB2介导的RNA输出。正如预期的那样，Δ可以有效地将Rev活性抑制到控制水平的10%至20%左右（图。​（图6A，6A、 车道3和4）。同样，Δcan表达导致EB2反式激活的显著抑制，表明Nup214可能参与EB2的输出途径（图。​（图6A，6A、 车道6和7）。CAT抑制。Δcan的RRE RNA核输出并不是由于对mRNA输出的一般影响，因为（i）Δcan过度表达对基本CAT报告质粒pAAC-CAT表达的CAT只有轻微影响（图。​（图6A，6A、 通道9和10），以及（ii）内源性β-actin mRNA表达似乎对Δcan过度表达不敏感，如使用不同扩增条件的RT-PCR分析所示（图。​（图6B）。6B） ●●●●。因此，这些观察结果表明Nup214参与EBV蛋白EB2的核输出。

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图6

Nup214/can反显性阴性突变体的过度表达会损害EB2介导的未分裂RNA的核输出。（a）HeLa细胞被报告质粒pCAT转染。RRE或pAAC。CAT和表达Flag的质粒。EB2或Flag。如有指示，进行修订。为了评估Nup214/can在EB2介导的输出过程中的作用，转染组合中包括表达Δcan（Nup214/can的转显性阴性突变）的质粒数量的增加（通道3、6和9中0.5μg或通道4、7和10中1μg）。转染12小时后，用CAT-ELISA测定HeLa细胞中CAT蛋白的表达。这些值以Flag检测到的CAT蛋白量的百分比表示。EB2（车道1至7）和pAAC。仅限CAT（8至10车道）。（B） 实验通过对内源性细胞β-actin mRNA进行RT-PCR分析进行控制。为了获得更多定量结果，每个PCR都使用不同的扩增条件（20和25个周期）进行。

讨论

这里报道的实验清楚地表明，HIV-1 Rev和EBV EB2蛋白能有效地诱导内含子RNA的核输出tat/转速内含子，出现在CAT中。由于3′剪接位点的信号不理想，RRE RNA被无效去除(43). 因此，正如最近记录的那样(4)，我们的数据证实，当内含子RNA是拼接体组装的不良底物时，EB2有能力诱导内含子RNA的细胞质积累。最近，发现EB2在细胞核和细胞质之间穿梭（参考文献39和本工作），并在蛋白质一级序列中鉴定出与Rev NES高度同源的富含亮氨酸的区域。因此，很容易提出RNA的EB2核输出与Rev类似，依赖于Crm-1途径(39,40). 为了解决这个问题，我们重点研究了EB2 LRR，并研究了EB2及其靶RNA核输出中对Crm-1蛋白的需求。由于Rev蛋白作为阳性对照，从pDM128衍生的CAT RRE报告基因被发现是研究EB2依赖性核输出的一个有价值的模型。我们的数据表明：（i）EB2假定富含亮氨酸的NES本身不是NES，因为它可以在不影响EB2功能的情况下发生突变，并且不能在Rev蛋白的背景下替代Rev NES；（ii）在Rev激活显著降低的情况下，EB2转录激活不受LMB（Crm-1特异性抑制剂）的影响；（iii）种间异核体分析显示的EB2核质穿梭也对LMB不敏感。我们的结果似乎与Boyle及其同事最近发表的结果大不相同(三). 他们报告，通过对淋巴母细胞B细胞（BJAB）进行瞬时表达分析，（i）LMB抑制无内含CAT报告基因的EB2激活，Crm-1过度表达增强EB2激活；（ii）EB2 LRR的完全缺失导致反式激活减少80%，而EB2 LRR中亮氨酸的点突变仅使激活减少40%；和（iii）在共免疫沉淀实验中，可以用Crm-1拖拽EB2。根据之前对富含亮氨酸的NES的研究，我们认为如果EB2 LRR(₂₂₇L（左）PSP公司L（左）AS公司L（左）T型L（左）₂₃₆)如果是EB2-NES，它应该通过将亮氨酸234和236突变为丙氨酸而完全失活，例如p53(44)，公钥基础设施(46)、FMRP(15)，IκBα(22)、和版次(27). 然而，我们发现这些亮氨酸的突变并没有显著影响EB2反式激活，这表明这些残基对功能不是必需的。此外，尽管Boyle等人报告称，LRR（突变体LRR-Δ）的完全缺失将EB2活化降低到野生型EB2水平的20%左右，但他们也表明突变体LRR-Δ不溶于1%Triton®声波风廓线仪，这表明与核结构密切相关。我们之前描述过一种类似的EB2缺失突变体，称为Δ7，缺乏LRR。我们发现突变体Δ7在不同的反式激活分析中不起作用(4)与LRR-Δ类似，将其定位于大型核点（数据未显示）。我们相信Δ7突变体以及我们的大多数C末端缺失突变体是一种非功能性激活物(4)可能是因为它没有正确折叠并在核内聚集，从而产生这些大型核亚结构，这也可以通过可见光显微镜观察到（数据未显示）。因此，LRR-Δ突变体没有完全活性也就不足为奇了。如果EB2含有一种以上的NES，一种依赖于Crm-1，在B淋巴细胞和HeLa细胞中均有效，另一种不依赖Crm-1且仅在HeLa淋巴细胞中有效，那么我们的结果与Boyle及其同事获得的结果之间的显著差异也可以部分解释。我们也不能排除LRR通过Crm-1独立机制参与EB2核出口的可能性。

与Boyle和同事达成一致(三)，我们表明Nup214的一个负转显性突变体，称为Δcan，是EB2的有效抑制剂反式激活。这一结果表明Nup214是EB2出口途径的重要组成部分。最后的观察结果与我们的观察结果并不矛盾，即Crm-1不参与EB2核出口，因为Nup214被提议参与不同的出口和进口途径(13,24,45). 例如，细胞TAP蛋白已被确定为D型逆转录病毒CTE RNA的输出因子(18). 尽管TAP功能对LMB不敏感，但它在体外和酵母细胞中都与Nup214结合(23,24). 总之，我们的结果支持EB2的核输出机制与Rev途径不同，但也涉及Nup214。EB2 NES和EB2出口路径现在需要仔细识别和描述。

EBV EB2蛋白影响信使核糖核酸核输出的能力并不是唯一的。其他疱疹病毒表达EB2样因子，即HSV-1 ICP27、人类疱疹病毒8 ORF57、疱疹病毒saimiri ORF57和牛疱疹病毒4 HORF1/2等，它们在转录后起促进早期和裂解病毒基因表达的作用。尽管这些因素已被证明能激活CAT报告基因，但其作用机制以及在病毒发病机制中的作用仍不清楚。对于HSV-1，研究表明HSV-1 ICP27缺失突变体不能复制其DNA，并且不能在Vero细胞中生长(41). 通过使用温度敏感突变体，发现ICP27可以同时激活病毒无内含子基因并抑制内含子基因。此外，现在有充分的证据表明ICP27是一种穿梭蛋白，可激活无内含子mRNA的核输出(32,33,38,41). ICP27的输出是由位于蛋白质N末端的LRR介导的，但ICP27输出受体尚未被鉴定(38). EB2蛋白在某种程度上是不同的，因为在我们手中，它不抑制内含子基因的表达，而是激活含有内含子的聚腺苷酸RNA的核输出，该RNA具有次优剪接位点（参考文献4和本工程）。然而，这两种蛋白质的作用机制可能并没有如此不同。事实上，剪接被认为是大多数mRNA核输出的先决条件。因此，含有内含子的RNA通常不存在于细胞质中，很少RNA，包括组蛋白、c-jun、α-干扰素和乙型肝炎病毒RNA，不含内含子。然而，这些特殊的RNA被输出到细胞质，对于组蛋白H2a和HSV-1胸苷激酶，已经确定了诱导这些无内含子转录物有效细胞质积累的RNA序列(21,31). 因此，病毒无内含子RNA的低表达可能是由于存在隐秘的剪接位点导致剪接因子的非生产性组装。在缺乏RNA转运元件的情况下，如组蛋白H2a和HSV-1胸苷激酶RNA中的转运元件(21,31)，无内含子RNA将保留在细胞核中并最终降解。有趣的是，用于研究EB2功能的细菌CAT基因中存在这样一个隐秘的5′剪接位点(4,39). 类似地，含有内含子的转录本的次优剪接位点保留在细胞核中，直到完全剪接。EB2和ICP27蛋白将有效地与这些核捕获的RNA相互作用，并促进它们向细胞质的输出，从而与剪接体组装竞争。在这方面，这里提供的数据与EBV生物学相关，因为对于HSV-1，大多数EBV早期和晚期mRNA是由无内含子基因合成的，而基因表达在潜伏港内含子期间。此外，在生产周期中，一些内含子RNA似乎积聚在感染细胞的细胞质中(5,28). 我们认为，与Rev和TAP类似，EB2是一个核输出因子，促进无内含子RNA和具有次优剪接位点的内含子RNA的细胞质积累。

EB2与其靶RNA的相互作用问题也需要解决。虽然EB2效应的程度取决于RNA模板，但到目前为止，还没有在RNA靶点上识别出特定的EB2相互作用序列，ICP27也是如此。包括我们在内的不同小组已经报道了重组EB2与各种RNA探针的体外结合(4,37,39). 然而，通过西北大学的分析，我们注意到，RNA不与全长EB2相互作用，而是与C-末端截短的EB2蛋白物种相互作用（数据未显示）。我们发现这种相互作用在体外由RXP区域介导，但令人惊讶的是，我们还证明了该结构域在体内是不必要的，因为它可以被删除而不影响EB2介导的核RNA输出(4). 因此，我们很容易推测EB2不会在体内直接结合RNA，而是通过适配器蛋白与目标RNA相互作用，适配器蛋白可能是hnRNP、SR蛋白，甚至是基本剪接机制的组成部分。这可以解释为什么许多不同的mRNA对EB2敏感，包括CAT转录物，但也对细胞RNA敏感，因为据报道EB2蛋白通过一种机制诱导啮齿动物成纤维细胞的转化，这种机制涉及到过度表达myc公司原癌基因(9).

现在需要进一步的工作来精确定位EB2蛋白的功能域，并确定直接参与EB2穿梭和EB2介导的RNA输出的细胞蛋白。

致谢

参考文献